适配体筛选方法研究进展
靶向乳腺癌的核酸适配体应用研究进展
靶向乳腺癌的核酸适配体应用研究进展岳东芳;张迈鹤;徐兆超;赵海东【摘要】乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,实现乳腺癌的早期诊断和早期治疗意义重大.核酸适配体是经过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选得到的寡核苷酸序列,在肿瘤诊断及治疗方面拥有良好的应用前景.本文对靶向乳腺癌的核酸适配体及适配体作为载体和探针在乳腺癌诊疗中的作用进行综述.%Breast cancer is the most common malignant tumors in women around the world, which causes serious damage to women's health.Therefore, it has the great significance to achieve early diagnosis and treatment for breast cancer.Aptamers are oligonucleotide sequences screened for the systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) and have good application prospect in cancer diagnosis and treatment.In this paper, we review aptamers targeted breast cancer therapy to explore the role as a carrier or probe in the diagnosis of breast cancer and to provide a new perspective for breast cancer diagnosis and treatment.【期刊名称】《大连医科大学学报》【年(卷),期】2017(039)002【总页数】9页(P181-188,192)【关键词】乳腺癌;核酸适配体;指数富集配体系统进化技术;诊断【作者】岳东芳;张迈鹤;徐兆超;赵海东【作者单位】大连医科大学附属第二医院乳腺外科,辽宁大连 116027;中国科学院大连化学物理研究所生物技术研究部,辽宁大连 116023;大连医科大学,辽宁大连116044;中国科学院大连化学物理研究所生物技术研究部,辽宁大连 116023;大连医科大学附属第二医院乳腺外科,辽宁大连 116027【正文语种】中文【中图分类】R73-34乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，占所有癌症种类的22.9%[1]，也是导致女性癌症死亡的最主要原因，占所有女性癌症死亡患者的13.7%[2-3]。
筛选核酸适配体的技术
筛选核酸适配体的技术嘿，朋友们！今天咱就来聊聊筛选核酸适配体的技术。
这玩意儿可神奇啦，就像是在一个巨大的宝库中寻找那颗最闪亮的宝石。
你想想看，核酸适配体就像是一把专门为目标分子打造的钥匙，而且是超级精准的那种。
要找到这把钥匙可不容易，得有一套厉害的办法。
首先呢，有一种方法叫指数富集的配体系统进化技术，这名字听起来是不是很高大上？其实简单来说，就是让核酸分子们在那里竞争，看谁能和目标分子结合得最好。
就好像一场激烈的比赛，只有最强的才能胜出。
这过程可不简单，得经过一轮又一轮的筛选和进化，才能得到那最优秀的核酸适配体。
还有一种方法呢，是利用噬菌体展示技术。
这就好比是把核酸适配体放在一个大舞台上展示，让目标分子来挑选自己喜欢的。
那些被选中的核酸适配体就有机会留下来，继续发光发热。
筛选核酸适配体的过程就像是一场冒险，充满了未知和挑战。
