高效液相色谱法氨基酸标样的分析实验

一、目的要求

1、熟悉高效液相色谱仪的结构、分离原理和操作程序。

2、掌握氨基酸标样的分析方法、原理。

二、实验原理

氨基酸与PITC发生反应生成的衍生物，在254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法是柱前衍生法中的一种。

PITC方法的反应方程式如下图所示：

三、实验仪器和试剂

1、仪器：

高效液相色谱仪（带紫外检测系统和记录系统）。

2、材料：

氨基酸标样

3、试剂：

衍生液：

异硫氰酸苯酯：甲醇：三乙胺：水（V/V）=1：7：1：1

正己烷、乙腈、乙酸、乙酸钠

以上试剂中乙腈为色谱醇，水为二次蒸馏水，其它为分析醇。

四、实验步骤

1、柱前衍生步骤：

（1）将100ul衍生液加入100ul氨基酸标样或样品中，震荡使混合均匀，室温放置1小时。（2）反应液中加入200ul正己烷，充分震荡后放置使分层。

（3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45ul）过滤。

（4）取滤液5ul注入HPLC。

2、分离条件的设定

（1）色谱柱：Shim-pack VP-ODS 4.6mm x 15cm

保护柱：Shim-pack GVP-ODS4.6 mm x 1cm

（2）流动相：

A液：0.1M乙酸钠pH6.50（用乙酸调整，500ml乙酸钠中约加2滴乙酸）。

B液：乙腈/水=4/1

（3）流量：1ml/min

柱温：36℃

检测波长：254nm

（4）梯度洗脱程序：

TIME(min) FUNC VALUE

0．01 BCONC 10

3 BCONC 10

21 BCONC 39

21.01 BCONC 80

25 BCONC 80

25.01 BCONC 10

35 STOP STOP

3、数据采集打开real-time CS analysis软件采集数据并对数据进行分

五、实验数据及处理结果

六、实验讨论：

1、本次实验的注意事项有哪些？

结果：

①、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um 或更细的膜过滤)。

②、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

③、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

④、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

⑤、气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

⑥、如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

2、高效液相色谱仪的结构示意图：

七、思考题解答：

1、试述反相离子对色谱的分离机理。

答：①、固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

②、流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

③、基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；

a、阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H +

b、离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH-

2、试述本实验氨基酸分析的基本原理和方法，除了本方法外，还有那些氨基酸分析方法？答：①、离子色谱（IC）；

②、离子交换色谱法（IEC）。