巨噬细胞的分离、纯化与培养
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。
可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。
2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。
细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。
3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。
4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。
5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。
6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。
这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。
肝脏巨噬细胞(KCs)的分离培养
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白 色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。
• 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞 筛过滤。
• PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀 释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g， 5min, 4oC离心，取沉淀。
用镊子划碎肝组织
装入试管消化
肝脏消化吹打后细胞悬液
细胞悬液过滤
洗涤与肝细胞沉淀
梯度离心
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍， 弃上清(300×g，5min)。
非肝细胞SIP离心准备
SIP离心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。 取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去 除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。
刚分离出的细胞
KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清 （HCs的鉴定活力判定
巨噬细胞功能实验报告
一、实验目的1. 了解巨噬细胞在免疫过程中的作用。
2. 掌握巨噬细胞的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习巨噬细胞吞噬功能的检测方法。
二、实验原理巨噬细胞是一种具有强大吞噬功能的免疫细胞，在免疫过程中起着重要作用。
巨噬细胞能够识别、吞噬和消化病原微生物、凋亡细胞等异物，并参与抗原呈递、免疫调节等过程。
本实验通过分离、培养和鉴定小鼠腹腔巨噬细胞，并检测其吞噬功能，以了解巨噬细胞在免疫过程中的作用。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：6-8周龄小鼠2. 试剂：胎牛血清、RPMI-1640培养基、无菌生理盐水、鸡红细胞、冷亚甲蓝染液等3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、培养皿、离心机等四、实验方法1. 巨噬细胞的分离与培养（1）小鼠处死后，打开腹腔，取出肠系膜，剪成1cm×1cm的小块。
（2）将小块组织放入装有生理盐水的培养皿中，用剪刀剪碎，制成组织悬液。
（3）将组织悬液移入离心管，以1000r/min的速度离心5min，弃去上清液。
（4）加入适量RPMI-1640培养基，重悬细胞，以1000r/min的速度离心5min，弃去上清液。
（5）加入适量胎牛血清的RPMI-1640培养基，重悬细胞，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。
（6）将细胞悬液接种于培养皿中，放入CO2培养箱中培养24h。
2. 巨噬细胞的鉴定（1）取少量细胞悬液，加入适量台盼蓝染液，混匀，室温放置5min。
（2）用血细胞计数板计数，计算细胞死亡率。
（3）收集培养24h的细胞，用倒置显微镜观察细胞形态，判断细胞类型。
3. 巨噬细胞吞噬功能的检测（1）取适量鸡红细胞，用生理盐水洗涤3次，调整红细胞浓度为2×10^9个/mL。
（2）将鸡红细胞加入巨噬细胞培养液中，37℃、5%CO2条件下孵育30min。
（3）取出细胞，用生理盐水洗涤3次，弃去上清液。
（4）加入适量冷亚甲蓝染液，混匀，室温放置5min。
巨噬细胞观察实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解巨噬细胞的基本形态和生物学特性。
2. 掌握巨噬细胞的分离和培养方法。
3. 观察巨噬细胞的吞噬功能，并分析其吞噬能力。
二、实验原理巨噬细胞是一种具有吞噬功能的免疫细胞，属于单核吞噬细胞系统。
在机体免疫应答中，巨噬细胞起着重要的作用。
本实验通过分离和培养小鼠腹腔巨噬细胞，观察其吞噬功能，以了解巨噬细胞在免疫应答中的作用。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 实验试剂：无菌生理盐水、台盼蓝染液、鸡红细胞悬液、小牛血清、RPMI-1640培养基等3. 实验设备：解剖显微镜、手术器械、细胞培养箱、细胞培养皿、离心机、显微镜等四、实验方法1. 巨噬细胞的分离和培养（1）无菌操作下，取小鼠腹腔液，加入等体积的生理盐水，混匀。
（2）将混合液以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。
（3）加入适量RPMI-1640培养基，轻轻吹打，使细胞悬浮。
（4）将细胞悬液接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养。
2. 巨噬细胞的吞噬功能观察（1）将培养好的巨噬细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。
（2）加入台盼蓝染液，染色5 min。
（3）用生理盐水冲洗3次，弃上清液。
（4）加入鸡红细胞悬液，混匀。
（5）将细胞悬液置于细胞培养箱中培养30 min。
（6）取出细胞，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。
（7）加入适量RPMI-1640培养基，轻轻吹打，使细胞悬浮。
（8）将细胞悬液滴于载玻片上，置于显微镜下观察。