有时候你可能觉得已经找到了那把钥匙，但再仔细一看，哎呀，好像还差那么一点点。
但别灰心呀，继续努力，说不定下一次就成功了呢！你说这技术是不是很神奇？它能在那么多的核酸分子中找到最合适的那一个，就像大海捞针一样，但又比那更难。
不过咱科学家们可不怕，他们有着无穷的智慧和耐心，一点一点地攻克难关。
你知道吗，这核酸适配体的用途可广泛了。
它可以用来检测疾病，就像一个小侦探，能快速准确地发现问题。
还可以用来治疗疾病呢，把那些坏家伙都给抓住。
咱想想看，如果没有这些先进的技术，那很多疾病的诊断和治疗该有多困难呀！所以说呀，筛选核酸适配体的技术真的是太重要了。
咱再回到这个技术本身，它就像是一个魔法盒子，打开之后里面充满了惊喜和可能。
每一次的实验，每一次的尝试，都有可能带来新的发现。
这就是科学的魅力呀，永远充满了未知和挑战，永远让人充满期待。
所以呀，朋友们，让我们一起为这些伟大的科学家们点赞，感谢他们为我们带来这么好的技术。
也让我们一起期待未来，看看这筛选核酸适配体的技术还能给我们带来哪些惊喜！这不就是科学的魅力所在吗？让我们一起拥抱它吧！。
适配体的应用及其在口腔领域的研究进展
适配体的应用及其在口腔领域的研究进展近年来，有关适配体在生物医学领域的研究迅速发展。
适配体是一种通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）在DNA或RNA 文库中筛选得到单链DNA或RNA，能够与小分子、蛋白质和细胞等靶标特异性结合。
疾病的早期诊断与治疗是治愈疾病的关键，然而某些疾病可能表现出非特异性症状，导致假阴性延误治疗时机，增加治疗失败的风险。
此外，个性化的精准治疗对疾病治疗至关重要。
由于具有高特异性、低免疫原性和低成本等特点，适配体已在药物递送、疾病的诊断和治疗等方面有了广泛的应用。
本文将就适配体的特点和其在口腔医学中的应用作一综述。
1.适配体的发展和特点1.1适配体的发现与筛选自20世纪80年代Cech等发现RNA具有催化作用以来，研究者们对核酸识别并作用于特定位点的功能探索也随之兴起。
1990年，Tuerk在研究T4噬菌体DNA聚合酶（gp43）与编码mRNA间的相互作用时发现，gp43在与该mRNA5'端一个8个核苷酸的发夹结构及Shine-Dalgarno序列结合时，可以抑制该mRNA转录的开始以进行自我调节。
为探究这一相互作用，Tuerk开发了SELEX技术，即通过构建一个随机的RNA文库，利用硝酸纤维素膜筛选出与gp43有亲和力的RNA序列，对其进行扩增并进行下一轮筛选，如此往复，最终获得2个能特异性结合gp43的RNA序列。
同年，Ellington等通过类似方法，开发出能与对应靶标特异性结合的核酸片段，并将这种片段命名为“aptamer（适配体）”。
适配体在与靶标结合时，会形成茎、环、发夹、突起、假结和G-四链体等结构，通过氢键、范德华力、碱基堆积力、静电作用和疏水相互作用等与靶标形成一个稳定的复合物结构。
随着技术进步，SELEX技术也不断得到革新和发展。
适配体 筛选 材料 新方法
适配体筛选材料新方法以适配体筛选材料新方法为标题，本文将介绍一种新的适配体筛选材料的方法。
这种方法可以提高筛选效率，减少材料浪费，并且可以应用于多种不同的适配体筛选领域。
我们需要了解适配体筛选材料的背景和重要性。
适配体是指具有特定结构和功能的分子，可以与特定的目标分子相互作用。
适配体筛选材料是一种利用适配体与目标分子之间的相互作用来筛选出具有特定功能的材料的方法。
适配体筛选材料在药物研发、催化剂设计、纳米材料制备等领域具有重要的应用价值。
传统的适配体筛选材料方法主要依赖实验室合成大量的材料，并通过试错的方法来筛选出具有特定功能的材料。
这种方法存在耗时、耗能、耗材的问题，并且筛选效率很低。
因此，研究人员一直在寻找一种更高效、更准确的适配体筛选材料方法。
