Sephadex LH-20使用说明
葡聚糖凝胶 Sephadex LH20 使用说明及使用心得
问：分得效果不是很好，上了有 8 毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用 约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差 不多，很让人困惑，郁闷。
了 1g 干态的,Sephadex LH20 对不同溶剂中的保留体积： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品 在最佳配比的容液中溶呢?"
不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说 的是 Sephadex LH20 不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是 Sephadex LH20 这种填料的特点:"洗脱体积一般为 2-3 个保留体积，对特殊保留强的化合 物，可洗脱 5 个保留体积",
3. 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积 的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进 行过滤！否则把 Sephadex LH-20 堵塞，就必须将 Sephadex LH-20 的柱头 部分弃去，造成不必要的浪费）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少 体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
当然有影响,Sephadex LH20 在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何 填料都是这样,只是 Sephadex LH20 很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯 中收 缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯 作溶剂,如果前后使用的两种洗脱 溶剂对 Sephadex LH20 的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举
Sephadex LH20详细介绍
Physical and chemical characteristics
Sephadex LH-20 is beaded, cross-linked dextran that has been hydroxypropylated to yield a chromatography medium with both hydrophilic and lipophilic character. Due to its dual character, Sephadex LH-20 swells in water and a number of organic solvents. The chemical structure of the medium is shown in Figure 1. Both the wet particle size and exclusion limit for the medium vary depending on the solvent used for swelling, see Table 2. Table 1 summarizes the general physico-chemical and chromatographic properties of Sephadex LH-20.
imagination at work
Table 1. General physico-chemical properties and chromatographic performance characteristics of Sephadex LH-20
Matrix Bead form Average particle size Dry In methanol pH stability Working Cleaning Chemical stability Autoclavable Maximum linear flow rate Recommended linear flow rate Operating temperature Sample loading volumes Adsorption mode Molecular sizing Partition mode Exclusion limit
LH-20使用说明书
葡聚糖凝胶LH-20使用说明
适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。
结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。
因此使用中要考略几种色谱的作用机制。
最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。
上样量视被分离物的结构性能的差异而定－差异大，可大；差异小，应小。
凝胶过滤的上样量一般为6－8％的床体积，我们建议初次上样量控制在3％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。
（见附表“溶剂混溶性”）
流动相的常用溶剂为：
水甲醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加）。
使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态装柱，动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用的流动相体系平衡、上样
LH-20在不同溶剂中的溶胀性能：
溶剂混溶性表。
sephadex lh-20 的分离葡聚糖范围
sephadex lh-20 的分离葡聚糖范围
Sephadex LH-20 是一种常用的凝胶过滤材料，用于分离并提
纯生物大分子，包括蛋白质、核酸和多糖等。
对于葡聚糖来说，Sephadex LH-20 主要可用于分离和纯化大小适中的葡聚糖。
具体而言，Sephadex LH-20 适用于分离葡聚糖的范围一般是
分子量在1000到10000之间的葡聚糖。
较小的葡聚糖可能会
在透明小球中渗透或扩散，从而导致分离效果不佳。
较大的葡聚糖则可能无法顺利进入透明小球内部，也会影响分离效果。
需要注意的是，具体的适用范围也可能会因实验条件、溶剂体系、温度等因素而有所变化。
因此，在实际操作中，最好根据具体的实验目的和实验条件进行优化和确定。
sephadexlh20分离原理
sephadexlh20分离原理
