CRISPR-Cas9技术
CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
?crisprcas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰?crrna结合相关的cas蛋白后形成crrnacas蛋白复合体通过碱基互补配对精确地与目标dna相结合随后cas蛋白对目标dna进行断裂和降解
基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
crispr cas9原理简介
crispr cas9原理简介CRISPR-Cas9基因编辑技术，是一种通过靶向剪切基因组中特定DNA序列的方法。
该技术最初源自一种天然的细菌免疫系统，可用于编辑生物体的基因组。
CRISPR（簇状规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌和古细菌基因组中的一种特殊DNA序列，以重复、间隔和短回文特点而命名。
CRISPR序列常常与Cas（CRISPR-associated protein）基因一起出现，这些Cas基因编码一类能够识别并修剪DNA的酶。
CRISPR-Cas系统中最常用的是Cas9酶，它是通过向CRISPR-Cas9复合物中引入特定的RNA分子来实现DNA靶向。
这种RNA分子称为单导RNA（sgRNA），它是一种具有20个核苷酸的短链RNA，结合了用于指引Cas9定位到特定目标序列的脱氧核苷酸。
sgRNA与Cas9酶形成复合物后，可以通过碱基互补配对与基因组DNA中的目标序列结合。
当sgRNA与Cas9复合物与目标DNA序列配对时，Cas9酶便会被激活并剪切其靶向序列。
这一过程引发DNA修复机制，使得目标序列得以重组或删除。
如果提供了外源DNA修复模板，修复机制还可以将该模板中的DNA片段插入到被剪切的部分，实现想要的基因修饰。
CRISPR-Cas9技术的优势在于其简单性和高效性。
相较于传统的基因编辑技术，CRISPR-Cas9可以更加准确地指定目标序列，并在短时间内完成基因组的编辑。
它已被广泛应用于基础科学研究、生物医学研究以及农业领域，为基因治疗和作物改良等领域带来了突破性的进展。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享在现代生物学研究中，基因编辑技术的出现为研究人员提供了一种高效、精确、低成本的方式来研究基因功能和调控机制。
CRISPR-Cas9系统作为一种革命性的基因编辑工具被广泛应用于基因组编辑、疾病治疗和农业改良等领域。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程，并分享一些最佳实践。
CRISPR-Cas9基因编辑技术概述CRISPR-Cas9是一种依靠细菌天然的免疫机制发展而来的基因编辑技术。
CRISPR是一种特殊的DNA序列，可与Cas9酶一起，通过识别和切割DNA序列来精确编辑基因组。
CRISPR-Cas9系统的主要组成部分包括CRISPR RNA （crRNA）、转录单元结构化RNA（tracrRNA）和Cas9酶。
crRNA负责识别目标DNA序列，而tracrRNA将crRNA与Cas9酶结合起来形成活跃的CRISPR-Cas9复合物。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程1. 设计并合成RNA引导序列在使用CRISPR-Cas9进行基因编辑之前，首先需要设计并合成RNA引导序列。
该序列用于指导Cas9酶精确识别和切割目标基因组DNA。
合成的RNA引导序列通常由crRNA和tracrRNA合成而成，也可以合成一个融合的single-guide RNA （sgRNA）。
2. 构建CRISPR-Cas9载体CRISPR-Cas9基因编辑需要将Cas9酶和RNA引导序列导入目标细胞内。
可使用载体如质粒或病毒进行基因编辑构建。
选择合适的载体需考虑目标细胞类型、转染效率和所需编辑范围等因素。
将Cas9基因和RNA引导序列克隆至载体后，可通过转染或病毒介导转染等方法将其导入目标细胞。
3. 确定编辑效果在导入CRISPR-Cas9系统后，使用分子生物学方法来验证编辑效果。
例如，PCR、测序、Western blot或免疫组化等技术可以用于检测目标基因的突变、修复或敲除效果。
cas9基因敲除原理
cas9基因敲除原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以通过切割DNA序列
来实现基因敲除。
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，是一种天然存在于细菌和
古细菌中的免疫系统。
Cas9则是CRISPR-Cas9系统中所使用
的酶。
CRISPR-Cas9系统通过三个主要组件来实现基因敲除：CRISPR RNA（crRNA），tracrRNA和Cas9。
首先，crRNA
和tracrRNA结合形成一个复合体，被称为单导螺旋RNA （sgRNA）。
sgRNA可以与Cas9酶结合，并引导Cas9 酶与
特定DNA序列中的目标基因相结合。
当Cas9与sgRNA定位到目标基因的特定序列时，它会切割DNA，导致基因序列中的断裂。
细胞会试图修复这个断裂，
但通常会导致不完整的修复，从而引起基因缺失或突变。
这就实现了基因敲除的目标。
此外，通过供应外源的DNA修复模板，可以利用Cas9的断
裂修复机制来进行目标基因的修复。
这种方法被称为基因敲入，可以在目标基因上插入新的基因组成部分。
总而言之，CRISPR-Cas9系统利用Cas9酶和sgRNA的组合，定位和切割特定的DNA序列，实现了基因敲除和敲入的目标。
这项技术在基因研究和治疗领域有着广泛的应用前景。
crispr cas9原理及应用
crispr cas9原理及应用CRISPR-Cas9 是一种革命性的基因编辑技术，其原理基于一种存在于细菌免疫系统中的天然机制。
该技术利用了一种称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats （CRISPR）的 DNA 序列和 Cas9 蛋白质，能够准确地识别和编辑基因组中的特定目标序列。
CRISPR-Cas9 技术的基本原理是通过设计特定的引导 RNA 来指导 Cas9 蛋白质精确地结合到目标 DNA 序列上。
一旦 Cas9与目标 DNA 结合，它会切割 DNA 分子，从而可能引发自然修复过程或介导外源 DNA 片段嵌入到基因组中。
这种技术的目标序列可以根据需求进行设计，从而实现精确的基因组编辑。
CRISPR-Cas9 技术在基因组编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能和疾病模型的构建。
科学家可以利用CRISPR-Cas9 技术来人为地引发基因突变，以研究基因功能和疾病的发病机制。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于治疗基因相关疾病。
