眼镜蛇神经毒素研究进展
眼镜蛇神经毒素研究进展作者：蒋世强潘能庆鄢航来源：《现代农业科技》2017年第04期摘要眼镜蛇毒神经毒素（Cobrotoxin，CT）是一种短链神经毒素，最早是从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到的。
因其在镇痛和抗癌方面有着显著的效果而成为研究的热点，本文通过对近年来CT的结构、药理作用、镇痛、抗癌研究进展进行综述，旨在为各位研究者提供基础参考资料。
关键词眼镜蛇；神经毒素；药理作用；体外表达中图分类号 R282 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0255-02Abstract The cobra venom neurotoxin（Cobrotoxin，CT） is a kind of short chain neurotoxin that is isolated from the Taiwan cobra venom at the earliest.Because of its significant analgesic and anti-cancer effect，CT is becoming a hot research.This article summarized the research progress of structure，pharmacological effect，analgesic and anticancer of CT in recent years，aimed to provide basic references for researchers.Key words cobrotoxin；pharmacological effect；in vitro expression眼镜蛇神经毒素（Cobrotoxin，CT）不但在镇痛作用上具有持久、无耐受性、无成隐性和不良反应少等优点，同时具有抗癌作用。
因此，其可开发成新型的镇痛药和抗癌药，应用前景广阔[1]。
1 眼镜蛇神经毒素的结构1965年，Yang等通过CM-cellulose柱和Sephadex G-25柱从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到一种棒状晶体蛋白，将其命名为神经毒素，其毒性为粗毒的6.7倍，并具有热稳定性，但是通过胰蛋白酶消化后活性丧失[2]。
CT的分子量约为7 KDa，由15种常见氨基酸组成，缺乏丙氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，其空间结构为三指形，分子结构中一端为4个二硫键形成的致密内核，由内核向外伸出3对互为平行的肽链成三指形展开，分子中4个二硫键分别为Cys3-Cys24、Cys17-Cys41、Cys43-Cys54、Cys55-Cys60[3-6]。
Yu等[7]研究发现CT的二硫键可以发生改变从而变成其同分异构体Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ，Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ二硫键分别变为Cys43-Cys55、Cys54-Cys60和Cys43-Cys60、Cys54-Cys55（图1）[8]。
2 眼镜蛇神经毒素的药理作用眼镜蛇神经毒素属于短链突触后神经毒素，能以极强的亲和力与突触后膜上的烟酰胺型乙酰胆碱受体结合，阻止神经-肌肉通路的去极化，阻碍神经冲动传导[9]。
若过量的CT将神经传导完全阻碍时，生物个体将会死亡，Meng等[10]从孟加拉眼镜蛇毒液中纯化得到的CT对小鼠的LD50仅为0.08 mg/g。
关于CT的作用机制及其作用的位点一直是研究的热点，许多研究工作者已经做了不少探究工作。
Chang等[11]对CT分子中的酪氨酸残基与其生物活性的关系进行了研究，发现Tyr-25残基的完整性在保持CT的活性构象中起着至关重要的作用。
Yang 等[12]研究发现，CT分子中精氨酸残基的修饰与CT的致死性和抗原性相关，Arg-30和Arg-33与CT的致死性有关，而Arg-30和Arg-36则与CT的抗原性有着密切关系。
此外，还有类似的研究发现，完整的Trp-29、His-32、Lys-47、Glu-21都对CT活性构象的保持起着重要作用[13]。
目前，尽管找到了不少可以改变CT活性构象的因素，但是还是没有确定CT的作用位点，因而其与乙酰胆碱如何结合的机制尚不清楚。
Aoyagi等[14]通过人工合成与CT相似的肽链并进行相关试验，能够得到一些与CT相类似的反应，并且合成肽具有CT 20%的毒性活性。
