巨噬细胞培养
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。
可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。
2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。
细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。
3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。
4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。
5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。
6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。
这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。
巨噬细胞培养
腹腔巨噬细胞的获取和培养1.实验目的：掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术2.实验原理：利用巨噬细胞具有趋化运动，吞噬，分泌和参与免疫调节的功能，向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠，使血液中的单核细胞趋化至腹腔，即巨噬细胞。
硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少（如淋巴细胞）。
3.实验器材及材料：（1）成年大鼠（2）手术器械：解剖剪，解剖镊和止血钳（3）其他用品：注射器，培养皿和吸管，酒精及酒精棉球等（4）清洗液：HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。
（5）培养液：DMEM（加10%血清）（6）细胞计数板和计数器4.实验步骤：（1）取细胞4d前，动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。
（2）乙醚麻醉后，拉颈处死动物，经颈总动脉放血。
将动物仰置，剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。
（3）沿正中线剪开腹壁，将5-10mlHBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。
（4）吸出腹膜腔的细胞悬液，离心（1000r/min,10min）。
（5）用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿中，培养2h. （6）吸去培养液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，去除漂浮的细胞，得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。
（7）采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞，离心（1000r/min,10min）。
用培养液混悬细胞，将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。
5.实验结果分析：（1）除巨噬细胞外，自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。
由于淋巴细胞不贴壁，培养2h后用HBSS清洗，可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。
最终获得95%以上是巨噬细胞。
（利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强）。
（2）巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂，在培养条件下可存活1-3周。
直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的，呈圆形，伪足不明显。
经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞，培养2h后，细胞多呈梭形并伸出伪足，即“有头有尾”，具有较强的变形运动和吞噬能力。
高糖培养巨噬细胞的原理
高糖培养巨噬细胞的原理
高糖培养巨噬细胞是一种常用的细胞培养方法，通过提供高浓度的葡萄糖供细胞代谢，促进细胞增殖和生长。
巨噬细胞是免疫系统中的一类重要的吞噬细胞，具有清除病原体、参与免疫调节等功能。
为了保证巨噬细胞在体外培养过程中的正常功能和活性，常需提供适宜的培养条件。
高糖培养巨噬细胞的原理主要有以下几点：
1.能量供应：巨噬细胞代谢过程中需要大量的能量，葡萄糖是主要供能物质之一。
通过提供高浓度的葡萄糖，可以满足细胞能量需求，促进细胞的生长和增殖。
2.代谢产物：高糖培养环境下，细胞可以更充分地代谢葡萄糖，产生较多的代谢产物，如乳酸和丙酮酸等。
这些代谢产物有助于调节细胞内环境，维持细胞的正常生理状态。
3.防止细胞凋亡：在高糖环境下，细胞能够更好地维持细胞内的渗透平衡，防止细胞因渗透压差异而引发细胞凋亡。
需要注意的是，在高糖培养巨噬细胞时，应根据不同的细胞类型和研究目的，调整葡萄糖浓度和培养时间，以达到最佳的细胞生长和功能表达效果。
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞，嘿，这可是个有趣的小家伙呢！要培养它们呀，那可得有点小技巧。
首先呢，咱得给它们准备一个舒服的“家”，就像咱给自己找个舒服的床一样。
这就需要合适的培养基啦。
培养基就像是巨噬细胞的食物和房子的结合体，得有各种营养成分，让它们能吃得饱饱的，茁壮成长。
然后呢，就是细胞来源啦。
可以从动物体内提取，就好像从一个大宝藏里挖出这些小家伙们。
这可得小心点，别把它们弄伤啦。
温度也是很重要的呀！不能太冷也不能太热，得让它们感觉像在春天的暖阳下一样惬意。
不然它们可不乐意好好生长呢。
还有啊，培养的环境得干净卫生，不能有乱七八糟的细菌啊啥的来捣乱。
这就好比我们的家要干干净净的，不然住着多不舒服呀。
在培养的过程中，要时刻关注它们的状态。
看看它们是不是长得欢实呀，有没有啥不对劲的地方。
这就跟咱照顾小宠物似的，得时刻留意着。
有时候，它们可能会闹点小脾气，长得不那么顺利。
这时候可别着急，得慢慢找原因，是营养不够啦，还是环境不合适啦。
就像咱要是不舒服了，也得找找是吃坏肚子啦还是着凉啦。
培养巨噬细胞可不是一蹴而就的事儿，得有耐心，就像种小花儿一样，得精心呵护。
等它们长大了，那可就是咱的小宝贝啦，可以用来做各种实验，帮助我们了解更多关于身体的奥秘呢！
想想看，通过我们的努力，让这些小小的巨噬细胞在我们的培养下变得强大，是不是很有成就感呢？这就好像看着自己的孩子一点点长大一样开心呀！所以呀，大家可别小瞧了这培养巨噬细胞的过程，这里面的学问可大着呢！咱得认真对待，才能让它们发挥出最大的作用呀！你说是不是呢？。
