生化与分子生物学实验指导
生化与分子生物学实验指导-（)
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实验一 氨基酸纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。
二、实验原理
纸层析法(ｐａp ｅｒ c ｈro ｍａt ｏgr ａphy ）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法又称纸色谱法,是用滤纸为支持物,所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成,滤纸纤维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱,因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相,有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的,称上行法；由上向下移动的,称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点),进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf 值表示：
在一定条件下某
种物质的Ｒf 值是常数。Ｒf 值
的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成）不变,Rf 值是常数,故可根据Ｒf 值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R ｆ值相同或相近,此时如只用一种溶剂展层,就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度,再用另一溶剂展层,从而达到分离目的,这种方法称为双向纸层析法。氨基酸无色,可利用茚三酮显色反应,将氨基酸层析点显色作定性、定量用。所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生(亮)黄色物质。
三、药品器材
1器材
层析滤纸（新华1号)、喷雾器、剪刀、层析缸、毛细管、电吹风、刻度尺、铅笔。
R ｆ
=
原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离
2试剂
(1)氨基酸溶液:赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液(各组分浓度0．5％)。
(2)展层剂：
V[正丁醇（A．R.)］:Ｖ(80%甲酸):V（水）=15:3:2
(3)显色剂:
0．5g茚三酮溶于１00ｍＬ无水丙酮,贮存于棕色瓶中备用。
四、实验方法
1.滤纸准备:选用新华1号滤纸，裁成5cm×2０cｍ的长方形,在距纸一端２cm处用铅笔轻轻划一基线,在线上每隔１cm作一记号，标出4个原点。
2.点样：用毛细管将氨基酸样品分别点于原点（用量10~20uＬ），用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复2～3次,点子直径不能超过３mｍ。
3.展层:将点好样的滤纸放入装有展层剂的展层缸内盖展层缸进行展层，展层剂液面不能淹没原点基线,当溶剂上升至１5~20cm时,取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿线,把滤纸烘干。
4.显色:用喷雾器在滤纸上均匀喷上显色剂，用热风吹干，层析斑点即可显现。
5.结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状,并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离,计算各色斑的Rf 值，与标准氨基酸的Ｒf 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。
五、实验结果及分析
六、思考题
影响氨基酸Ｒf值的因素有哪些?
实验二甲醛滴定法测定氨基氮
一、实验目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。
二、实验原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
?
－NＨ3是弱酸,完全解离时PH为１１-12或更高,若用碱滴定－NH3所释放的Ｈ＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10,很难准确指示滴定终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合,生成羟甲基化合物,使上述平衡右移,促使－NＨ3释放H+，使溶液的酸度增加,滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH９．0左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸,从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液,则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度,随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时,表明水解作用已完全。
三、器材及试剂
1.实验器材
25ml锥形瓶;3mｌ微量滴定管;吸管；研钵。
2．实验试剂
(１)3０0ml 0.05moｌ/Ｌ标准甘氨酸溶液
准确称取３75mg 甘氨酸,溶解后定容至100ｍl。
（2)５00ml 0．02mｏl/L标准氢氧化钠溶液
(3)20mｌ酚酞指示剂
0.5％酚酞的5０％乙醇溶液。
(４）400ml中性甲醛溶液
在50ｍl３6－３７％分析纯甲醛溶液中加入１mｌ０.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
四、实验方法
1、取３个２5 ml的锥形瓶，编号。向１、2号瓶内各加入0.０5mol/L标准甘氨酸溶液2mｌ和水5ml，混匀。向３号瓶内加入7 ml水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂,混匀后各加2 ｍｌ甲醛溶液再混匀，分别用0．0２mｏｌ/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验两次,记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值,计算甘氨酸氨基氮的回收率。
