葡萄籽原花青素液相检测方法
四种原花青素含量测定方法比较
四种原花青素含量测定方法比较一、本文概述原花青素（Procyanidins）是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物，因其强大的抗氧化和生物活性，近年来在营养学、食品科学、医药学等领域受到了广泛关注。
其中，四种主要的原花青素——儿茶素（Catechin）、表儿茶素（Epicatechin）、没食子儿茶素（Gallocatechin）和表没食子儿茶素（Epigallocatechin）的含量测定对于评估食品营养价值、研究药物作用机制以及监控产品质量具有重要意义。
本文旨在比较和分析目前常用的四种原花青素含量测定方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、紫外可见分光光度法（UV-Vis）、荧光光谱法（Fluorometry）和质谱法（MS），以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考。
通过比较这些方法的准确性、灵敏度、操作简便性以及成本效益等方面的优劣，我们期望能为科研人员和企业选择最适合的原花青素含量测定方法提供指导。
二、方法概述原花青素（Procyanidins）是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物，具有强效的抗氧化性能，对多种疾病具有预防和治疗作用。
由于其生物活性的重要性，对原花青素含量的准确测定显得尤为重要。
目前，常用的原花青素含量测定方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、紫外可见分光光度法、薄层色谱法（TLC）和毛细管电泳法（CE）。
这些方法各有优缺点，适用于不同的样品类型和实验条件。
高效液相色谱法（HPLC）具有高分辨率、高灵敏度、高重现性等优点，可以同时分离和测定多种原花青素。
但是，该方法需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，且样品处理过程繁琐，分析时间较长。
紫外可见分光光度法是一种简便、快速的测定方法，适用于大量样品的初步筛选。
然而，该方法只能测定总原花青素的含量，无法区分不同种类的原花青素，且易受样品中其他色素的干扰。
薄层色谱法（TLC）是一种基于原花青素在薄层板上的分离和显色进行测定的方法。
液相色谱-质谱分析葡萄籽提取物中原花青素
液相色谱-质谱分析葡萄籽提取物中原花青素
苏叶萍;杜平;金建秀;许巧霞;刘洪海
【期刊名称】《医药导报》
【年(卷),期】2010(29)11
【摘要】目的采用快速高分离度液相色谱-串联质谱(RRLC-MSMS)法分析葡萄籽提取物中原花青素的化学成分.方法葡萄籽提取液经HPD400A大孔吸附树脂纯化后,采用RRLC-MSMS法分离,并根据质谱信息分析其化学成分.结果分离检测出葡萄籽提取物中原花青素的3种单体,初步分离鉴定出9种二聚体、5种三聚体和1种四聚体.结论采用RRLC-MSMS法可以较好地分离、分析葡萄籽提取物中原花青素的主要成分.
【总页数】3页(P1479-1481)
【作者】苏叶萍;杜平;金建秀;许巧霞;刘洪海
【作者单位】石河子大学药学院,832002;新疆中基天然植物纯化高新技术研究院,乌鲁木齐,830088;新疆中基天然植物纯化高新技术研究院,乌鲁木齐,830088;石河子大学药学院,832002;新疆中基天然植物纯化高新技术研究院,乌鲁木齐,830088【正文语种】中文
【中图分类】R286%R927.1
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葡萄籽原花青素液相检测方法
原花青素原花青素原花青素原花青素HPLC初步方案初步方案初步方案初步方案一．实验目的：分析样品原花青素纯度，了解其中杂质成分。
二．实验方案：1. 方案一：Waters 公司高效液相色谱，C18柱(4.6 ×250 mm) , 检测波长为280 nm，进样量10μL ,柱温为室温。
待测液均经0.45μm 孔径的滤膜过滤。
流动相及流速见下表(A —10 %乙酸,B —重蒸水)：2. 方案二：（间接法定量）（原理类似铁盐催化比色法）(1) 标准曲线：称取前花青素标准品10mg 溶于10ml甲醇中,吸取该溶液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5ml 置于10ml 容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。
各取1ml 测定。