五、实验结果与分析1. 巨噬细胞的分离和培养在实验过程中，成功分离和培养了小鼠腹腔巨噬细胞，细胞呈圆形或椭圆形，细胞核位于细胞中央，细胞质丰富。
2. 巨噬细胞的吞噬功能观察在显微镜下观察，发现巨噬细胞对鸡红细胞具有吞噬作用。
部分巨噬细胞吞噬了鸡红细胞，细胞质内出现红色颗粒。
3. 吞噬能力分析通过观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的数量，可以评估其吞噬能力。
实验结果显示，巨噬细胞的吞噬能力较强，吞噬鸡红细胞的数量较多。
大鼠骨髓巨噬细胞的分离_纯化_培养以及鉴定_李静
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定李静,王亚平(重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016)=摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。
方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。
采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。
结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。
=关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定=中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24Methodology of separation,purification,cultivation an didentification of rat bone marrow macrophageLI Jing,et al(Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage.=Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification巨噬细胞是机体的重要防御细胞。
肝脏中分离巨噬细胞的方法
肝脏中分离巨噬细胞的方法
目前常用的肝脏中分离巨噬细胞的方法包括以下步骤：
1. 肝脏解剖：将小鼠或大鼠的肝脏取出，放入冷PBS（磷酸盐缓冲液）中。
2. 碎组织：将肝脏组织迅速切碎成小块，然后用力鼓捣和挤压，使细胞悬浮在PBS中。
3. 过筛：将组织悬浮液通过70μm的细胞筛滤网，以去除大块的组织碎片。
4. 密度梯度离心：将细胞悬浮液加入密度梯度离心管中，如离心管中加入Percoll溶液。
然后进行离心，将巨噬细胞分离到梯度液面上。
5. 巨噬细胞收集：用转移到新的离心管中，并用冷PBS洗涤巨噬细胞。
这个方法可以分离巨噬细胞，并得到较纯的巨噬细胞悬浮液，但是需要注意的是，使用过程要保持所用材料和试剂的消毒和无菌操作，以避免细菌或其他微生物的污染。
一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法与流程
一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法与流程1. 肝脏固有巨噬细胞的分离肝脏固有巨噬细胞是肝脏内的一种重要免疫细胞，它们在肝脏的免疫应答和炎症反应中发挥着重要作用。
为了分离肝脏固有巨噬细胞，我们可以采用以下方法：(1) 肝脏细胞的提取：从肝脏中提取细胞，可以使用肝脏灌注法或酶消化法。
(2) 巨噬细胞的分离：通过密度梯度离心法，将肝脏细胞中的巨噬细胞分离出来。
常用的密度梯度介质有Percoll等。
(3) 巨噬细胞的纯化：通过抗体标记和磁珠分选等方法，将巨噬细胞从其他细胞中纯化出来。
2. 肝脏浸润巨噬细胞的分离肝脏浸润巨噬细胞是指从血液或其他组织中浸润到肝脏中的巨噬细胞。
为了分离肝脏浸润巨噬细胞，我们可以采用以下方法：(1) 肝脏细胞的提取：从肝脏中提取细胞，可以使用肝脏灌注法或酶消化法。
(2) 浸润巨噬细胞的分离：通过免疫磁珠分选等方法，将浸润巨噬细胞从其他细胞中分离出来。
(3) 浸润巨噬细胞的纯化：通过抗体标记和流式细胞术等方法，将浸润巨噬细胞从其他细胞中纯化出来。
3. 细胞表面标记物的应用在分离和鉴定巨噬细胞的过程中，我们可以利用细胞表面标记物的特异性来区分不同的巨噬细胞亚群。
常用的细胞表面标记物包括F4/80、CD11b、CD68等。
4. 细胞培养和鉴定分离得到的巨噬细胞可以进行细胞培养和鉴定。
在培养过程中，我们可以观察细胞的形态、生长速度和分化情况等指标，以确定细胞的纯度和功能状态。
同时，我们还可以利用免疫荧光染色等方法对细胞进行鉴定。
5. 细胞功能分析通过对分离得到的巨噬细胞进行功能分析，我们可以了解它们在肝脏免疫应答和炎症反应中的作用。
例如，可以通过刺激巨噬细胞并检测其产生的炎症因子或调节其他免疫细胞的分化来评估其功能。
6. 免疫表型检测通过对分离得到的巨噬细胞进行免疫表型检测，我们可以了解其免疫表型特征和功能状态。
常用的免疫表型检测方法包括流式细胞术和免疫印迹等。
7. 实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术是一种常用的基因表达分析方法，可以用于检测巨噬细胞中特定基因的表达水平。
大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定
大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定李静;王亚平【期刊名称】《重庆医科大学学报》【年(卷),期】2003(28)4【摘要】目的 :为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能 ,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离 ,纯化和培养的方法。
方法 :分离获取大鼠骨髓细胞 ,在 6 0 %DMEM培养液 ,2 0 %马血清 ,2 0 % (v/v)L92 9培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养 ,6～ 7天时获得纯度较高的贴壁细胞。
采用倒置显微镜下观察生活状态、Wright′s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学 ;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达 ;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能 ;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果 :获得高纯度的巨噬细胞 ,且具有良好的吞噬功能 ,并且具备巨噬细胞的形态特征 ,特有的水解酶类及特有的表面标志 -CD68。