2、取未知浓度的甘氨酸溶液2ml,依上述方法进行测定,平行做几份,取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。
五、结果处理
1.回收率计算：
甘氨酸氨基氮回收率%= 实际测得量
×100 加入理论量
公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度,再乘以14.008。
2.氨基氮计算:
氨基氮（毫克/毫升)= （V未－V对）×ＮNａOH×14．008
2
公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。Ｖ对为滴定对照液(3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NＮａOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。
六、思考题
为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—NH3+基上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？
实验三蒽酮比色定糖法
一．实验目的:
１．学习分光光度法的基本原理
2．学习对蔬菜和食品中糖含量进行测定的方法
二．实验原理
1．分光光度法基本原理:
溶液中的物质在光的照射激发下,产生对光的吸收效应，不同的物质具有各自选择性的吸收光谱，因此，当某单色光通过溶液时，能量会被吸收而减弱,光能量减弱的程度和物质浓度有一定比例关系，即符合于比色原理——比尔定律。
2.朗伯-比尔定律
Ａ＝ｌｇ(1/T）=Ｋbc
A：为吸光度,
T:为透射比,是透射光强度比上入射光强度
c:为吸光物质的浓度
b：为吸收层厚度
K：比例常数
３．物理意义
当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,起其吸光度A与吸光物质的浓度ｃ及吸收层厚度ｂ成正比。
4.蒽酮比色法
蒽铜比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色,在6２0nm处有最大吸收。蒽酮可与其他一些糖类发生反应,但显现的颜色不同。当样品中存有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于特定的糖类，反应较稳定。本法多用于测定糖原含量,亦可用于测定葡萄糖含量。
三.实验试剂
（1)蒽酮试剂:取0.２ｇ蒽酮溶于100ｍL 8０%(V/V）硫酸中,当日配制使用;
(２)标准葡萄糖溶液(0.1mg/ｍL)：(可滴加几滴甲苯作防腐剂);
（3）糖样品溶液。
四.实验步骤
1．制作标准曲线:
取干试管6支，依次加入标准糖溶液0，0．2，０.4,0．6，０.8,１．0 ml,并依次用蒸馏水补足体积到1mL,各管均加入蒽酮试剂4mＬ,沸水浴准确煮沸10min，室温放置10mｉn,用1号试管溶液调零，比色测定A620。用标准糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标,制作标准曲线。
管号?1＃2＃3#4#5#6#７#
标准葡
萄糖溶液(ml)０0.20.４0.60.8１．0
蒸馏水
(ml)
１．00.８０.60.４0.20
样品液／///／／ 1.0
2.样品含糖量测定:无蛋白糖溶液样品溶液
稀释100倍，吸取1mL 置试管中，再加入４mL 蒽酮试剂,沸水浴中煮沸10分钟，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量（ｍg/ml ）。
五、实验结果
1.制作标准曲线
2.计算样品中糖浓度
六、思考题
H ２S Ｏ4在实验中起什么作用？
酪蛋白的制备
一、实验目的
1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。
2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、实验原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为３5g ／Ｌ。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电
(ml)
置冰水浴中冷却5ｍin
蒽酮试
剂(m ｌ)
4.０
４．0
4.0
4.０
4．0
４.０
4.0
沸水浴中准确加热10min,取出,用自来水冷却，室温放置１0min A620nm
糖溶液浓度(mg/ｍｌ)
0 ０．０2 0.04 0．06 ０.08 0.１0 待测
点为4．7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、材料、试剂与仪器
１. 材料
新鲜牛奶
2.试剂
（1）．95％乙醇1200ｍL
（2）无水乙醚１200ｍＬ（3）0．2mol/L pH4．７醋酸—醋酸钠缓冲液300ｍl
先配A液与B液
Ａ液:0．2mol／L醋酸钠溶液称NaＡC·3H2O ５4.44g，定容至2０00ml。
B液：0.2mｏl/L醋酸溶液,称优纯醋酸(含量大于９9.8％）12.0g定容至1０00mｌ。
取Ａ液1770mｌ,Ｂ液１230mｌ混合即得Ｐh4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。
（4）乙醇—乙醚混合液乙醇：乙醚=1 ：１(V/Ｖ)
3.仪器
离心机、抽滤装置、精密pH试纸或酸度计、电炉、烧杯、温度计
四、操作步骤
1.酪蛋白的粗提
100ｍL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4．７的醋酸缓冲液100mL．用精密ｐH试纸或酸度计调ｐH至４．7。将上述悬浮液冷却至室温。离心1５分钟（3000 r/min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2.酪蛋白的纯化
（1）用水洗涤沉淀3次，离心10分钟(3000r/ｍin)，弃去上清液。
（2）在沉淀中加入30mＬ乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀２次，抽干。
（3）将沉淀摊开在表面上，风干;得酪蛋白纯品。
3.准确称重,计算含量和得率。
含量：酪蛋白ｇ/100 mＬ牛乳(ｇ%)
式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。
五、实验结果及分析
六、思考题
１、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么?