(2) 试样测定: 将正丁醇与盐酸按95 ：5的体积比混合后,取出6.0ml 置于具塞锥瓶中,再加入0.2ml硫酸铁铵[NH4Fe(SO4) 2·12H2O]溶液（用浓度为2mol/L 盐酸配成2%(w/v)的溶液）和1.0ml 经0.45μm滤膜过滤的试样溶液,混匀,置沸水浴回流,精确加热40min后,立即置冰水中冷却,待进行高效液相色谱分析。
(3)液相色谱参考分析条件: 色谱柱Shimadzu Shim –pak CLC –ODS 4.6 ×150mm;柱温35 ℃;检测器:紫外检测器,检测波长525nm流动相: 水:甲醇:异丙醇:10 %甲酸= 73 :13 :6 :8 流速0.9ml/min。
注：该方法使用的水解方法与我们当前使用的铁盐催化水解原花青素方法稍有差异，哪种效果更好，可进行预实验加以比较。
3．方案三：（反相高效液相色谱）标样：原花青素标准品色谱柱：Hypersi ODS-2 ，150 × 4.6mm 5μm；流动相：A：0 . 2%(V/V) 乙酸；B：乙腈；流量：1ml /min；进样量：5μl;柱温：30℃；检测波长：280nm.洗脱梯度：以乙腈的百分比浓度表示(B液溶于A液)0 ～5 % ，10min；5%～20%，10～20min；20%～40%，20～40min；40%～50%，40～50min；50%～5%，45～50min；5%～0，50～60min。
葡萄籽提取物原花青素的高效液相色谱分离分析
葡萄籽提取物原花青素的高效液相色谱分离分析
黄宏南;黄健文
【期刊名称】《中华医学写作杂志》
【年(卷),期】2001(008)024
【摘要】葡萄籽提取物原花青素(Grape Seed Extract Proanthocyanidin，GSEP)是广泛存在于植物界的属于双黄酮衍生物的天然多酚化合物，实验证明，它是一种比VC、VE更强的自由基消除剂，具有极强的抗氧化特性，同时还具备保护心血管和预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、皮肤保健及美容、抗过敏及抗炎、改善视觉功能等作用。
目前在国外应用非常广泛。
是一种颇具开发前景的保健品。
【总页数】2页(P2794-2795)
【作者】黄宏南;黄健文
【作者单位】福建省卫生防疫站，350001;福建医科大学，350004
【正文语种】中文
【中图分类】R-331
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葡萄籽提取物中原花青素含量的最佳测定方法
葡萄籽提取物中原花青素含量的最佳测定方法葡萄籽提取物-原花青素被誉为“最强效的自由基清除剂”，其抗氧化能力是VC的20倍，VE的50倍。
也是唯一能透过血脑屏障的抗氧化剂，因此在促进皮肤新陈代谢，分解黑色素，以及提高机体免疫力，延缓衰老方面的应用极为广泛。
葡萄籽提取物由原花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸等多酚类物质组成的，由于原花青素的成分极其复杂，目前的研究实验中还无法提供原花青素的标准品，因此Bate-Smith 和Porter法只能测定葡萄籽提取物中原花青素的相对含量。
一、Bate-Smith法、Porter法测定葡萄籽原花青素含量西安源森生物实验室对Bate-Smith法和Porter法测定原花青素相对含量实验进行了研究：（一）Bate-Smith法测定葡萄籽原花青素含量【实验目的】由于目前没有原花青素的标准品，因此此方法测定的只是葡萄籽提取物中原花青素的相对值，其含量用原花青素指数(procyanidolic index)来表示。
【Bate-Smith法原理】原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花青素(图1)。
【实验步骤】称取适量的葡萄籽提取物(约15～40mg)用甲醇溶解，最后定溶于100ml。
从中取1ml样品溶液加到10ml比色管中，然后再加入6ml盐酸-正丁醇溶液(5/95,V/V)，在97℃±1下反应40min后，取出迅速冷却，在550nm处测定其吸光度，以甲醇代替提取物溶液作为空白。
原花青素指数=A×7.0/WW:样品质量(g)；A:吸光度【实验结果】由于用Bate-Smith法测得的葡萄籽提取物中原花青素指数一般在80～100之间，有时也可能大于100。
因此，目前很多植物提取物生产厂家使用原花青素指数来表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量，是不正确的。
（二）Porter法测定葡萄籽原花青素含量【实验概述】由于Bate-Smith法测定的结果重现性很差,并且原花青素在此条件下反应不是很彻底。
前花青素含量测定方法(UV)