首先是一个样品的制备，将样品以不同的形式提取出来，例如溶剂提取、或者是液相色谱法。
我们知道在液相色谱法中，由于需要将不同的化合物分离开来，所以我们一般是要将其进行萃取。
但是，我们也知道在液相色谱中，对于不同的化合物其极性是不一样的，而这也就是我们要对其进行分离的原因。
利用这个原理，我们可以很容易地将其进行分离。
接下来就是在液相色谱中需要使用的物质了，当我们对样品进行萃取时，我们需要将其进行处理。
而这个过程就是溶剂提取。
对于一些大分子物质（例如蛋白质）来说，它们会很容易从溶液中被提取出来。
而对于小分子物质来说就比较难了，例如糖类、脂类以及有机酸等。
这些小分子物质一般都是以溶解度很小的形式存在的，它们的溶解度非常低（例如脂肪）。
所以要将这些小
分子物质从溶液中提取出来是比较困难的。
而将它们从溶液中分离出来则不需要使用到溶剂，而是直接将其从液相色谱柱上进行洗脱就可以了。
—— 1 —1 —。
Sephadex+LH-20在天然产物提取中的应用
物、药用部位，以及采集时间，加工方法。
其次性状也是表述得非常细致和明确。
再就是鉴别、理化、检查、炮制、性味与归经、功能与主治、用法与用量、注意、贮藏等。
上述种种项目都是以质量为中心而展开的。
但只字未提产地。
３．１．２肯定药材好坏的唯一标准是质量，而不是生产地域。
但要生产出高品质、安全符合标准的中药材必须以传统生产、加工方法产出的地道药材，制定出质量标准：如指纹图谱作参照标准；而后严格按“中药材生产质量管理规范”制定出需引种中药材的操作规程，首先要确定原植物为正品，继而因地制宜地选择引入生产地的生态环境（土壤、空气及水源，气温、降雨、海拔、土质等）要与原产地相似。
再根据生长发育特性，制定从下种到采收、贮藏的时间、方法（如：打顶、摘蕾、修枝以及控制化肥、慎用农药）等操作规程。
３．２地道药材产地可以变迁３．２．１植物原产地并不一定会发展为生产中心，当今植物的生长地并不都是最佳适生地。
如大戟科的三叶橡胶Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ原产南美洲巴西国，新加坡植物与英国邱园合作把它引种到马来西亚、印度尼西亚、泰国、柬埔寨等东南亚国家，建立橡胶种植基地。
如今橡胶不仅成为该地区各国的支柱产业，而且竟发展成世界天然橡胶的生产中心。
另外，原产美洲的玉米、烟草、番薯如今已成为全世界大量栽培的作物，而且质量和产量都不比原产地差。
据记载，玉米引入我国已有４００多年，马铃薯已有３００多年的历史。
３．２．２药用植物引种成功的实例如西洋参Ｐａｎａ．ｒｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ原野生分布北美的加拿大和美国低山区．１９７５年开始在辽宁、吉林、黑龙江、陕西、江西、贵州、云南等省引种试种，１９８０初获成功，１９８６年全国共栽培４０余公顷，并取得１８７５～２０１５公斤／公倾的较高产量。
测定引种４年生西洋参总皂苷，分别在３．８％～４．８９％之间，与美国产４％相当。
目前已形成华北、东北、陕西等几个主要产区，产品供应市场，抽取市售和送检的８个样品，经高效液相（卜玎？Ｌｃ）法测定，人参皂苷Ｒｂｌ（岛４｝如０２３＞含量在１．２８％～３．６０％之间，均达到＜中国药典）２０００年版一部规定的Ｒｂｌ不得少于１．０％的质量标准。
Sephadex LH20
Sephadex LH20简介Sephadex LH20是一种价钱较高的填料，特点： 1、适合用有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济地大规模制备各种天然产物 2、结合凝胶过滤、分配色谱及吸附性层析于一身，分离结构非常相近的分子 3、载量可高达300mg样品/ml 凝胶，极少需要再生，分离效果可保持十几年不变。
Sephadex LH20 的原理Sephadex LH20的分离原理是根据分子大小，主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
Sephadex LH20 洗脱溶剂Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50%氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。
样品的处理和洗脱溶剂的选择如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
分离的技巧（1）流速不可太快，切切不可心急，所谓欲速则不达。
（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。
sephdex_LH-20在中药中的应用
作者使用Sephadex LH20纯化４０％的大豆异黄酮的浸提混合物，一步就可得 到纯度９０％以上的大豆异黄酮。
山奈酚 Kaempferol
几种黄酮类物质的分离
（上图：1. 芹菜苷配基 2. 漆黄素 3山萘酚） （下图：1.橙皮素 2.山萘酚 3. 槲皮素）
橙皮素 Hesperetin
Glycoside 甙
Rutin 芦丁
橙皮甙 (base)
甘草酸 Glycyrrhizic acid
芦荟甙
黄芩甙 Baicalin 苦杏仁甙 Amygdalin
•Sephadex LH-20以甲醇作为流动相
脂肪族、脂环族及芳香族化合物的洗脱顺序(P80)
•Sephadex LH-20以不同溶剂作为流动相的比较
当被分离化合物的极性差别是由羟基和羰基引起时，常用丙酮为流动相
三种不同对苯二甲酯的分离
Sephadex LH-20以不同溶剂作为流动相的比较
柱长: 1m 洗脱:丙酮 流速：2ml/min(P83)
3.红花中黄酮醇类成分的分离和鉴定(金鸣等)-----分离黄酮醇类(Vol.34 No.4,Apr.2003)
4.毛蕊老鹳草水溶性化学成分的研究(杜树山等)----分离莽草酸,芹菜素衍生 物.(Vol.34 No.6,Jun.2003)
5.华北大黄成分的研究(王爱芹等)----分离大黄酸和大黄素衍生物. .(Vol.34 No.8,Arg.2003)
凝胶色谱柱使用注意事项
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污染处理方法
• Sephadex LH20柱子被弄脏了，大
多数情况下是由于样品没滤, 将柱头 堵住,或由于样品的死吸附(一般很少 发生),使柱子的柱头部分污染。
• 一般的处理是将被污染的柱头部分的
填料弃去,具体做法很简单,只将被污
染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,
倒掉即可。
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• 使溶胀胶体积沉淀之后占总体积
的75%，上层溶剂占25%，这 时，悬浮液从一个容器倒入另一
容器时胶粒可移动。
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L•• H溶-剂20在溶m不胀l/同g体干积溶胶剂中溶的剂 溶胀溶性胀m体l/积g 能干胶