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量一、实验目的
1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法
2.熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色,最大光吸收峰在46５nm，当它与蛋白质结合形成复合物时,其最大吸收峰改变为５９5ｎｍ。考马斯亮蓝G－2５0—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内,5９５nｍ下光密度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明: １．要离心的离心管和管套要称重,重量不等时将水加在管套里。2．离心管的放置是对角线放置,要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间,定好时间后缓慢旋转转速旋钮,使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明: １.接通电源开关，预热20miｎ后，再选择须用的单色光波长。２.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿(溶液装入４／５高度，置第一格)置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值Ａ=0.０0。３.推动试样架拉手,使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。4．测量完毕,取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
三、试剂与器材：
1. 试剂:
（1)0.9％ＮaCl 9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取５０mg结晶牛血清蛋白定溶于５０ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝Ｇ－2５00.5g,溶于250mＬ95％乙醇,再加入50０mL８5％(W／V)磷酸,保存于棕色瓶中,称为母液。取1５0 ｍL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。
2.器材:
试管;吸管10ｍＬ、l5mL、lmL、0.1mL;７22分光光度计
四、操作方法
1.标准曲线的制备
取6支试管,按下表加入各试剂:
以各管相应标准蛋白质含量（mg ）为横坐标、Ａ5９5为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 待测样品测定
试管中加蛋白质样品1.０mL ,再加入5.0mL 考马斯亮蓝G-２50试剂，摇匀，放置5m ｉn 后，在５95nm 波长下吸光度值，记录A ５95。根据所测A5９５从标准曲线上查得蛋白质含量。并计算蛋白样品的浓度（mg/ml)。
五、实验结果及分析 六、思考题
蛋白质含量的测定还有哪些方法?其优缺点是什么?
影响酶促反应速度的因素
一、实验目的
通过本实验了解温度、PH 、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。 二、实验原理
唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。淀粉溶液与碘反应呈蓝色;糊精根据分子大小,与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色；麦芽糖不与碘呈色。唾液淀粉酶的活性受温
管号? 0 1 ２ 3 4 5 标准蛋白
溶液(m ｌ） 0 0．2
0.4 0.６ ０.8 １.０ ０．9%N ａC ｌ溶液(ml) １．0 ０．8 0.6 ０.4 0.２ ０ 待测样品
(ml) / ／
/ / ／ / 考马斯亮
蓝试剂(ｍl)
5．0 ５．0
5.0
５.0
5．０
5．0
摇匀，放置5min,测吸光度值
A595ｎm
度、酸碱度、抑制剂与激活剂等的影响。
温度：温度降低，酶促反应减弱或停止;温度升高，反应速度加快。当上升至某一温度时，酶促反应速度达最大值,此温度称为酶的最适温度。由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋白质构象的改变，因此如果温度继续升高，反应速度反而会迅速下降甚至完全丧失。