编号:TCD0150 原花青素（Proanthocyanidin）含量测定方法
一、仪器与试剂
1．仪器：UV-2101 PC紫外-可见光分光光度计
2．试剂：2%NH4Fe(SO4)2·12H2O的2N盐酸水溶液：量取浓盐酸17mL，加水至100mL，加入2gNH4Fe(SO4)2·12H2O，振摇溶解，即得。
(两周内有效) 酸性正丁醇溶液：95mL正丁醇中加入5mL浓盐酸，混匀。
(当日使用)
二、溶液制备
1．样品溶液制备精密称取葡萄籽提取物样品约100mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解定容。
精密吸取2mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即为供试液。
精密吸取该供试液1mL于10mL具塞试管中，加入2% NH4Fe(SO4)2·12H2O 的2N盐酸水溶液0.2mL，酸性正丁醇溶液6mL，拧紧密封盖，摇匀，拧松密封盖。
置95℃水浴中加热反应60min，取出，在冰水浴中快速冷却，即得待测样品溶液。
2．标准品溶液制备以标准样品代替样品，按样品溶液制备方法，处理即得标准品溶液。
3．样品空白溶液制备以甲醇代替样品供试液，按样品溶液处理，即得空白溶液。
三、样品测定
打开仪器电源，预热20min，待仪器自检通过后，在546nm处以样品空白溶液作为空白，测定标准品溶液和样品溶液吸收度。
四、结果计算
A×Ws
C%= ×S
As×W
As、A：标准样品、样品吸收值
Ws、W：标准样品、样品称样量（mg）
S：标准样品含量（%）
注：所用器皿均需干燥处理。
除甲醇外，其余均需平行显色三份。
葡萄籽中分离提取原花青素的研究
葡萄籽中分离提取原花青素的研究花青素是一类多酚类化合物，其具有高效的清除自由基的功能，是一种新型、高效、低毒的天然抗氧化剂。
本实验通过浸提的方法从葡萄籽中提取原花青素，考察了不同溶剂、浸提时间、浸提温度、乙醇体积分数和料液比等单因素对浸提效果的影响，确定了最佳的单因素水平。
研究结果表明：本项目产品投资费用少，操作费用低，产品附加值高；原料为废物利用，变废为宝符合国家相关产业政策；几乎没有“三废”排放，使用的溶剂全部回收利用，废渣可以作为造纸或者饲料综合利用。
标签：花青素；葡萄籽；提取；正交实验1 概述原花青素是广泛存在于植物中的一类天然多酚类化合物，多以糖苷的形式存在，也称花色苷。
属于缩合鞣质或黄烷醇类。
最早而最丰富的花青素是从红葡萄渣中提取的葡萄皮红。
它于1879年在意大利上市。
由于原花青素的多种功效，由葡萄籽提取的原花青素已被我国卫生部批准为保健原料。
目前对原花青素的提取研究及保健作用研究已非常成熟。
已经将其应用到工业化产业，开发出多种原花青素的保健产品和化妆产品。
原花青素的产品已被广大消费者普遍接受。
2 葡萄籽中花青素的提取本实验通过浸提的方法从葡萄籽中提取原花青素，考察了不同溶剂、浸提时间、浸提温度、乙醇体积分数和料液比等单因素对浸提效果的影响，确定了最佳的单因素水平。
并通过设计正交实验，得出原花青素提取最佳工艺条件。
2.1 实验方法2.1.1 葡萄籽中原花青素的提取本实验采用甘肃紫轩酒业葡萄酒厂生产葡萄酒产生的葡萄籽下脚料作为本实验的原材料。
在生产葡萄酒压榨葡萄汁的糟粕和葡萄酒生产前和发酵后压榨的榨粕，所得的这些榨渣中，以换成干品计，约有50%的葡萄皮，45%的葡萄籽和少量的梗等，将该榨渣经粗选分离出葡萄籽，作为提取的原料。
所得的葡萄籽用粉碎机粉碎后，过20目筛，于磨口三角瓶中，经石油醚脱脂脱水份，得脱脂葡萄籽粉，用一浸提液在50℃的恒温水浴中回流浸提，离心后取上清液，反复提取若干次，最后洗涤残渣，将上清液和洗涤液合并，加入固体无水硫酸钠脱水，倾出上层溶液，在真空度为0.095MPa，温度为40℃的条件下真空浓缩，浓缩液冷却至室温，得到原花青素粗提液，干燥，制得粗提物。
葡萄籽原花青素含量检测方法
杭州尼诺生物科技有限公司葡萄籽原花青素一目的：建立葡萄籽原花青素含量测定法。
二仪器：紫外可见分光光度UV—UNIC7200。
三责任者：QC检验员。
四原理：原花青素在酸性条件下加热水解产生色素，产生色素的过程是定量反应。
通过检测水解产物的最大吸收波长下的吸光度对原花青素进行定量。
在吸光度0.2-0.7纳米范围内浓度和吸光度呈线性关系。
五试剂和对照品：甲醇（分析纯）正丁醇（分析纯）盐酸（分析纯）硫酸铁铵（分析纯）葡萄籽对照品（公司自制）六试剂配制及溶液配制：1 试剂配制：50%甲醇溶液：量取50毫升甲醇溶于50毫升纯化水中。
盐酸正丁醇溶液：量取5毫升盐酸溶于95毫升正丁醇，置阴凉处避光保存。
硫酸铁铵盐酸溶液：称取2克，NH4F e (SO4)212H2O溶于100毫升2摩尔/升的盐酸水溶液中。