3 眼镜蛇神经毒素的研究与应用3.1 镇痛研究及应用眼镜蛇神经毒素的镇痛研究历史悠久，自从1965年CT从台湾眼镜蛇中分离纯化之后，CT的镇痛研究就开始了，因其在镇痛方面具有高效性、无耐受性、无成隐性、不良反应少而被广泛研究。
Chen等[15]的研究揭示了CT作用的机制。
CT主要是通过作用于乙酰胆碱受体，从而阻碍神经传导达到镇痛的作用，对于CT镇痛过程中发挥作用的位点至今还不确定，这也是今后的研究重点与难点，更是CT能否得到应用的关键点。
蛇毒镇痛的应用早在我国20世纪70年代就出现了，曾才铭[16]用云南动物研究所用眼镜蛇毒提纯的神经毒素制成的针剂克痛灵用于临床治疗慢性腰腿痛，共治疗了100余例，取得一定的效果。
同样的，蒲道学[17]将克痛灵用于治疗神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛共96例病人并且都取得了一定疗效。
这个名为“克痛灵”的蛇毒制剂的主要成分便为蛇毒神经毒素，CT便是其镇痛的主要成分之一。
尽管我国蛇毒制剂的应用当时得到一定程度的推广，但是这个名为“克痛灵”的蛇毒制剂并没有得到更好的发展和升级，最后被市场淘汰，导致其淘汰的主要原因有4个：其一，当时蛋白分离技术的限制，导致得到的蛇毒制剂中含有其他成分，从而导致蛇毒制剂的效果不一致，有时还会有较大的副作用；其二，对蛇毒制剂的检测及监管不到位，导致蛇毒假制剂四处横行，最终导致这个行业的没落；其三，蛇毒分离成本过高，分离过程中回收率低，损失较多，因而无法产生更廉价的商品；其四，蛇毒的作用机制研究进展缓慢限制了蛇毒的应用。
3.2 抗癌研究目前，CT在抗癌方面的研究报道还不像其镇痛报道那样多，不过在抗癌方面的研究并没有停止过，最近Shen等[18-19]报道了CT的抗癌作用，其研究结果显示，CT能够明显抑制A549细胞的体外生长，并且在CT作用过程中，通过激活P38-MARK信号通路上调细胞自噬的作用。
此外，CT还能抑制A549细胞在裸鼠体内转移。
尽管CT的抗癌研究还不够深入，但是从目前的研究报道来看，CT在抗癌的开发方面具有一定的潜力。
人们期待在CT的抗癌效果、范围、机制方面进行更深入的研究，以便为CT的抗癌应用打下坚实的基础。
4 眼镜蛇神经毒素体外表达的研究眼镜蛇神经毒素的克隆和表达始于20世纪90年代，主要得益于分子生物学的快速发展，越来越多的基因被克隆，以及克隆的效率越来越高。
对于CT的克隆与表达的研究目的主要有2个，一是为了方便对CT本身的研究，例如对其序列进行分析，或是对CT序列进行定点突变，再进行表达，从而确定某个点对CT的活性、结构的影响，Chang等[20]对特定的氨基酸进行改变，研究了单个氨基酸替换对整个分子结构的影响；二是为了获得CT蛋白，以便应用于实践中。
由于蛇毒资源有限、蛇毒分离成本高、蛇毒成分复杂药理作用不同，因而通过基因工程技术产生成分单一的蛇毒是破解这几个难题的重要途径，鄢航等[21-22]利用原核表达系统和真核系统对CT进行了表达，获得了该蛋白，并检测了其活性，结果发现，原核表达的CT 活性不理想，而真核表达的CT具有较好的镇痛活性，然而其采用的是昆虫细胞表达，尽管表达蛋白的活性及产量都还不错，但是该方法的成本较高，并不适合规模化生产[23-27]。
5 展望眼镜蛇神经毒素作为突触后神经毒素，有着非常好的镇痛效果及无成隐的优点，已经被研究了几十年，也取得了不错的成果，但是就目前情况来看，其镇痛的机制及体外表达还有待进一步研究。
人们期待早日在这2个方面取得突破性的成果，为CT的广泛应用铺平道路。
6 参考文献[1] 黄立峰，许云禄.蛇毒神经毒素的镇痛作用[J].福州总医院学报，2005（增刊1）：355-357.[2] 王重洋，颜培钢.眼镜蛇神经毒素药理作用实验研究进展[J].亚太传统医药，2009（8）：165-167.[3] YANG C C，CHANG C C，HAYASHI K，et al.Amino acid composition and end group analysis of cobrotoxin[J].Toxicon，1969，7（1）：43-47.[4] YANG C C，YANG H J，HUANG J S.The amino acid sequence of cobr-otoxin[J].Biochim Biophys Acta，1969，188（1）：65-77.[5] YANG C C，YANG H J，CHIU R H.The position of disulfide bonds in co-brotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1970，214（2）：355-363.[6] YANG C C.Structure and function of cobrotoxin[proceedings][J].Toxicon，1976，14（6）：421-422.