通过准确编辑患有遗传病的患者的基因组，科学家可以修复或纠正疾病相关基因的缺陷，以治疗或预防疾病的发生。
CRISPR-Cas9 技术还被用于生物学研究和农业领域。
从基因组编辑的角度看，这种技术可以用于培育产量更高、对病虫害抵抗力更强的农作物，以满足全球不断增长的粮食需求。
此外，CRISPR-Cas9 技术还可以用于改良微生物产生特定化合物，例如药物或化学制品。
总而言之，CRISPR-Cas9 是一种功能强大的基因编辑技术，它已经革新了生物学研究和医学领域。
它的应用不仅仅局限于基因功能研究，还包括基因治疗、农业改良等领域，为人类带来了希望和新的可能性。
crispr cas9工作原理
crispr cas9工作原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，其工作原理可以分为三个主要步骤：适应、切割和修复。
1. 适应：CRISPR-Cas系统最初通过识别和适应外源DNA的
序列来开始工作。
这一步骤发生在细菌或古细菌中，它们利用Cas蛋白和一段短的RNA序列来识别和保存外源DNA序列。
2. 切割：一旦适应完成，CRISPR-Cas系统可以进行基因编辑。
在这一步骤中，细菌通过产生一种叫做sgRNA (单导RNA)的RNA分子，该分子拥有与目标基因序列相匹配的部分。
sgRNA与Cas9蛋白结合形成复合物，这个复合物可以前往细
胞核。
sgRNA和Cas9复合物会识别和结合到目标基因的特定DNA
序列上。
一旦结合成功，Cas9蛋白便会发挥剪刀的作用，切
割目标DNA，并形成双链断裂。
3. 修复：当DNA双链断裂发生时，细胞会尝试修复这一伤口。
通常有两种修复机制：
- 非同源末端连接（NHEJ）：这是一种快速但不精确的DNA
修复机制。
在NHEJ中，细胞会直接连接断裂的DNA末端。
这种修复方式可能会导致插入缺失或碱基改变，从而导致基因功能的改变。
- 同源重组（HDR）：这是一种较慢但更精确的修复机制。
在
HDR中，细胞会利用一个同源的DNA模板来修复断裂的DNA。
这种修复方式可用于插入、删除或修改目标基因的具体部分。
通过CRISPR-Cas9技术，我们可以精确地切割和修改基因，进而研究和改变生物体的特性和功能。
这项技术在基因治疗、农业改良和生命科学研究等领域具有广泛的应用前景。
CRISPR-Cas9技术优化
▪ CRISPR-Cas9在农业领域的应用
1.CRISPR-Cas9技术可以用于改良农作物，提高作物的抗病性 、抗虫性和抗旱性。 2.通过CRISPR-Cas9技术，研究人员可以精确地编辑作物的基 因，以提高作物的营养价值或改善作物的品质。 3.目前，CRISPR-Cas9已经在一些农作物中展示出良好的改良 效果，如改良水稻、小麦等粮食作物。
CRISPR-Cas9技术的应用领域
▪ CRISPR-Cas9在生物研究中的应用
1.CRISPR-Cas9技术可以用于快速、高效地构建基因敲除或基 因过表达的细胞或动物模型。 2.通过CRISPR-Cas9技术，研究人员可以精确地编辑细胞或动 物的基因，以研究基因的功能和疾病机制。 3.目前，CRISPR-Cas9已经成为生物研究中最常用的基因编辑 工具之一。
CRISPR-Cas9技术简介
▪ CRISPR-Cas9技术的优势
1.CRISPR-Cas9技术具有操作简便、效率高、成本低等优点。 2.与传统的基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9技术更加精准， 错误率更低。 3.CRISPR-Cas9技术可以广泛应用于生物学、医学、农业等领 域。
▪ CRISPR-Cas9技术的应用领域
CRISPR-Cas9技术优化
目录页
Contents Page
1. CRISPR-Cas9技术简介 2. CRISPR-Cas9的工作原理 3. CRISPR-Cas9技术的优势 4. CRISPR-Cas9技术的应用领域 5. CRISPR-Cas9技术存在的问题 6. 优化CRISPR-Cas9的策略和方法 7. 优化后的CRISPR-Cas9应用案例 8. CRISPR-Cas9技术的未来展望
CRISPR-Cas9的优化策略
crispr cas9技术
1.2 .CRISPR/Cas9作用机理
CRISPR-Cas系统的结构：CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由 不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列 S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。
CRISPR/cas9基因编辑技术及应 用
——— 一种来源于细菌获得 性免疫由RNA指导Cas蛋白对靶 向基因获得性修饰的技术
1. CRISPR-Cas系统简介
• 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的 碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序 列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌 的基因组中，2002 年，正式将其命名为 成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)
在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与
野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使
用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可
以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行
操 Ca作s9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程（Cas9质粒建立 k1n、oc设k-计ou识t细别靶胞位系点）的一对DNA Oligos
CRISPR/技术的前景及优缺点
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为 每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换 20个核苷酸就行。
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2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ ＤＮＡ配对 利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特 CRISPR－on系统。 真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子 ＶＰ16结合获得。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRIPSR 基因座的表达 (包括转录和转录后的成熟 加工) 当该噬菌体再次入侵细 菌时，CRISPR 簇首先转录 为长的crRNA前体，然后逐 步被加工成小的成熟的 crRNA。 CRISPR/Cas 系统活性的 发挥或者是对外源遗传物 质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互 补配对精确地与目标DNA相 结合，随后Cas 蛋白对目 标DNA 进行断裂和降解。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理