2 溶液配制：对照品溶液：称取10毫克葡萄籽对照品，精密称定，用50%甲醇溶解并定容到100毫升容量瓶中。
供试品溶液：称取10毫克葡萄籽供试品，精密称定，用50%甲醇溶解并定容到100毫升容量瓶中。
七测定步骤：在一系列10毫升具塞硼硅酸玻璃刻度试管中，各加0.2毫升硫酸铁铵盐酸溶液，6毫升正丁醇盐酸溶液，再逐个加1毫升待测样品溶液，1毫升对照品溶液，1毫升甲醇（空白），记录试管体积V A。
加塞，振荡混匀。
于98。
C沸水浴中反应45分钟，取出试管于冰水中迅速冷却，记录试管的体积V B。
在546纳米处用紫外分光光度计检测相对于空白的吸光度。
八计算：此方法受环境因素影响，操作中用对照品来定量待测样，其计算公式如下：原花青素%=K×A1×M2×V1/（A2×M1×V2）式中：A1 为供试品吸收度A2 为对照液吸收度M1 为供试品称样量M2 为对照品称样量V1 为供试品最终体积V A-V BV2 为对照品液最终体积K 为对照品的含量。
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原花青素原花青素原花青素原花青素HPLC初步方案初步方案初步方案初步方案
一．实验目的：分析样品原花青素纯度，了解其中杂质成分。
二．实验方案：
1. 方案一：Waters 公司高效液相色谱，C18柱(4.6 ×250 mm) , 检测波长为280 nm，进样量10μL ,柱温为室温。
待测液均经0.45μm 孔径的滤膜过滤。
流动相及流速见下表(A —10 %乙酸,B —重蒸水)：
2. 方案二：（间接法定量）（原理类似铁盐催化比色法）
(1) 标准曲线：称取前花青素标准品10mg 溶于10ml甲醇中,吸取该溶液0、0.1、0.25、0.5、
1.0、1.5ml 置于10ml 容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。
各取1ml 测定。
(2) 试样测定: 将正丁醇与盐酸按95 ：5的体积比混合后,取出6.0ml 置于具塞锥瓶中,再加入0.2ml硫酸铁铵[NH4Fe(SO4) 2·12H2O]溶液（用浓度为2mol/L 盐酸配成2%(w/v)的溶液）和1.0ml 经0.45μm滤膜过滤的试样溶液,混匀,置沸水浴回流,精确加热40min后,立即置冰水中冷却,待进行高效液相色谱分析。
(3)液相色谱参考分析条件: 色谱柱Shimadzu Shim –pak CLC –ODS 4.6 ×150mm;柱温35 ℃;
检测器:紫外检测器,检测波长525nm
流动相: 水:甲醇:异丙醇:10 %甲酸= 73 :13 :6 :8 流速0.9ml/min。
注：该方法使用的水解方法与我们当前使用的铁盐催化水解原花青素方法稍有差异，哪种效果更好，可进行预实验加以比较。
3．方案三：（反相高效液相色谱）标样：原花青素标准品
色谱柱：Hypersi ODS-2 ，150 × 4.6mm 5μm；
流动相：A：0 . 2%(V/V) 乙酸；B：乙腈；
流量：1ml /min；
进样量：5μl;
柱温：30℃；
检测波长：280nm.
洗脱梯度：以乙腈的百分比浓度表示(B液溶于A液)
0 ～5 % ，10min；
5%～20%，10～20min；
20%～40%，20～40min；
40%～50%，40～50min；
50%～5%，45～50min；
5%～0，50～60min。
稳定液配制：取0.5g 抗坏血酸置于1L 容量瓶中，加约500mL 双蒸水，混合，溶解
抗坏血酸。
加入100mL 乙腈，用双蒸水稀释至刻度。
标准品溶液液的配制与稀释均使
用稳定液做溶剂。
通过对HPLC 流动相条件的改进，确定了适合检测葡萄籽超微粉提取液中的没食子
酸、儿茶素、表儿茶素单体的HPLC 流动相条件。
色谱条件:UV 检测器，波长280nm，流速1mL/min，上样量10µl，柱温30℃。
流动相：A，2%乙酸、9%乙腈水溶液；B，
乙腈。
梯度模式：0min →23min →45min →50min →70min，流动相 A 相应浓度梯度为
100% →100% →75% →75% →100%。
稳定液配制：取0.5g 抗坏血酸置于1L 容量瓶中，加约500mL 双蒸水，混合，溶解
抗坏血酸。
加入100mL 乙腈，用双蒸水稀释至刻度。
标准品溶液液的配制与稀释均使
用稳定液做溶剂。
葡萄籽原花青素液相色谱图1-抗坏血酸，2－儿茶素，3－表儿茶素
通过稳定液（主要成分为抗坏血酸）、没食子酸、儿茶素、表儿茶素单独进样确定它们的出峰顺序。
依次的保留时间为 3.29min，4.53min，12.27min，23.42min，
称取0.5g原花青素样品，到100ml容量瓶中！超声溶解，定容至刻度，用毛细管吸取一滴到薄层板上。