结论 :本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。
【总页数】4页(P436-439)【关键词】骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定【作者】李静;王亚平【作者单位】重庆医科大学基础医学院组胚教研室【正文语种】中文【中图分类】R324.3【相关文献】1.大鼠骨髓间质干细胞的分离纯化与鉴定 [J], 张荣利;冯雪;张会亮;罗国安;李连达;王义明2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化及生物学特性的鉴定 [J], 卓文利;付云烽;徐廷昭;吴卫真;杨顺良;谭建明3.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定 [J], 卢仁荣;陈良龙;江琼;郭进建4.大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定 [J], 李显澎;樊粤光;刘建仁;范海蛟;江晓兵;孙志刚;曾建春;阳建权5.全骨髓培养法对大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 [J], 李大伟;高广周;李欣;孙涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞
1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化
1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
使肺组织通过00目的钢丝网，分离单个细胞。
4．以下过程均在4℃中进行。
分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g 10分钟，去上清液。
轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/L Tris, 0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。
红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1％和10％。
也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。
5．离心200×g 10分钟，去上清液。
用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。
将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g 20分钟，收集交界面的巨噬细胞。
弃去沉淀的死细胞和红细胞。
6．用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。
台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。
此时巨噬细胞活力可达90％以上，巨噬细胞占全部细胞的90％以上。
三、从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞
1．用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷RPMI-1640培养液（含1％小牛血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪。
用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网，获得单个细胞。
2．离心200×g 10分钟，去上清液。
用含1％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成约1×108～5×108/ml。
巨噬细胞的纯化
一、用帖壁法纯化巨噬细胞
1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×106/ml的浓度。
以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。
37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时或24小时。
1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。
20％～40％的小牛血清可以减少B 淋巴细胞的粘附。
2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。
用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。
悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。
用适量含2.5mmol/L EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃15～30分钟。
用吸管吹打分离细胞，离心250×g 10分钟，去上清液。
3．用预冷的Hanks液洗涤细胞3～4次，每次离心250×g 10分钟，去上清液。
最后用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力，将细胞配成所需的浓度。
二、用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞
1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。
最后加上上述巨噬细胞悬液3～5ml（约含2×107～5×107细胞）。
2．4℃中，水平离心1000×g 30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。
分别用预冷的含1％小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞2次，每次200×g 10分钟。
用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。
巨噬细胞培养
1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g 4℃离心10分钟，去上清，加10 ml Eagle培养基。
7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。
8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养。
巨噬细胞图片:
巨噬细胞吞噬癌细胞。