鲎试剂灵敏度复核计算公式
细菌内毒素测定技术—鲎试剂灵敏度复核和方法验证试验
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
二、鲎试剂灵敏度的复核 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素 检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
知识点：干扰试验
一、干扰试验 是为了确定供试品在多大的稀释倍数或 浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产 品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品 的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对 照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。
编号
内毒素浓度
被加入内毒素的溶液 平行管数
A
无
供试品溶液
至少2
标准曲线的中点（或附近点
B
）的浓度（设为λm）
C
至少3个浓度 （最低一点设定为λ）
供试品溶液 检查用水
至少2 每一浓度至少2
D
无
检查用水
至少2
A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液。B 为加入了标准曲线中点或 靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供 试品溶液。C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备 标准曲线的标准内毒素溶液。D 为阴性对照。
浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的 鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检 验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
正文规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。
适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。
质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。
USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。
反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。
一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。
细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
正文无热原玻璃瓶规格：25ml。
无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。
试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。
试验操作过程应避免微生物的污染。
三、内毒素溶液配制细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。
注射用水内毒素检验方法验证方案
注射用水细菌内毒素检验方法验证方案1.0目的该方案确认制定的注射用水细菌内毒素检验方法适用于本公司微生物实验室对注射用水细菌内毒素的检验，方法能够提供一致、可信和准确的细菌内毒素检验结果。
2.0范围该方案适用于公司注射用水细菌内毒素检验方法的验证。
3.0名词定义BET：细菌内毒素测试(Bacterial Endotoxins Test)EU：内毒素单位，1EU=1IUλ：鲎试剂标示灵敏度MVD：最大有效稀释倍数4.0描述4.1验证方法：中国药典<1143>细菌内毒素检查法；4.2验证用注射用水：取注射用水检测点的新鲜注射用水；5.0接受标准注射用水细菌内毒素限度标准：＜0.25EU/ml6.0验证内容6.1验证前的准备：6.1.1验证器具准备➢将内毒素反应试管及取样三角瓶放入铬酸洗液中充分浸泡，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用纯化水反复冲洗，晾干后放入不锈钢方盘或用锡箔纸包好后再放入不锈钢方盘内，置于干热灭菌烘箱。
➢将干热灭菌烘箱温度设定为250℃，灭菌时间设定为1h，开启灭菌程序，灭菌程序结束待灭菌烘箱温度降至室温。
6.1.2主要仪器设备/试剂、对照品：设备：细菌内毒素检测仪、干热灭菌烘箱、医药冷藏箱试剂、对照品：细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水、鲎试剂细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中阳性及供试品阳性溶液的制备、鲎试剂灵敏度复核试验。
细菌内毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。
6.2验证过程：6.2.1鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
实验室在使用一批新的鲎试剂进行细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。
6.2.1.1 内毒素标准溶液的制备：取内毒素工作标准品一支，加入1ml 内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min 。
凝胶法检查技术
=0.210EU/ml 即本批号鲎试剂的复核灵敏度（λc）为0.210EU/ml 结论：本批鲎试剂的灵敏度标示值符合规定。
25
何时需做这个试验呢？
1或2会、、内影使试毒响用验素检新条标验批件准结号有品果的任的鲎何改试可变剂能
数据处理： 灵敏度测定值λc=antilg（ΣX/n） X：为反应终点浓度的对数值（lg） 鲎试剂灵敏度标示值λ有效：2λ≥λ c≥0.5λ
15
反应终点浓度是系 列浓度递减的内毒 素浓度中最后一个 呈阳性结果的浓度
灵敏度复核试验举例
• 试剂
试剂名称
厂家
规格
标示效价
数量
鲎试剂
安度斯
0.1ml/支 (1.25ml/支)
鲎试剂的选 择
加样及反应
反应溶液的 制备
MVD的计 算
结果判断
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(五）干扰试验
• 干扰试验通常分为两个阶段：
干扰初筛试验-初步筛选出供试品无干扰浓度
范围和鲎试剂灵敏度范围；-非药典要求！
干扰试验
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(五）干扰试验
• 经常接到用户的咨询电话，样品日常检查需要 选择什么灵敏度的鲎试剂来检测？例如：
• 结果判断
试验有效条件：溶液D：（- -）；溶液C：（+ +）； 无抑制干扰：溶液A：（- -）；溶液B：（+ +）
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举例：苦参素原料药干扰初筛试验
• （1）供试品限值
– 企业内控标准：＜0.2EU/mg
40
（2）试剂
试剂名称
厂家
规格
标示效价 数量
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
细菌内毒素检验操作程序
目的：规范细菌内毒素检验操作程序。
范围：适用于细菌内毒素检查操作。
责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。
内容 1准备工作 实验设备及用具1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml 、5ml ）、药匙、250℃烘烤1小时。
1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。
1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管 内毒素标准品与实验试剂1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。
1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜mL灭菌注射用水）。
1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
75%乙醇、铬酸洗液。
实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟。
恒温水浴箱内水浴温度调节到37±1℃。
2鲎试剂灵敏度复核根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ= EU/ml ），细菌内毒素工作标准品加入1ml 细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。
将工作标准品制备成2λ、λ、λ、λ四个浓度（ EU/ml 、 EU/ml 、 EU/ml 、 EU/ml ）例：工作标准品为160 EU/ml 时注意：每稀释一步均应在混合器上混匀30秒。
取18支 EU/ml鲎试剂，每支中加入水，然后分别加入中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最后2支加入水作阴性对照。
将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟。
放入水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。
再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。
保温结束后将试管轻轻取出，缓缓转到180°，若关内形成凝胶，不变形、不从管壁滑落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性。
鲎试剂灵敏度复核记录
NO.