酸碱度:唾液淀粉酶最适pＨ为pH６．9,高于或低于酶的最适pH值,都将引起酶活性的降低,过酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。
抑制剂与激活剂：酶的活性常受某些物质的影响,能增加酶的活性称为酶的激活剂：降低酶活性且不使酶蛋白变性的称为酶的抑制剂。如Cl-为唾液淀粉酶的激活剂,Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。
根据上述性质,可以用碘检查淀粉是否水解及其水解程度,间接判断唾液淀粉酶是否存在及其
活性大小。
三、试剂及器材
1.试剂:
1%淀粉溶液,1％氯化钠溶液，1%硫酸铜溶液,1%硫酸钠溶液,碘液，磷酸氢二钠(0．2ｍmｏl/L）, 柠檬酸溶液(0.１mmol/L)。
２.器材:
试管,试管夹,恒温水浴锅(37℃),吸管，滴管,试管架。
四、实验操作：
１.收集唾液:实验者先将痰咳尽, 用自来水漱口，清除口腔内食物残渣, 再含蒸馏水约15 mL，作咀嚼咕漱运动， 3ｍin后吐入小烧杯中备用。
2.观察温度对酶促反应速度的影响
取试管３支,编号１,2,3，按下表操作:
试剂(ｍl) 1 ２ 3
错误!唾液 1 1 1
错误!1%淀粉 2 2 2
1００℃（冷却）37℃0℃
＼o＼ac(○,１)
错误!水浴5m
ｉn
碘液１滴（冷却) 1滴１滴
现象
3. 观察pH对酶促反应速度的影响
(1)配制一系列pＨ不等的缓冲液。
试剂（ml) 1 2 3
０.2mmｏl/Ｌ磷酸氢二
5.１5 7.７2 9.72
钠
0.1mmol／Ｌ柠檬酸 4.85 2．28 0.２8
ｐH 5.00 6.80 8.00
（2)取试管3支,编号１,２,３,按下表操作：
试剂(mｌ) 1 2 3
唾液２ 2 2
缓冲液3（pH5.0０）3（pＨ６.80) 3(pＨ8．00）1%淀粉２ 2 2
３7℃水浴10ｍiｎ
碘液１滴1滴1滴
现象
4观察激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响
取试管4支，编号１，2,3，4,按下表操作：
试剂滴 1 2 ３４
1%淀粉２０20 20 20
唾液10 １0 10 1０
蒸馏水 6 ———
1％氯化钠— 6 ——
1%硫酸铜—— 6 —
1%硫酸钠——— 6
3７℃水浴5—1０min
碘液１滴1滴１滴1滴
现象
五、实验结果及分析
六、思考题
影响酶促反应速度的因素有哪些？它们如何影响酶的活性?
实验七酶的活性及专一性测定
一、实验目的
通过本实验,了解酶的活性测定方法及其对底物催化的专一性。
二、实验原理
唾液淀粉酶能专一的催化淀粉水解,生成一系列水解产物，即糊精、麦芽糖、葡萄糖等。麦芽糖或葡萄糖都属于还原糖，能使班氏试剂中的二价铜离子还原成亚铜，并生成砖红色的氧化亚铜。淀粉酶不能催化蔗糖水解，且蔗糖本身不是还原糖,所以不能与班氏试剂作用呈色，以此证明酶催化底物的专一性。
三、器材及试剂
1.器材:试管、试管夹、样品杯、滴瓶、温度计、恒温水浴箱,冰箱等。
2. 试剂:
(1)0．５%淀粉溶液（含0.3%NaCl)：称取可溶性淀粉0．5ｇ,加５mｌ蒸馏水调成糊状，徐徐倒入８0mｌ煮沸的蒸馏水中，不断搅拌,待其溶解后，加0.3gＮaCl，加蒸馏水至１00ml。此液应新鲜配制，防止细菌污染。
（2）２%蔗糖溶液:称2g蔗糖，加蒸馏水至100ml溶解。
(3）班氏试剂:溶解结晶硫酸铜17.3g于100ml热的蒸馏水中,冷却后加水至１50ml为A 液。取柠檬酸钠1７3g和无水碳酸钠100g,加蒸馏水600ml ,加热溶解,冷却后加水至８50ml为B液。将A液缓慢倒入B液中,混合即可。
（4)稀释唾液:用清水漱口,清除食物残渣。再含蒸馏水15ml作咀嚼运动,2分钟后将稀释唾液收集于样品杯中备用。
（５)碘-碘化钾溶液：
四、实验方法
１. 唾液淀粉酶的活性测定
唾液的稀释:取1０支试管，分别编上号１－6，取１mｌ唾液加入1号试管,加水稀释10倍后从中取出１mｌ加入2号试管，依次梯度稀释。
试剂管号 1 2 3 4 ５ 6
唾液（ml） 1 1 １ 1 1 １
蒸馏水(ml) 9 9 9 ９9 9 各取上述稀释的唾液各１ml,分别加入相应编号的试管里，然后向6支试管内同时加入１ml的0.５％的淀粉溶液，振荡混匀后放入37 ℃恒温水浴中,10分钟后取出,滴加2滴碘液,振荡混匀，观察颜色,选取颜色变化适中的一支,记录稀释倍数,计算酶的活性,用于后续实验。
2.淀粉酶的专一性