近年来，随着计算机技术的发展和材料模拟方法的成熟，基于计算模拟的适配体筛选材料方法逐渐受到关注。
这种方法通过建立适配体与目标分子之间的相互作用模型，并利用计算机模拟方法来预测适配体与目标分子之间的相互作用能力。
然后，根据预测结果，选择具有潜在适配能力的材料进行实验验证。
与传统方法相比，基于计算模拟的适配体筛选材料方法具有以下优点：该方法可以节省大量的实验材料和实验时间。
通过计算机模拟，可以预测出具有潜在适配能力的材料，减少了实验室合成材料的数量和时间成本。
该方法可以提高筛选效率和准确性。
通过计算模拟，可以预测适配体与目标分子之间的相互作用能力，从而筛选出具有特定功能的材料。
这种预测结果可以指导实验设计，提高筛选效率和准确性。
基于计算模拟的适配体筛选材料方法还具有灵活性和可重复性。
通过调整计算模拟的参数和方法，可以适应不同的适配体筛选需求。
而且，该方法可以重复使用，可以在不同的适配体筛选项目中应用。
总结起来，基于计算模拟的适配体筛选材料方法是一种高效、准确、灵活和可重复的筛选方法。
该方法的应用可以提高适配体筛选材料的效率，减少材料浪费，并且可以应用于多种不同的适配体筛选领域。
核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展
核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展李亚楠;赵洁;张傲哲;谭琰;华茜;张子剑【摘要】Aptamers are single-stranded oligonucleotides that are screened by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)in vitro,which can selectively bind to different target with high affinity and high specificity,including protein,small molecules, organiccompound,metal ions,drugs,etc. This technology has attracted more attentions for its advantages and thus it has been applied widely in many aspects such as biological sensor,gene chip,new drug development,nano technology,etc. However,the traditional SELEX method is cumbersome,which usually takes several months to screen out the targetof nucleic acid in high specificity. With the rapid development of SELEX,many novel screening methods have emerged in recent years. The screening cycle and the screening efficiency are improved with these new methods,and the application of aptamers is expanded. This review introduces several new screening methods in recent three years, including multiple GO-SELEX,SWCNTs-assisted cell-SELEX,on-chip Cell-SELEX,Sequence-constructive SELEX and High-Fidelity (HI FI)SELEX,It is helpful for us to know more about the latest progress on the methods forin vitro screening aptamers and to promote the application of aptamers in various fields..