巨噬细胞培养
1.培养瓶 离心管 注射型滤器（正压过滤器） 2.手术器材：镊子 手术剪 止血钳 注射器 针头 3.包装用品 支架：饭盒 包装纸 硫酸纸 棉线 准备：
1. 清洗： 刷洗，煮沸后加洗剂 冲洗，振荡冲洗15-20次 酸泡，烤干后泡24h 浸泡，去离子水2次，每次24h，新玻璃器材5%HCL
（37℃，5％CO2）培养 2-3 小时。
（6）除去培养液，用 Hanks 液冲洗培养孔 2-3 次，去除未贴壁细胞，
纯化巨噬细胞，再用RPMI1640液冲洗1-2次，再加入RPMI1640（10％
无支原体胎牛血清）培养液备用。
（7）细胞的传代培养
（8）普通光镜下细胞计数，鉴定，检测活性
小鼠腹腔巨噬细胞的鉴定 用酸性磷酸酶法鉴定巨噬细胞。 （1）取出有细胞贴壁的盖玻片放于载玻片上，用 HANK’S液冲洗 2-3 次，放入冰箱（4℃），30分钟后取出，在细胞贴壁细胞上滴加 10％中 性甲醛溶液数滴，放入冰箱（4℃）固定30 分钟。 （2）自来水漂洗5 分钟，把水沥干。 （3）在固定好的细胞上滴加酸性磷酸作用液数滴，37℃处理 30 分钟。 （4）自来水漂洗3-5 次。 （5）在细胞上滴加1％硫化铵3-5 分钟。 （6）自来水冲洗3-5 次，甩干。 （7）在细胞上滴加吉姆萨染色液染色15 分钟。 （8）自来水冲洗3-5 次去除多余染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜 检。 玻璃器皿： 1.浸泡：洗涤剂中浸泡数小时，刷洗，5%HCL浸泡12h以上 2.刷洗：在洗剂中毛刷（软毛，轻用力，注意更换），充分冲洗，晾干 3.浸酸：6h以上，最好过夜 清洗液配方： 强 次 弱 重铬酸钾（g）:63 120 100 浓H2SO4(ml):1000 200 100 蒸馏水（ml）：200 1000 1000 4.冲洗：自来水（压力），瓶内盛满水，倒空10次以上，重蒸水浸洗2-3 次，烘干后包装 胶塞：水浸泡，2%NaOH煮沸10min,自来水冲洗晾干，1%稀HCL浸泡 30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用 塑料：水泡，自来水冲洗（不刷洗），2%NaOH过夜，自来水冲洗， 1%稀HCL浸泡30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，它们在体内起着清除病原
体和细胞垃圾的作用。
在体外培养条件下，人巨噬细胞通常呈现出
多种形态。
首先，人巨噬细胞在培养基中通常呈现为悬浮状态，呈圆形或
椭圆形。
这些细胞通常具有丰富的胞质，呈灰白色或淡黄色，细胞
质内含有丰富的溶酶体和吞噬体，这些细胞器是巨噬细胞进行吞噬
和降解病原体和细胞垃圾的重要结构。
其次，当人巨噬细胞受到刺激或吞噬病原体后，它们的形态会
发生改变。
巨噬细胞会通过伪足的延伸和细胞膜的变化将病原体包
裹并吞噬到细胞内部。
这时，巨噬细胞可能会呈现出更多的突起和
伪足，形态呈现出更加不规则的形状。
此外，在培养基中，人巨噬细胞还可能形成集群或聚集在一起。
这种集群形态有助于巨噬细胞之间的相互作用和信号传导，从而更
好地执行其免疫功能。
总的来说，人巨噬细胞在体外培养条件下呈现出悬浮的圆形或
椭圆形，具有丰富的胞质和溶酶体，当受到刺激时可能呈现出不规则形状，同时也可能形成集群。
这些形态特征反映了巨噬细胞在体外培养条件下的活跃状态和免疫功能。
巨噬细胞的分离、纯化与培养
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，用于研究免疫和炎症反应的机制。
以下是一种常用的人巨噬细胞培养方法：
材料：
1. 人外周血单个核细胞（PBMC），来源可以是新鲜的外周血样本或者离心分离的PBMC。
2. 无血清RPMI 1640培养基，含有GlutaMAX、非必需氨基酸、钠硼砂缓冲液等。
3. 10% 热灭活胎牛血清（FBS）。
4. 非必需维生素溶液。
5. 100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液。
步骤：
1. 将PBMC离心沉淀，并用PBS洗涤2次，以去除血浆。
2. 将PBS去除，加入无血清RPMI 1640培养基，使细胞悬浮。
3. 细胞计数，并用无血清RPMI 1640培养基将细胞浓度调整至合适的浓度（一般为1x10^6细胞/ml）。
4. 在无血清RPMI 1640培养基中加入10% FBS，以提供细胞生长所需的营养物质。
5. 在培养基中加入1% 非必需维生素溶液，以提供额外的维生素补充。
6. 加入100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液，以防止细菌污染。
7. 将细胞悬浮液移入含有6孔或12孔培养板中的培养皿，并在37°C的培养箱中培养。
8. 培养细胞时，每隔2-3天更换一次培养基，以保持细胞的健康生长。
9. 在培养期间，可以根据需要添加不同的刺激剂（如细菌成分、细胞因子等）来激活细胞，并观察其对刺激的反应。
这是一种基本的人巨噬细胞培养方法，根据具体的实验需求和细胞类型的不同，培养条件可能会有所调整。
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1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。
3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。
7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。
8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.71.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。
我们的经验是，以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。
使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 mi n后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。
值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。
该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。
看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。
2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA 的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM 培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。
4.RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。
