限制性核酸内切酶切割位点分析
限制性内切酶考点小结
限制性内切酶考点盘查限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。
1 限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
化学本质为蛋白质。
②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。
③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。
④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。
如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。
2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。
②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。
③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。
2.2 质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。
如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。
切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。
②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。
③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。
2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。
如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。
一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。
不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用
5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低
应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分） 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
酶切位点平末端
酶切位点平末端
酶切位点平末端指的是一种特定的DNA或RNA序列结构，其中两个不同的序列在同一个平面上相互平行且相对。
这种结构通常出现在DNA或RNA的限制性内切核酸酶的切割位点处，这些酶能够识别特定的序列并切割DNA或RNA分子。
在DNA或RNA分子中，酶切位点平末端的具体示例包括：
1.EcoRI酶切位点：EcoRI是一种限制性内切核酸酶，能够识别并切割DNA
分子中的GAATTC序列。
切割后产生的片段具有平末端。
2.BamHI酶切位点：BamHI是一种限制性内切核酸酶，能够识别并切割
DNA分子中的GGATCC序列。
切割后产生的片段同样具有平末端。
在生物实验中，酶切位点平末端的应用非常广泛。
例如，在构建基因克隆载体时，需要将目的基因与载体进行连接，通常需要在目的基因和载体之间进行限制性内切核酸酶的切割。
当使用平末端的限制性内切核酸酶进行切割时，可以获得两个平末端的DNA片段，通过连接这些片段可以实现目的基因与载体的连接。
总结来说，酶切位点平末端指的是一种特定的DNA或RNA序列结构，其中两个不同的序列在同一个平面上相互平行且相对。
这种结构通常出现在限制性内切核酸酶的切割位点处，这些酶能够识别特定的序列并切割DNA或RNA 分子。
在生物实验中，酶切位点平末端的应用非常广泛，例如在构建基因克隆载体时需要进行限制性内切核酸酶的切割和连接。
限制性内切酶小知识
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简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割 特异的双链DNA序列的一种内 切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分 裂DNA分子在一限定数目的专 一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
特征和种类
1．限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主 控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现 象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题 （表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 104 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。 而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限 制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的 修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲 基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。
3．限制酶切割的位置 限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的， 又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、 NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ （CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点 的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还 有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。 BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓； ↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓ ↑NNGTG（C）ACNN
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别
, 反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl
2
5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
实验五 DNA的限制性内切酶酶切反应(定稿)
实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。
Pvu I 的识别序列5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴＣＧ…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。
DNA的限制性酶切实验原理
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13
噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
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分析结果
◆ 分析方法2（举例） 利用在线分析工具NEBcutter进行分析
输入序列或注册号，或调取载体序列 ，选择酶和显示方式
显示结果
具体描述
其它分析限制性内切酶切割位点软件
Restriction Map and MCS of pEGFP-N1 Vector
◆ 分析方法1（举例） 在本地计算机上利用BioEdit工具进行分析
拷贝fasta格式的序列，在BioEdit分析工具的“File”栏 目选择“New from Clipboard”输入序列
选择被粘贴序列的名称，在“Sequence”栏目点击 “NucleicAcid→Restriction Map”
生物信息学
第八章 生物信息学其他应用
8.7 限制性核酸内切酶切割位点 分析
பைடு நூலகம்
分析限制性内切酶切割位点
◆ 展示DNA序列的酶切位点图 ❖ 分离克隆基因或特定的DNA片段 ❖ 分子标记，如CAPS（cleaved amplified polymorphism sequence）标记
◆ 可选择限制性内切酶
◆ EnzymeX /science/enzymex
◆ RestrictionMapper /
◆ DNAMAN /pc/pcmain_new.html