%核酸适配体是用配体指数富集系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列,能够选择性的与不同的靶标特异性的结合,包括蛋白质、小分子、有机物、金属离子、药物等,具有高亲和力和高特异性.这项技术的诸多优势,使其迅速得到重视,核酸适配体在生物传感器、基因芯片、新药开发、纳米技术等诸多方面应用广泛.但是传统的SELEX方法操作繁琐,筛选周期长,需要几个月的时间才能筛选出与靶标具有高特异性的核酸适配体.随着SELEX的快速发展,近年来出现了很多新型的筛选方法,这些新的方法大大提高了筛选周期,极大的提高了筛选效率,拓展了核酸适配体的应用.总结介绍了近三年来出现的几种新型的核酸适配体的筛选方法,包括氧化石墨烯SELEX(Multiple GO-SELEX)、单壁碳纳米管辅助细胞SELEX(SWCNTs-assisted cell-SELEX)、基于芯片的细胞SELEX(on-chip Cell-SELEX)、序列构造SELEX(Sequence-constructive SELEX)、高保真SELEX(High-Fidelity SELEX),有助于人们进一步了解、认识核酸适配体筛选技术的发展现状,更好促进核酸适体在各个领域中的应用前景.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2017(033)004【总页数】5页(P78-82)【关键词】核酸适配体;SELEX;筛选方法【作者】李亚楠;赵洁;张傲哲;谭琰;华茜;张子剑【作者单位】北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学基础医学院,北京 100029;北京中医药大学中医药研究院,北京 100029【正文语种】中文核酸适配体是能够与特定靶分子结合且具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸［1］。
三阴性乳腺癌EVs相关适配体的筛选与鉴定研究
摘要三阴性乳腺癌恶性程度高，五年预后生存率极低，目前几乎没有有效的早期诊断的标志物，导致其早期筛查与诊断灵敏度不高，因此筛选三阴性乳腺癌的特异性肿瘤标志物具有重要意义。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是肿瘤液体活检的研究热点，其膜表面蛋白是非常有潜力的肿瘤标志物。
本论文直接以三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系分泌的EVs为靶标，通过指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX）筛选出可与EVs特异结合的适配体（Aptamer, Apt）。
主要研究内容如下：1、三阴性乳腺癌EVs特异性核酸适配体的筛选通过粒径选择法提取细胞上清EVs，差速离心法提取血浆EVs。