[7] YU C，BHASKARAN R，CHUANG L C，et al.Solution conformation of cobrotoxin：a nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical simulated annealingstudy[J].BIOCHEMISTRY-US，1993，32（9）：2131-2136.[8] CHANG L，LIN S，CHANG C，et al.Disulfide isomerization within the C-terminus of cobrotoxin decelerates by thiol compounds and trinitrophen-ylation，but accelerates by modification of carboxyl groups[J].Arch Bioc-hem Biophys，1998，358（1）：164-170.[9] ENDO T，TAMIYA N.Current view on the structure-function relationship of postsynaptic neurotoxins from snake venoms[J].Pharmacol Therapeut，1987，34（3）：403-406.[10] MENG Q X，WANG W Y，LU Q M，et al.A novel short neurotoxin，cobr-otoxin c，from monocellate cobra （Naja kaouthia） venom：isolation and purification，primary and secondary structure determination，and tert-iary structure modeling[J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2002，132（1）：113-121.[11] CHANG C C，YANG C C，HAMAGUCHI K，et al.Studies on the status of tyrosyl residues in cobrotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1971，236（1）：164-173.[12] YANG C C，CHANG C C，LIOU I F.Studies on the status of arginine residues in cobrotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1974，365（1）：1-14.[13] 常梅艳，韩丽萍，蒋琳兰.眼镜蛇（Naja naja atra）神经毒素与心脏毒素分离纯化研究进展[J].药物生物技术，2009（6）：595-599.[14] AOYAGI H，YONEZAWA H，TAKAHASHI N，et al.Synthesis of a pep-tide with cobrotoxin activity[J].Biochim Biophys Acta，1972，263（3）：823-826.[15] CHEN R Z，ROBINSON S E.The effect of cholinergic manipulations on the analgesic response to cobrotoxin in mice[J].Life Sci，1990，47（21）：1949-1954.[16] 曾才铭.新药“克痛宁”治疗慢性腰腿痛80例疗效观察[J].云南医药，1980（1）：26-28.[17] 蒲道学.克痛灵治疗血管神经性头痛、坐骨神经痛、三叉神经痛共96例临床疗效观察[J].云南医药，1980（2）：37-39.[18] SHEN J，HE J，TANG X，et al.Role of autophagy on cobrotoxin induced cell death ofA549[J].Chinese Journal of Lung Cancer，2013，16（7）：339-344.[19] SHEN J，XIE Y，SUN M L，et al.Antitumor activity of cobrotoxin in human lung adenocarcinoma A549 cells and following transplantation in nude mice[J].Oncol Lett，2014，8（5）：1961-1965.