2、CRISPR-Cas系统的应用
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑 技术
基因组编辑技术是一种可以在基因组 水平上对DNA序列进行改造的遗传操 作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切 酶，在预定的基因组位置切断DNA， 切断的DNA在被细胞内的DNA修复 系统修复过程中会产生突变，从而达 到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以 实现三种基因组改造，即基因敲除， 特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手 段之一，也可被用于人类遗传性疾病 的治疗，因此这类技术成为现代分子 生物学的研究热点
例子：基因敲除的实验过程
1、在把基因序列中寻 找NGG序列获得其附近 20多个碱基的序列， 与tracrRNA序列融合， 设计出sgRNA并合成该 序列。 2、将该序列以及cas9 基因连入如图所示载 体。 3、转化感受态，质粒 小提，测序验证。 4、细胞培养与细胞转 染 5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细 胞株
CRISPR/Cas9系统及 其应用
CRISPR-Cas系统简介
CRISPR-Cas系统的应用技术
CRISPR-Cas系统的应用前景
1. CRISPR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中， 2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入 侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞 EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同 年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成 双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定 点插入。
3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景
3.1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因
为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要 替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不
具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单
方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来 的并发症。
3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方 面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将３种主要生 物聚合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质）结合在一起的特殊 能力。 各种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用 gRNA的靶向作用结合到dsＤＮＡ的任意位点，发挥人们预 期的功能。 例如：Cas9如果与甲基化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去 乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋白 成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久改变 基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点Cas9复 合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实现基因调 控的目的。
1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 CRISPR 的高度可变的间隔区的获得
首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临 近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5'端 合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间
2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白 失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ 结合的能力。这种失 去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Ｃas9。将ｄCas9与 gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ 结合。 如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用； 如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始
2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术
CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白 Cas9，在一段人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对 小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编 程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。