取3个试管，分别编号，按下表操作,记录实验现象。
试管编号1＃２# 3＃
稀释的唾液淀粉酶
１１ 1
/mL
０．5%淀粉溶液/mL ３
2％蔗糖溶液/mL 3
蒸馏水/mＬ 3
摇匀，37℃保温15mｉn
Ｂeｎedicｔ试剂/mL 2 ２２
摇匀,沸水煮２分钟
观察记录结果
五、实验结果及分析
六思考题
每组中蒸馏水分别起什么作用？将酶煮沸10min，重复以上实验可能会有什么结果?
实验八维生素Ｃ的定量测定
一、目的要求
１．学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。
2. 了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。
二、实验原理
维生素Ｃ是具有L系糖型的不饱和多羟基物,属于水溶性维生素。它分布很广,植物的绿色部分及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等)中的含量更为丰富。维生素C具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能还原染料2,6－二氯酚靛酚(ＤCPＩＰ),本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中,2，6-二氯酚靛酚呈红色,还原后变为无色。因此,当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时,维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以,当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化,此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰,样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。
三．材料、器材及试剂
1．材料：新鲜青菜
2．器材:电子天平,酸式滴定管,移液管,容量瓶，量筒,锥形瓶，研钵。
3.试剂
（1)2%草酸溶液:草酸１g溶于1００ｍl蒸馏水中。
(2) ２, 6-二氯酚靛酚溶液: ２50mg 2，６-二氯酚靛酚溶于1５0ｍl含有5２mg NaHＣＯ３的热水中，冷却后加水稀释至2５0ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。
(3）标准抗坏血酸溶液（0.2ｍｇ/mｌ):准确称取20mg纯抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于2％草酸溶液中，并稀释至100mｌ，贮于棕色瓶中,冷藏,最好临用前配制。
四．操作步骤
1．样品的处理和提取
（1）取材:称取４.0g样品洗净、切碎。
（2)研磨：样品置研钵中,加少量2%草酸溶液研磨成汁液,用2％草酸溶液冲洗转移至5０ｍl离心管，３０00r/mｉn离心1５min,上清转移到５０mｌ容量瓶中,2%草酸溶液定容至５0ml。
２. 空白测定
取2%草酸10ｍl，放入5０ml三角瓶中，用2,６-二氯酚靛酚钠溶液滴定至三角瓶内溶液呈粉红色，15秒内不褪色为终点，记录所用滴定液体积,重复三次取平均值。
3.标定2,6-二氯酚靛酚钠溶液
取２mｌ标准抗坏血酸溶液加8ml 2%草酸溶液,置于５0mｌ三角瓶内,用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至终点，记录所消耗2,６-二氯酚靛酚钠溶液的量,重复三次取平均值。
4.样品的测定
取样品液１0ml，放入５0ｍl三角瓶中,立即用2，６－二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的粉红色并保持15秒内不褪色，记录所消耗滴定液的体积，重复三次取平均值。
五．实验结果及分析
Ｘ=（V1-V２)*K＊V*１０0/（W*V3） K＝０．2*2/(V０－V2）
其中Ｘ—1０0克样品所含维生素Ｃ毫克数（mｇ/１0０g)
Ｗ—称取样品重(g）
V0—标定染料时滴定标准维生素C所消耗的染料毫升数
V1—滴定样品所用染料毫升数
V２—滴定空白所用样品液毫升数
V3—样品测定时所用样品液毫升数
Ｖ—样品提取液稀释之总体积
Ｋ—1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数
六、思考题
本实验方法的优缺点有哪些?