[20] CHANG L S，CHEN K C，WU B N，et al.Expression and mutagenesis st-udies of cobrotoxin from Taiwan cobra[J].Biochem Biophys Res Comm-un，1999，263（3）：652-656.[21] 鄢航，杨秀荣，邓继贤，等.广西眼镜蛇神经毒素的原核表达[J].广东农业科学，2012（10）：145-147.[22] 鄢航.广西眼镜蛇CT和PLA_2基因的真核表达和镇痛活性检测[D].南宁：广西大学，2013.[23] 叶勇，邢海婷，郭亚.白藜芦醇二聚体与眼镜蛇神经毒素的作用机制[J].华南理工大学学报（自然科学版），2014（2）：21-26.[24] 郝永龙，陈美荣，黄铭.中华眼镜蛇神经毒素微球的制备及镇痛作用研究[J].中国药理学通报，2014（5）：676-679.[25] 郝永龙，陈美荣，刘启萍，等.眼镜蛇神经毒素配伍咖啡因镇痛作用研究[J].中国医院药学杂志，2010（7）：565-567.[26] 班建东，汤圣希.眼镜蛇神经毒素中枢性镇痛作用的研究[J].广西医科大学学报，2000（2）：192-194.[27] 高红瑾，许云禄，王少明，等.中华眼镜蛇神经毒素的活性研究[J].药学研究，2014（6）：315-318.。
眼镜蛇毒神经生长因子的提取及抗PC12细胞凋亡的研究的开题报告
眼镜蛇毒神经生长因子的提取及抗PC12细胞凋亡的研究的开题报告一、研究背景与意义眼镜蛇毒液中含有丰富的毒素，其中一些毒素被证明具有生物活性，可用于药物研发。
神经生长因子（NGF）作为一种神经胶质细胞分泌的重要营养因子，对神经系统的发育和维护具有重要作用。
因此，从眼镜蛇毒中提取NGF是一个有意义的研究方向。
同时，PC12细胞是神经系统的典型细胞系，在神经因子的研究中被广泛应用。
因此，探究眼镜蛇毒液提取的NGF对PC12细胞凋亡的影响，是一个有意义的研究。
二、研究内容与目标本研究的主要内容包括：1. 通过一系列的分离和纯化操作，从眼镜蛇毒液中提取NGF。
2. 研究提取的NGF对PC12细胞凋亡的影响。
3. 探究NGF对PC12细胞生长的影响。
4. 分析NGF的化学结构和特性。
研究的目标是：1. 成功从眼镜蛇毒液中提取出NGF。
2. 探究提取的NGF对PC12细胞凋亡的影响，为神经营养因子的应用提供参考。
3. 分析NGF的化学结构和特性，为进一步研究NGF的生物活性提供基础数据。
三、研究方法和步骤1. 眼镜蛇毒液的提取：采用超声波辅助方法将眼镜蛇毒液和提取液混合，离心去除固体杂质，最终得到纯净的眼镜蛇毒液。
2. NGF的分离和纯化：使用层析技术和电泳技术分离和纯化NGF，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法。
3. 研究NGF对PC12细胞凋亡的影响：将PC12细胞分为实验组和对照组，添加不同浓度的NGF，观察细胞的生长情况，并采用增殖试剂盒法、细胞周期分析和凋亡检测等方法，探究NGF对PC12细胞的生长和凋亡的影响。
4. 分析NGF的化学结构和特性：利用质谱分析、核磁共振等方法对NGF的化学结构和特性进行分析。
四、预期成果与创新点1. 成功从眼镜蛇毒液中提取出NGF，并获得纯净的NGF样品。
2. 探究提取的NGF对PC12细胞的生长和凋亡的影响，为神经营养因子的应用提供参考。
3. 分析NGF的化学结构和特性，为进一步研究NGF的生物活性提供基础数据。
眼镜蛇咬伤的中毒机制与治疗新进展
眼镜蛇咬伤的中毒机制与治疗新进展眼镜蛇，又名饭匙倩、蝙蝠蛇、胀颈蛇、吹风蛇、扁头风。
因其遇异常或被激怒时，颈部膨胀出现眼镜一样的花纹而得名。
眼镜蛇是我国剧毒蛇中分布最广的蛇种之一。
夏秋季节眼镜蛇咬伤多见。
眼镜蛇毒是以神经毒为主的混合毒素，眼镜蛇咬伤后可引起以神经系统损害为主要表现的多脏器功能衰竭，若不及时抢救，预后极差。
发病机制眼镜蛇是腺管牙类毒蛇，其毒是以神经毒为主的混合毒，即神经毒和血循毒。
眼镜蛇一次咬伤放毒量约为100.0mg(干重)，而致死量为15.0mg干重[1]。
神经毒素：眼镜蛇毒的神经毒素含量较高，占毒素干重的70%～80%。
是后突触α神经毒素，可与运动终板的乙酰胆碱受体结合，使运动神经末梢释放的乙酰胆碱对该受体不发挥作用(箭毒样作用)，从而导致骨骼肌松弛。
另外，通过磷脂酶A2作用于前突触，阻断神经肌肉传导，从而引起骨骼肌和心肌损伤。
由于眼镜蛇毒对神经肌肉传递阻滞，故可引起呼吸肌麻痹、缺氧、二氧化碳潴留、酸中毒等；还可作用于自主神经系统，抑制颈动脉窦化学感受器，使缺氧加重导致呼吸衰竭。
胃肠平滑肌兴奋性先增高，之后转为抑制，导致肠麻痹。
还可导致感觉运动障碍，患者肢体麻木无力，全身肌肉酸痛，眼睑下垂，视力模糊或者复视。
破伤风样毒素作用，致颈强直、张口、吞咽和发音困难等多方面的中毒症状。