用透射电镜（Transmission electron microscopy, TEM）、纳米颗粒跟踪分析仪（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）以及蛋白免疫印迹技术（Western blot, WB）对EVs进行表征，结果显示EVs呈现清晰的囊泡结构，电镜下呈碟形；测得三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和乳腺上皮细胞MCF-10A以及血浆EVs平均粒径分别为211.8 nm、204.4 nm、203.5 nm，三者浓度分别为9.82×109 +/-2.86×108 particles/mL、1.03×109+/-5.56×107 particles/mL及1.44×109+/-2.15×107 particles/mL。
分别以MDA-MB-231和MCF-10A EVs为正、负向筛选靶标，先进行5轮正筛选后，加入负向筛选。
筛选过程中通过缩短正筛选孵育时间、增加负筛孵育时间，增加清洗次数以及用血浆EVs进行负筛等条件，逐渐增加筛选压力。
适配体
适配体的类型：
★反义核苷酸链 ★随机核苷酸链
反义核苷酸链
通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与 它们的靶序列是互补的。但是在实际应用中, 存在反义寡核苷酸容易被核酸酶降解、对特 定靶位点的识别不够好、有一定毒性等问题, 所以要对适配体中的核苷酸进行了各种各样 的化学修饰。修饰位点一般在碱基、磷酸骨 架等。★
前景与展望
正是基于寡核苷酸适配体的高特异性、高亲和 力、易体外合成及修饰等特性,寡核苷酸适配体可作 为配基应用于靶分子的分离;其高特异性和高亲和力 地与靶分子结合特性使其可应用于靶分子的捕获;适 配体还被用作分子信标定量检测靶分子。适配体在 分析化学,在蛋白质组研究、临床医学、药物研发及 基因调控等领域已经成为重要的研究工具。随着寡 核苷酸适配体的研究进展,以及在多学科之间的广泛 渗透,其在许多领域将具有更广泛的应用前景。
通过筛选获得的特异识别肿瘤细胞的适配 体,本身就可在不需要知道正常细胞和肿瘤细 胞之间的差异成分的情况下,直接用于肿瘤的 诊断和导向治疗。而这些适配体所特异结合 的蛋白质或其它成分正是正常细胞和肿瘤细 胞之间的差异成份,因此只要能够将这些差异 成分进行纯化、鉴定和检测,新的分子标志物 就有可能被发现,它们有可能成为新的特异性 肿瘤标志物。
亲和介质筛选：一些具有亲和表面的介
质也用于适配体的筛选,如琼脂糖、纤维素及 具有亲和表面的小珠或小柱等。利用这些亲 和介质可以筛选一些小分子物质,如金属、毒 素的适配体。 ★
CE-SELEX
毛细管电泳为基础的SELEX技
术(CE-SELEX),在众多改进的适配体筛选方法 中发展较快。该方法最显著的特点是整个筛 选过程只需要4个循环。
SELEX技术大致可以分为以下几步:
①建立寡核苷酸库。 ②适配体的筛选、分离和EX筛选技术
适配体的研究进程与思考
适 配体 的研 究进 程 与 思 考 木
张春娟 ， 曹 槐 一
（ 云南大学现代生物学研 究中心 ， 云南 昆明 ６０ ９ ） ５０ １
摘要 ： 适配体 （ｐａ ｅ） ａｔ ｒ是指利用指数富集 的配体系统进化 （ Ｅ Ｅ 技术 ， 单链 Ｄ Ａ和 Ｒ Ａ分子 。筛选得到 的适配体 可以与 Ｄ Ａ， Ｎ 蛋 白质或其 它 Ｎ Ｎ Ｎ Ｒ Ａ，
ｃ ｕ ｅ ｏ ｐ ａ ｒ ｎ ｈ ｉｌ ｇｃ ｆ ｃ ｃｅ ｆｓ ｍｅ ｔｐ ｃ ｌａ ｔ ｍｅ ｓ Ｆ ｒ ｅｍｏ ｅ ｗ ｒ ｓ ｍｅ ｔ ｅ ｏ ｒ ｆａ ｔ ｍｅ ｓ ａ ｄ ｔ ｅ ｂ ｏｏ ｉ ａ ｅｆ ａ ｉ ｓｏ ｏ ｉａ ｐ ａ ｒ． ｕ ｈ ｒ ｒ ｅ ｐ ｅ ｕ ｈ ｓ ｌ ｉ ｙ ｔ
ｂｎ ｉ ｄ ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｐ ｏｅ ｎ ｏ ｔ ｒｔｒ ｅ ｌｃ ｌ ｓ Ｔｈ ｙ ｃ ｎ ａｆ ｃ ｈｅｒｐ ｏ ｅ ｉｓ ａ ｄ ａｔｒ ｔ ｅ ｂ ｏ ｒ ｔ ｉ ｒｏｈｅ ａ ｇ ｔｍｏｅ ｕ ｅ ． ｅ ａ ｆｅ ｔｔ ｉ ｒ ｐ ｒ ｅ ｎ ｅ ｈ ｉ － ｔ ｌ ｌｇ ｃ ｌｆ ｎ ｔｏ ｅ ｅ ａ ｔｔ ａ ｇ ｔｍｏｅ ｕ ｅ ．Ｍｏ ｅ ｖ ｒｔ ｅ ｔ ｒ ｅ ｄ ｍｅ ｓｏ ａ ｔｕ ｔ ｒ ｆａ ｔ ｍｅ ａ ｏ ｉａ ｕ ｃ ｉｎ ｒ ｌｖ ｎ ｏ ｔ ｅ ｌｃ ｌｓ ｒ ｒ ｏ ｅ ｈ ｈ ｅ ｉ ｎ ｉｎ ｌｓｒ ｃ ｕ ｅ ｏ ｐ ａ ｒ ｃ ｎ ｓ