实验九质粒DNA的提取与检测
一、实验目的
１、学习质粒ＤNA 的提取原理与琼脂糖凝胶电泳原理；
2、掌握质粒DＮA的提取方法;
３、掌握电泳检测DNA的方法。
二、实验原理
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从１-２０0kｂ不等,为双链、闭环的DNA 分子,以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋ＤNA 外,还会产生其它形式的质粒ＤNＡ。如果质粒DNＡ两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子，称开环DNＡ（OｐeｎcｉrｃulａｒDNA，简称oｃDNＡ);如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（LｉnearＤＮA）。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNＡ其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNＡ片段的标准方法。琼脂糖主要在ＤNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性ｐH 值下带负电荷的DＮＡ向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定: ＤNA的分子大小，琼脂糖浓度,DNA 分子的构象,电源电压，嵌入染料的存在及离子强度等。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型） 实验目的： 掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理： 层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。 薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材： 仪器和设备： 玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子） 试剂：
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
(完整版)分子生物学试题及答案(整理版)
分子生物学试题及答案 一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。 3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。 9．弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。 10．魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。 11．上游启动子元件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA 及增强子，弱化子等。 12．DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。13．SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。 14．单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 15．考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。16．蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。 17．顺式作用元件：在DNA中一段特殊的碱基序列，对基因的表达起到调控作用的基因元件。18．Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’→3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。 二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。 3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。 4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（DNA重组技术）三部分。7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，）、 （mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。 9．蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法）、（可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭）。 10．蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。 11．半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMP—CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP—CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（ S2）开始，无G时转录从（ S1）开
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
污水处理生化调试技术方案
污水处理生化调试技术方案 一污泥的培养 方法有同步与异步培养与接种,同步是培奍与驯化同时进行或交替进行，异步是先培后驯化，接种是利用类似污水的剩余污泥接种。 活性污泥可用糞便水经曝气培养而得，因为粪便污水中，细菌种类多，本身含有的营养丰富，细菌易于繁殖。?通常为了缩短培菌周期，我们会选择接种培养。?先说粪便水培菌?具体步骤:?将经过过滤的粪便水投入曝气池,再用生活污水或河水稀释，至BOD约为3００-400，进行连续曝气。这样过二,三天后,为补充微生物的营养物质和排除由微生物产生的代谢产物,应进行换水,换水根据操作情况分为间断和连续操作。?１.间断操作：?当第一次加料曝气并出现模糊的活性污泥绒絮后,就可停止曝气，使混合液静止沉淀，经1－１.５小时后排放上清液,把排放的上清液约占总体积的60-７0%。?然后再加生活污水和粪便水,这时的粪便水可视曝气池内的污泥量来调整,这样一直下去，直至ＳV达到30%。一般需2周，水温低时时间要延长。 在每次换水时，从停止曝气,沉淀到重新曝气的总时间要控制在２小时之内为宜?成熟的污泥应具有良好的混凝，沉降性能，污泥内有大量的菌胶菌和终生?