pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介13.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第二章应用重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5血清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠乙二胺四/二硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸乙酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化乙锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎牛血清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白小时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野生型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒载体构建精品PPT课件
无，病毒基因组游 有，病毒基因组整 有
离于宿主基因组之 合到宿主基因组，
外，瞬时表达外源 长时间、稳定表达
基因
外源基因
高水平表达
中
中
快（1-2天）
慢（2-4天）
快（1-2天）
分裂和不分裂细胞 1012
分裂和不分裂细胞，分裂cell，但在干 适用于难转染细胞 细胞中表达效率低
109
109
不可以
TET-ON,TET-OFF
1
腺病毒
• 腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微 米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252 个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感 染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到 细胞核。
• 腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感 冒症状、呼吸系统不适等。
2
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
5
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全 部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
腺病毒载体AVV的作用
腺病毒载体AVV的作用
典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。
pCA13/的HCMV IE啟动子－多克隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源基因的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包装信号φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。
pBHG11因為缺失包装信号及E1区而不能复制，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能复制。
外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。
pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装產生腺病毒颗粒。
该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
模板：腺相关病毒载体
腺相关病毒载体腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AA V)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。
其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。
AA V 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。
腺相关病毒（adeno-associated virus，AA V）是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。
基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。
ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。
Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。
AA V 能感染多种细胞。
Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AA VS1位点。
这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。
重组腺相关病毒载体（rAA V）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
优点：以潜伏感染为主；AA V可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。
缺点：AA V载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。
在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。
AA V选择的条件1. 治疗基因的长度不能过大。
AA V的总容量4.7kb，还要包括AA V自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AA V载体对靶细胞具有较高的转导效率。
pAAV-hrGFP腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐hrGFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10048 pAAV-‐hrGFPpAAV-‐hrGFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hrGFP， pAAV h rGFP, p AAVhrGFP质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV载体大小: 5.3 k b3‘ 端测序引物: Beta-‐globin-‐F：ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC 5‘ 端测序引物: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hrGFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hrGFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM 操作手册目录第一章简介 1 3.2AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3第二章应用重组腺病毒的长处 2 第四章主要流程 4第三章 AdEasyTM 技术 3 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 43.1 技术概略 3缩写英文全称中文全称AdAdenovirus 腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB 培育基Ad5Adenovirusserotype5 血清 5 型腺病毒MCSMultipleCloningSite 多克隆位点AdVAdenoviralVector 腺病毒载体MinMinute 分钟AmpAmpicillin 氨苄青霉素MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) 感染复数β-Gal β-Galactosidase - 半β乳糖苷酶mRNAMessengerRNA 信使 RNAbpBasePair 碱基对MWCOMOIecularWeightCut-offBSABovineSerumAlbumin 小牛血清白蛋白PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis 聚丙烯凝胶电泳cDNAComplementaryDNA 互补 DNA PBSPhosphateBufferedSaline 磷酸盐缓冲液cccDNAClosedCircularCoiledDNA 闭环螺旋 DNA PFUPlaqueFormingUnit 空斑形成单位CPECytopathicEffect 细胞病理效应piPostInfection 感染后CsClCesiumChloride 氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus 增殖性腺病毒DMEMDulbecco’ sModifiedEagleMediumDMEM 培育基RITRRightInvertedTerminalRepeat 右边反向尾端重复DMSODimethylSulfoxide 二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate 十二烷基硫酸钠DTTDithiothreitol 二硫苏糖醇TBETrisBorate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid 乙二胺四乙酸乙酸EtBrEthidiumBromide 溴化乙锭TCID50TissueCultureInfectiousDose5050% 组织培育感染剂FBSFetalBovineSerum 胎牛血清量HrHour 小时TCPTotalCellularProtein 细胞总蛋白ITRInvertedTerminalRepeat 反向尾端重复TETris/EDTATE 溶液KanKanamycin 卡那霉素wtWildType 野生型kbKilobases 千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5- 溴KDaKiloDaltons 千道尔顿-4-氯 -3-吲哚 -β-D- 半乳糖苷第一章简介此刻基因输送技术的发展日益复杂，一些治疗药物（生长激素、扰乱素、抗病毒和抗癌复合物）和诊疗性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
通用腺病毒骨架载体pAdEasy-1产品说明书中文版主要用途
通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）产品说明书（中文版）主要用途通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）是一种与穿梭载体在特定细菌中同源重组构建产生重组腺病毒的改造型人腺病毒5型的主干基因分子。
适用于病毒感染性基因疗法的载体。
产品即到即用，性能稳定，重组保证。
技术背景pAdEasy-1腺病毒骨架载体含有人腺病毒5型的大部分基因组，去除E1和E3病毒基因，旨在提供外源性DNA 插入整合，同时避免病毒自我复制。
其中E1基因的剔除，使病毒在宿主细胞内失去DNA复制能力，而不能产生传染性病毒颗粒；E3基因的剔除，可以避开宿主的免疫反应。
pAdEasy-1为33.5kb，具有氨苄青霉素抗性，一旦与穿梭载体重组，其抗性消失。
同时具有内切酶Pac1和Cla1的位点。
产品内容载体液（Reagent A）（100纳克/微升）5微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备BJ5183：用于载体转化重组的宿主细胞实验提示1．通常1次转化用量为100纳克2．使用BJ5183进行转化后重组3．建议和线性穿梭载体（1微克）共转染4．建议使用电转为优先5．转化后细菌培养不宜在BJ5183里超过20小时6．转化后的阳性细菌菌落通常比正常菌落小三分之一注意事项1．本产品为5微升（500纳克）规格2．操作时，须戴手套3．严格无菌操作4．载体转化后的菌落越小，转染阳性可能性越高；BJ5183的转化效率通常较之其它细菌要高5．转染的载体越大，转化效率越低，载体拷贝数越低，菌落后续培养越慢；大于40kb的载体，其琼脂平板上的菌落阳性率至多为20％6．不能使用常规质粒抽提方法提取载体；建议使用煮沸法质粒/柯斯质粒DNA快速抽提试剂盒－HL60004，既适合大型质粒提取，又避免质粒切口产生7．使用Pac1（50单位）进行酶切鉴定，其电泳条带为30kb和3kb（或4.5kb）8．pAdEasy-1腺病毒骨架载体基本信息如下：9．本公司提供系列腺病毒试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定重组保证。
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pAAV-‐hSyn-‐RFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。
稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A 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