ｔ ｅ ｍｅ ｉ ｎ ｔ ｃｕ ｅ ｏ ｈｒ ｅｄｉ ｎｓｏ ａ ｓｒ ｔ ｒ ｆＲＮＡ ｐ ａ ｒ ｌｙ ｈ ｉ ｏｅ ｗｈ ｎ ｔ ｅ ｎ ｅ ａ ｔｗｉ ｈ ａ ｇ ｔｍｏ － ｌ ｕ ａ ｔｍｅ ｓｐ ａ ｓｔ ｅ ｖｔ ｒ ｌ ｅ ｈ ｙ ｉｔ ｒ ｃ ｔ ｔ ｅ ｔｒ ｅ ｌ ｌ ａ ｈ ｅ ｕ ｅ ．Ｔ ｉ ａ ｒ ｖｄｅ ｔ ｅ ｔ ｅ ｒ ｈｉｋｉｇ ｆ ｒ ＲＮＡ ｐ ａ ｒ ｃ ｅ ｎｉｇ． ｃ ｌｓ ｈ ｓｃ ｎ ｐ ｏ ｉ ｈ ｈ ｏ ｔ ｎ ｎ ｏ ｙ ａ ｔ ｍｅ ｓ ｓ ｒ ｅ ｎ
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适配体筛选方法研究进展王巍 贾凌云*(大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,大连116023)摘 要 利用指数富集配体进化技术(SELEX )可获得与目标靶具有特异性结合能力的适配体(寡核苷酸)。
经过近20年的研究,适配体被证实可在科研及临床应用中部分取代抗体,是有很大发展前景的技术领域。
适配体技术发展的关键在于对目标靶具有高选择性吸附能力的适配体的筛选和获得。
十几年来,以提高筛选效率和效果为目标的适配体筛选技术不断改进,产生了如消减筛选、复合靶筛选、基因组筛选、毛细管筛选等新方法,推动了这一技术的发展。
本文对现有适配体筛选方法进行了系统的评述。
关键词 适配体,指数富集配体进化技术,筛选方法,评述2008-09-08收稿;2008-10-26接受本文系国家自然科学基金(N o .20435020)资助项目*E-m ai:l l y j 81@dlut 1 引 言适配体的概念在1990年由Tuer k 等[1]首次提出,是指利用指数富集的配体进化技术(syste m atic evo l u tion o f li g ands by exponentia l enr i c hm en,t SELEX )从特定的寡核苷酸库中筛选出对目标靶有特异性相互作用的寡核苷酸(DNA 或RNA )。
与传统的抗体相比,适配体具有以下特点和优势:(1)对目标靶分子具有与抗体相当甚至更高的亲和性;(2)可以大量、快速的在体外合成,制备方法更为简单快捷;(3)可以针对不同种类的目标靶进行筛选,包括生物毒性的分子以及只具有半抗原性的分子,拓宽了其应用范围;(4)稳定性优于抗体,利于储存。
基于适配体的上述优良特性,其在疾病检测、药物研发、临床治疗、分析化学、蛋白质组学以及基因表达调控机理研究等多个领域都有着良好的应用前景。
目前,限制适配体技术应用的瓶颈问题仍是适配体的有效筛选技术。
希望通过本篇对现存适配体筛选方法的分析与评述,为进一步解决适配体筛选技术中存在的不足提供参考。
2 适配体筛选的总体策略适配体筛选主要包括以下步骤:(1)确立筛选方法。
根据研究目的确定研究对象,明确所获得适配体应具有的特性,以便以此为依据设计具体的筛选方法;(2)建立筛选文库。
根据设计的筛选方法建立用于筛选的具有足够数量和适宜长度的RNA 或DNA 组合文库;(3)实施具体筛选策略。
根据确立的筛选方法,利用固定化或自由态的目标靶从RNA 或DNA 组合文库中筛选出符合预期目标的适配体。
在步骤(1)中,首先需要根据适配体的用途确定筛选出的适配体应具有的特性。
如用于医疗检测目的,为避免假阳性,要求适配体对疾病标志物具有高度的选择性。
在筛选过程中就需要尽可能地排除相似物所带来的干扰。