纤毛类原生动物，如钟虫,等枝虫,盖纤虫等,并可使污水的生化需氧量去除率达90%左右 2.连续操作：?在第一次加料出现绒絮后,就不断地往曝气池投加生活污水或河水,添加粪便水的控制原则与间断投配相同。往曝气池的投加的水量,应保证池内的水量能每天更换一次,随着培奍的进展，逐渐加大水量使在培养后期达到每天更换二次。在曝气池出水进入二次沉淀池后不久(0．5-1）就开始回流污泥,污泥的回流量为曝气池进水量的5０%?驯化的方法：可在进水中逐渐增加被处理的污水的比例，或提高浓度,使生物逐渐适应新的环境开始时，被处理污水的加入量可用曝气池设计负荷的20-３0%，达到较好的处理效率后,再继续增加，每次以增加设计负荷的１0-20％为宜，每次增加负荷后，须等生物适应巩固后再继续增加，直至满负荷为止。?如果被处理工业污水中,缺氮和磷以及其它营养物时，可根据BOD：N：P为100:5:1的比例来调整。?个人认为在此阶段，必要的超赿管路要具备，工艺没设计的可用消防管代替。 而且各种分析要跟上去,和种参数需及时测定,特别是镜检,因为有经验的人可能通过镜检和数据就可以很好的完成任务,另外良好的心理素质也比较重要,有些现象要果断处理,有些则需等侍再认定上面是异步法,同步就是在污泥培养过程中，不断加入工业污水，使污泥在增长过程中逐渐适应工业污水的环境，这样虽可缩短培养和驯化的时间,但在这一过程中发生的问题，又缺实践经验则难以判断问题出在哪一个环节上。 若有条件,就是接种培养，这样可缩短时间，若是相似的污水的污泥,更可提高驯化效果。 二、试运行
分子生物学实验复习题附答案(最新整理)
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
2015高级生物化学及实验技术试题答案
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
《分子生物学检验技术》实验指导
《分子生物学检验技术》实验指导 【实验目的】 把握动物组织DNA提取的方法； 把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。 【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化D NA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。 【实验器材和试剂】 1、动物 小白鼠 2、设备 移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。 3、试剂 （1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存 （8）无水乙醇、70%乙醇 【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。 2、提取DNA （1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
生化制品技术实验指导
《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配
实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。 五、操作步骤
1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白 （1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。 （2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。 （3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 （1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 （2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。 （3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。 （4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。 （5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以0.1mlo/L 盐酸调整pH至3±0.1。 （6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
运动生物化学实验指导
运动生物化学实验指导 实验一实验基本技术操作 一、实验目的 （一）了解实验室规则及注意事项。 （二）学习运动生物化学实验常用仪器的使用及清洗方法。 （三）学习721型分光光度计的使用方法。 二、实验原理 运动生物化学是研究人体运动时体内的化学变化。运动生物化学的实验方法基本上是化学的方法，用定量及定性的分析方法来观察机体内物质代谢的规律，所以实验时必须做到定性的洁净及定量的精确，因此实验取样要准确、样品要无污染。 对于相同物质和相同波长的单色光来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。配制各种浓度的CuSO4溶液，然后在780nm波长下比色，测定各种浓度的CuSO4溶液吸光度值，并制作曲线图。 三、实验器材 试管、CuSO4溶液、蒸馏水、721分光光度计、移液管、吸耳球等。 四、实验步骤 （一）玻璃仪器的清洗。 （二）使用移液管的移液操作及721分光光度计的使用。 取4支大试管，编号，按表7-1进行操作： 表7-1 CuSO4溶液的测定 以CuSO4溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，将3种不同浓度的CuSO4溶液的光密度值分别点在坐标纸上，通过3点绘制成曲线图，并对实验结果进行分析。 五、注意事项 （一）玻璃仪器清洗后注意检查，管壁不能留有水珠。 （二）使用移液管吸取液体时一定要缓慢平稳，不要太快、太猛。 六、作业与思考 （一）玻璃仪器的清洗有哪些基本要求？ 实验二血红蛋白的测定 血红蛋白（Hb）是红细胞中的一种重要蛋白质，1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。 Hb的主要生理功能是运输氧气（O2）、二氧化碳（CO2）和对酸性物质（H+）起缓冲作用，参与体内的酸碱平衡调节。运动时机体需氧增加，故血红蛋白增加，有利于为组织提供氧气，促进物质的有氧代谢和带走CO2，而且也能起中和酸性的作用。如果血红蛋白下降，氧供应减少，影响运动能力。 运动员安静时血红蛋白值与正常人没有明显差异。一般人Hb的正常值男性为120-160g/L；女性110-150g/L。临床上常用判断贫血的标准，即成年男性低于120 g/L；成年女性低于110 g/L；而14岁以下的少年、儿童，不论男女，均以低于120 g/L作为贫血。