• 二甲亚砜 4.2-4.4
3.6
吡啶
4.0-4.3
3.5
水
3.8-4.2
般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过
床。
• 上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个
柱体积直到基线变得平稳为止。
• 如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的
溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器
的位置，如使用相同的溶剂，在以后的
层析中柱平衡可以完省整版p略t 。
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上样
• 一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯
甚至使一些本来可以分开的区带重叠。
如装柱时的操作压力太大，会使凝胶
床压得太实，从而降低流速。
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• 一般是在柱内先装入约1/3高度的水
或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅 拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使 其自然沉降。如此连续操作，可以得 到一个均匀的柱床。
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平衡
• 新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一
Sephadex LH-20 层析原理和应用基础
3
安玛西亚中国有限公司
摘自 Hans Henke 著 Preparative Gel Chromatography on Sephadex LH-20
出来，从而未分离。同样大小的最小的化合物在 V0 + Vi 最后洗脱也未分离。只有那些大小介于 最大的和最小的化合物的分子以分子量降低的次序洗脱。
表 2：溶剂的性质和物理数据*
我们将考虑对于不同溶剂作为流动相测定 V0 和 Vi 的方法，这对实际工作是很重要的。 所用的标准组件是“5 米”柱（内径=25/26 毫米），所用的流动相是甲醇、丙酮、二氯甲烷、 N-甲基吡咯烷酮、醋酸乙酯以及水。使用氯仿和四氢呋喃和其它溶剂主要限于 1 米柱（内径 25 毫米）。 流动相对分离的影响可以在 Sephadex LH20 上用不同的溶剂令人信服地证实。因此，改变 洗脱液1）可以明显提高或改进分离系统的选择性，并可以在很短的凝胶床上进行许多分离。在 29 页的图 6 表示在理想的球形填料中大为简化溶胀凝胶粒子。此图说明间隙和孔体积，其各种 的流动相的实验测定在下面讨论。
关于 B
分子筛或体积排阻层析（=SEC）是唯一发生在孔体积 Vi 内按分子大小(分子体积)降低的次 序的分离。在间隙体积 V0 内无分离能发生，因为大于凝胶最大孔的所有分子未加分离而被洗脱。
1) W.Winkle,Quantitative Analysis in the V0-Zone,A Quantitative Aprpooach by Coupling HPLC with GPC” in Chromatographia Vol.29.(1990)530.
相比，其它层析分离系统不能显示被分离物质的化学 / 分子结构和其保留行为之间如此多的相
关性。表 1 比较和对比了 HPLC 和 GPC 和 Sephadex LH20 观察到的分离机理。这种制成表对比
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Sephadex LH-20使用说明
Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。
例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。
制备凝胶悬浮液
Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。
在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。
1．在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。
2．使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。
3．将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。
平衡
上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。
洗脱液
为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。
样品
样品体积应该占柱总体积的1-2%，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um 的膜过滤。
洗脱
洗脱流速应根据情况而定，最大张性流速约12cm/min（反压1.5ba），建议流速为1-10cm/h。
总体来说，较低的流速，具有较高的分辩率。
再生
凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则需要重新平衡。
体积流速与线性流速的关系
线性流速=体积流速/横截面积
溶胀体积
由于Pharmadex LH-20的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。
新体积=旧体积×（新柱体积/旧柱体积）
胶的性质
Sephadex LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。
排阻极限4-5KD（与所用溶剂有关）
上样量
吸附模式取决于所需分辩率
分子量大小小于总体积的20%
正相分配小于总体积的1%
胶粒形状球形，多孔
颗粒大小（干）18-111um（直径）
颗粒大小中间值（干）70um（直径）
颗粒大小（甲醇）27-163 um（直径）
颗粒大小中间值（甲醇）103 um（直径）
最大线性流速720cm/min
参考线性流速60 cm/min
pH的稳定性
操作中2-11
清洗中2-13
化学稳定性在许多水溶液及有机溶剂系统中都稳定。
在pH2以下或强氧化剂中不稳定
高压灭菌121℃可忍受20分种
操作温度4℃到40℃
保存条件
新填料4-25℃（干燥）
使用后填料4-8℃，pH6-8，切勿冷冻，加入抑菌剂（如20%乙醇，0.04%叠氮钠）。