若用于生物物质的分离,为增加普适性,则希望作为亲和配基的适配体对一类结构相似的物质具有较好亲和性,在该过程中需要利用多个相似物的目标靶进行反复筛选。
在步骤(2)中,为了使筛选过程中获得的寡核苷酸链能够扩增以便反复筛选,RNA 库或DNA 库中的分子均须在两端加上一定长度的引物。
影响筛选效果的因素包括随机区域寡核苷酸的类型、长度以及引物区域核苷酸长度。
寡核苷酸的长短不仅直接影响到库容,也影响到构象的多样性。
实验证实,长度在20~80个寡核苷酸较适于适配体的筛选。
此时,初始筛选库中含有超过1010种分子,理论上包含寡核苷酸能够形成的全部构象。
虽然随着寡核苷酸长度的增加,其构像的丰富程度增加,理论上有利于适配体的筛选,但实际上也不尽然。
如一种凝血酶适配体只有15个寡核苷酸,虽然筛选伊始使用的寡核苷酸库的随机第37卷2009年3月 分析化学(FENX I HUAXU E) 评述与进展Ch i nese Journal o fA na l y tica lChe m istry 第3期454~460链长为60,但后续研究证实,仅含这15个核苷酸的适配体就能很好的与凝血酶结合,即较短的寡核苷酸库也可以实现适配体的有效筛选[2]。
引物部分用于循环过程中的PCR 扩增环节。
在一般情况下,两端引物区域总长在40个寡核苷酸左右。
但适配体在使用时需除去引物,这往往会影响适配体的空间结构进而影响其选择性;若不加入引物,就无法进行扩增,如何解决这两者之间的矛盾是在适配体筛选过程中研究者所关注的主要问题之一。
在步骤(3)中,主要通过多次循环(一般6~20次)获得适配体。
每次循环包括寡核苷酸分子同目标靶的结合、结合分子的分离以及分离所得分子的扩增三步。
在第一步中,目标靶可以以在固相基质上的固定态或溶液中的自由态与寡核苷酸分子结合,两种方式各有利弊。
前者利于后续的分离过程,但会引入一定的非特异性吸附并在一定程度上影响目标靶的构象;后者保持了目标靶的构象却使其与寡核苷酸分离的难度增加。
第二步分离效率的高低直接影响筛选的效率,高效的分离方法可以大大降低适配体筛选循环次数。
第三步扩增通过PCR 技术实现,分离得到的单链DNA 经PC R 放大,其产物用于下一次循环筛选;而单链RNA 则需首先由RT -PCR 形成相应的c DNA,然后扩增,再通过体外转录获得RNA 进入下一次循环。
在所有的筛选过程结束后,还需要对所获得的适配体进行测序,并进一步优化所得序列以提高其选择性,优化方法包括某些非关键核苷酸的剔除、修饰核苷酸的引入、利用酵母三杂交系统进行优化[3]等。
从以上的叙述中可以看出,适配体筛选步骤繁琐,工作重复性高,费时费力。
因此如何快速获得满足要求的适配体成为研究热点。
近年来,一系列对适配体筛选技术的改进方法不断涌现,主要涉及4个方面:(1)提高适配体选择性,进一步增强其在临床检测等领域的优势;(2)增加适配体的普适性,拓宽适配体的应用领域;(3)丰富用于筛选的组合库,从根本上增加获得合乎要求适配体的几率;(4)建立高效、快速的筛选方法,以缩短适配体的筛选周期。
下面将对这4方面的具体研究内容进行详细评述。
3 适配体的筛选方法3.1 提高适配体选择性的筛选方法3.1.1 负筛选 负筛选(negati v e SELEX )是指通过一定手段排除固定化目标靶所使用的基质对筛选的干扰,使获得的适配体仅针对目标分子。
具体方法为:将寡核苷酸库流经固定化所使用的基质,将流穿液即仅包含不与基质相作用的寡核苷酸分子的部分与目标靶混合,进行常规的筛选。
此方法由E lli n gton 等[4]于1992年最先提出,他们在筛选的第三次循环后使用此方法,扣除对固定化基质有吸附的寡核苷酸分子。
同不使用负筛选的过程相比,第四次获得的寡核苷酸亲和性提高了近10倍。
这一结果充分证明了负筛选在实际应用中的意义,尤其对于固定化目标靶的筛选过程。
3.1.2 反向筛选 反向筛选(counter SELEX )是以获得专一性更强的适配体为目的而提出的,主要通过排除一部分能够同时与目标靶类似物相作用的寡核苷酸而提高所获得适配体的选择性。