生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形，伸出伪足之类的吧。
这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。
5.细胞老得特别快,用DMEM培养基本上一天培养基就会变黄,需要换液,如果换液换晚了的话细胞就感觉长融在一起细胞壁不清楚,但基本上不会有死细胞6.小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和50 μg/ml庆大霉素。
3 d换液1次,细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。
7.ATCC complete growth medium:The basemedium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.Atmosphere:air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%Temperature:37.0°C8.Subcultures are prepared by scraping.For a 75 cm2 flask, remove all but （差不多）10 ml culture medium (adjust amount accordingly for other culture vessels). Dislodge cells from the flask substrate with a cell scraper; aspirate and add appropriate aliquots of the cell suspension into new culture vessels.Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:6 is recommendedMedium Renewal: Replace or add medium every 2 to 3 days.9.Preservation:Freeze medium:Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSOtorage temperature: liquid nitrogen vapor phase10.This line was established from a tumor induced by Abelson murine leukemia virus. They arenegative for surface immunoglobulin (sIg-), Ia (Ia-) and Thy-1.2 (Thy-1.2) This line does not secrete detectable virus particles and is negative in the XC plaque formation assay. The cells will pinocytose（摄取）neutral red（中性红）and will phagocytose （吞噬）latex beads （乳胶微球）and zymosan（酵母多糖）. They are capable of antibody dependent lysis of sheep erythrocytes (绵羊红细胞)and tumor cell targets. LPS or PPD （结核菌素）treatment for 2 days stimulates lysis of erythrocytes but not tumor cell targets. Data communicated in Feb. 2007 by Dr Janet W. Hartley, indicates the expression of infectious ecotropic MuLV closely related, if not identical, to the Moloney MuLV helper virus used in the original virus inoculum. The cells also express polytropic MuLV, unsurprisingly based on the mouse passage history of the virus stocks [ PubMed 18177500].PBS磷酸盐缓冲液含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS－T)配制方法为：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。
PBS:Phosphate Buffered SalinePBS 1L配方：pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L。
高温高压灭菌后室温保存。
PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/LDPBS杜氏磷酸缓冲液，全称为：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子。
组分分子量浓度 (gm/L) 摩尔浓度 (mM)氯化钾 (KCl) 75 0.20 2.67磷酸二氢钾 (KH2PO4) 136 0.20 1.47氯化钠 (NaCl) 58 8.00 138.00磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 142 1.15 8.10pH值为7.4。
D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。
BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。
Hanks配制甲液：Na2HPO4•2H2O 0．06克KH2PO4 0．06克MgSO4•7H2O 0．20克葡萄糖1．00克NaCl 8．00克三蒸水750毫升乙液：CaCl2 0．14克三蒸水100毫升①将乙液徐徐加入甲液中。
②将0．35克NaHCO3溶解在37℃100毫升三蒸水中。
③用数滴NaHCO3液溶解0．02克酚红。
④将②、③液移入①液中。
⑤用三蒸水定容至1000毫升，充分混匀，4℃冰箱过夜。
⑥滤过消毒，小瓶分装，冷藏。
注意：酚红对细胞有一定毒性，目前实验中的用量除0．02克外，还有0．01克和0．005克，也有BSS液中不加酚红的。
酚红量不同，BSS颜色也不同。
配制胰蛋白酶消化液胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。
胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。
本实验室一般用1：250(GRC公司生产)。
胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。