鲎试剂/B司
鲎试剂批号
鲎试剂标示灵敏度
BET水批号
工作标准品效价
工作标准品批号
测试依据
《中国药典》2010版（二部）
细菌内毒素工作标准品稀释方法及步骤如下：
λ（鲎试剂标示灵敏度）=
组别
组序
2λ
λ
0．5λ
0．25λ
阴性对照
①
②
③
——
④
——
结果计算：
鲎试剂灵敏度测定值λC=antilg(ΣX/4)
式中： X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
测试结果：λC=
结论：□符合□不符合《中国药典》2010版（二部）规定。
备注：“√”表“适用此项”。
测试人
复核人
日期
日期
4.细菌内毒素检测的相关验证
*1适用于终点法； *2适用于动态法
10 湛江安度斯生物有限公司
产品验证（干扰试验）
产品验证（干扰试验）
目的： 验证在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应没有干扰作用。
无论哪种检测方法，干扰试验通常分为两个阶段： 1. 干扰初筛试验 初步筛选出供试品无干扰浓度范围；
4 湛江安度斯生物有限公司
实验室、人员、试剂、用具的验证
凝胶法
• 鲎试剂灵敏度复核试验 • 方法：根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌
内毒素工作标准品…制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶 液…每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入等体积细菌内毒素检查用水 作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃ 的恒温器中，保温60分钟±2分钟。 • 结果的获取：将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝 胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；若未形成凝胶或形成的凝胶 不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动， 造成假阴性结果。
5 湛江安度斯生物有限公司
凝胶法灵敏度复核试验
平行管
1 2 3 4
溶液C（内毒素标准品）
溶液D
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
阴性对照
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
• 试验有效性：当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管 均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
• 按公式λc=antilg（ΣX/n）计算反应终点浓度的几何平均值。 λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒 素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
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0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.5 0.25
-0.60205999
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-0.60205999 -0.30103
-0.52680249
-0.60205999
0.250 0.297
-1.22184875
0.060
供试品限度 （EU/ML)
试验管编号
反应终点浓 度（EU/ML)
反应终点浓 度对数值
反应终点浓 反应终点浓 度对数值算 度几何平均
术平均值 值（Eu/ml）
0.5
第1组 第2组
0.24 0.12
-0.61978876 -0.92081875
-0.77030376
0.170
项目名称
鲎试剂标示 灵敏度
（EU/ML)
试验管编号
反应终点浓 度（EU/ML)
反应终点浓 度对数值
反应终点浓 度对数值算
术平均值
测得鲎试剂 灵敏度
（Eu/ml）
内毒素标准溶液（灵敏度 复核）
0.125
含供试品的内毒素溶液 （正式干扰试验）
/
第1组 第2组 第3组 第4组 第1组 第2组 第3组 第4组
结果判定 符合规定 结果判定 符合规定
结果判定 符合规定 符合规定
项目名称 内毒素标准溶液 供试液稀释倍数
1
凝胶法半定量测定结果
鲎试剂标示 灵敏度
（EU/ML)
试验管编号
反应终点浓 终点浓 度对数值算
术平均值
测得鲎试剂 灵敏度
（Eu/ml）
0.03
第1组 第2组
0.06 0.06
-1.22184875 -1.22184875