其具体操作方法与负筛选类似,将不与目标靶类似物相作用的寡核苷酸与目标靶共同孵育,进行筛选。
此方法由Jen ison 等[5]在筛选茶碱的适配体过程中首先建立,他们以与茶碱结构仅相差一个甲基的咖啡因为反向靶,通过这种方法获得了可结合茶碱却对咖啡因没有作用的适配体。
Ito 等[6]利用反向筛选获得了四碘甲腺原氨酸的适配体,筛选过程中以三碘甲腺原氨酸作为反向靶,并将最终获得的适配体进行荧光标记以用于靶分子的检测。
这一筛选方法对于小分子目标靶的筛选极其有利,更易于获得高选择性的适配体。
3.1.3 消减筛选 消减筛选(subtractive SELEX )的目的与反向筛选一致,都是为了提高所获得适配体的选择性,但消减筛选主要针对后面将提到的以复合靶为对象的筛选,扣除对复合靶中非目标部分有吸附的寡核苷酸链。
此方法由W ang 等[7]首先提出,他们利用此方法以未分化的PC12细胞作为消减细胞,筛选获得了分化PC12细胞的适配体。
Shangguan 等[8]通过消减筛选,以CCRF-CE M 细胞(一种人类急性淋巴细胞白血病细胞系)作为靶细胞,Ra m os 细胞作为消减细胞,进行多次循环,所获得的适配体可以区分人正常骨髓细胞与病变细胞;此适配体能够识别癌症病人临床标本中的与此靶标相关的病变细胞,可用于临床检测。
此方法被广泛应用于癌细胞适配体的筛选,所获适配体可用于肿瘤检测与治疗。
3.1.4 光交联筛选 光交联筛选(photo SELEX)是利用光敏感核苷酸在一定波长的光照下,可与其它分子共价交联而产生的一种筛选方法。
由于这种方法利用比亲和作用更牢固的共价键进行筛选,因此455第3期王巍等:适配体筛选方法研究进展456分析化学第37卷所获得的适配体也将具有更高的选择性。
但该方法的假阳性也较高,需要对交联条件进行优化以保证筛选的有效性。
具体筛选方法为:将5-I U(5-碘尿嘧啶)或5-B rd U(5-溴-2-脱氧尿嘧啶)掺入寡核苷酸库,与目标靶孵育后,通过紫外照射发生交联,紫外光的波长以及照射时间都需要一定的优化以保证仅有特异性的寡核苷酸与目标靶交联。
交联后的混合物可以通过P AGE电泳等方法进行分离。
早在1995年,Jensen等[9]就使用光交联方法,通过掺入5-I U筛选出H I V-1上Rev蛋白的适配体。
Koch等[10]对光交联适配体与其目标靶产生光交联过程的动力学进行分析,并建立了数学模型。
该模型基于以下假设:经光照后光交联适配体或与其目标靶共价交联形成复合物或发生不可逆的光损伤而不能再次被激发。
将该模型用于对3种适配体与其靶分子之间相互作用的评价,所获得的结合-解离常数与直接测量值相吻合,证明了此模型的有效性,为进一步研究光交联适配体的性能提供了依据。
3.2提高适配体普适性的筛选方法3.2.1复合靶筛选早期的适配体多以经纯化的蛋白为目标靶进行筛选。
但有时纯靶蛋白不易获得,或对纯蛋白的筛选不具有明显意义(如对于跨膜蛋白、离子通道蛋白等),亦或所需研究的对象本身就为构成复杂的复合物(如整个细胞),这就需要一种针对复合靶的筛选方法。
复合靶筛选(co mp lex tar gets SELEX)与常规筛选的差别仅存在于目标靶的构成,其筛选过程同后者相比并没有明显差异。
这一筛选方法的目标靶构成复杂,因此由此方法获得适配体的难度也更大。
另外,当研究所针对的目标仅为复合靶的一部分时,就需要通过与其它方法如消减筛选联合使用消除干扰因素的影响。
Sha m ah等[11]详细总结了近年来采用复合靶筛选获得适配体的研究工作,论述了以细胞碎片、细胞膜、细菌、寄生虫、病毒、动物细胞等为复合靶的筛选过程,详述了各类目标靶的筛选实例。
对于膜蛋白, TESC-SELEX(target expressed on cell surface SELEX)法[12]也有很好的应用前景。