血循毒素：由于眼镜蛇中多种成分，如精氨酸酯酶、蛋白水解酶、卵磷脂酶A2和舒缓肽增强肽等能破坏血管壁及肌肉组织，影响机体血管舒缩运动，锌金属蛋白激活凝血酶原形成凝血酶，促进血液凝固，在毛细血管内形成血栓，致血流缓慢，各器官组织缺氧。
加之蛇毒中的溶血素、抗凝血素、蛋白凝血酶等毒性物质，使血液内的红细胞溶解及毛细血管内皮细胞破坏，引起广泛溶血和出血。
眼镜蛇咬伤患者，局部肿胀疼痛，皮下瘀血，组织坏死。
可直接或间接损害心肌，导致心肌炎症，引起血循环障碍、血压下降、休克、心力衰竭。
蛇毒几乎对各个系统器官组织均有一定的毒性作用。
浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究
Sephadex C 25( 2. 5 cm 40 cm 和1. 5 cm 30 cm) 柱层 析, 用醋酸铵梯度洗脱, 浓度0. 05~ 1. 0 mol L , pH 5. 4~ 7. 0, 收集主峰, 再过 Sephadex G 50 柱( 1. 2 cm 70 cm) , 取主峰冻干, 即得纯化的 CNT 。 2. 2 纯度测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE) 法鉴定纯度[ 3] 采
[ 2] [ 6]
养殖场提供) 。丙烯酰胺系 Fluka 产品; 甲叉双丙烯 酰胺系 Serva 产品 ; CM Sephadex C 25 和 Sephadex G 50 均为 Pharmacia 公司产品 ; Ampholine 为 L KB 公司产品 ; 标准分子量为 Sigm a 公司产品 ; 醋酸 , 醋 酸钠 , 氯化钠等均为国产分析纯; 其他试剂均为国产 分析纯。 2 实验方法与结果 2. 1 浙江眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化 用浙江产眼镜 ( Naja naja atra) 蛇毒经两次 CM
- 1
, 95% 可信限 58~ 104 g kg
[ 6]
- 1
。
用酸性电泳系统 , 分离胶总浓度为 15% , 浓 缩液总 浓度为 3% , 电极缓冲液为 pH 4. 5, 0. 35 mol L 丙氨酸 醋 酸缓冲 液, 0. 25% 考 马斯 亮兰 R 250 染 色, 7% 醋酸脱色。经 PAGE 法鉴定, 纯化后的 CNT 为一条带 , 可达到电泳纯。见图 1。
表1 CN T 对小鼠扭体次数的影响 ( n = 20, x ! s )
小鼠扭体次数 25. 0 ! 4. 6 9. 1 ! 4. 9* 16. 5 ! 5. 7*
* [ 基金项目 ] 国家自然基金资助项目 ( 30371781) [ 作者简介 ] 李范珠 ( 1964- ) , 男 , 副教授 , 主研方向 : 药物输送 系统与新剂型 , T el: ( 0571) 86613524( O ) 。
眼镜蛇神经毒素药理作用实验研究进展
收稿日期 : 2009 05 12 作者简介 : 王重洋 ( 1973- ) , 女 , 黑龙 江哈尔滨人 , 医学硕士 , 苏州娄葑医院副主任医师 , 研究方向为 药物镇痛研究 。
!
165 !
第 5卷 第 8期 2009 年 8 月
亚太传统医药 A sia Pacific T raditio na l M edicine
V ol. 5 N o. 8 A ug. 2009
结果 , 这可能与不同种类的眼镜蛇有关。
效关系。广东眼镜蛇毒细胞毒素对小鼠移植肿瘤生命延长 率的影响在给药 5 次后观察载瘤小鼠生存时间, 广东眼镜 蛇毒细胞毒素用药组与生理盐水对照组比较, 生命延长率 为 23. 23% [ 16] 。中 华眼 镜蛇 毒 兔血 清 在体 外 显著 抑 制 H L60 细胞的生长, 其抑制作用随着剂量的加大而增强 , 高 剂量( 7. 5 mg/ mL) 的抑制效果相近于阿霉素 ( 5 g/ mL ) 。 中华眼镜蛇毒兔血清对正常人胚肺二倍体细胞增殖无抑 制。中华眼镜蛇毒兔血清 7. 5 mg/ mL 与 H L60 细胞共同 培养 48h 可诱导其细胞凋亡增加。中华眼镜蛇毒兔血清作 用 48h 后, H L60 细胞 bcl 2、 C myc 基因蛋白表达下调 。 杨惠玲等[ 18 19] 研究发现 , 中华眼镜蛇毒对体内外培养 的人高度分化鼻咽癌细胞株 ( CNE 1, CNE 2) 、 人慢性骨髓 性白血病和小鼠肝癌 ( H ep 2) 均有明显的细胞毒作用, 与 以上的肿瘤细胞系作用 24h 其半数抑制浓度 ( IC50 ) 依次为 79、 75、 5. 5、 65 g/ mL, 由此可知其中白血病最敏感 , 鼻咽 癌次之, 肝癌最弱。刘慰等也报道 , 中华眼镜蛇毒能使肝细 胞株 Bel 7402 细胞出现胞质蛋白交联、 细胞质破坏、 细胞 碎裂、 肝癌细胞株生长受到抑制、 与中华眼镜蛇毒浓度呈相 关。亦有研究者发现中华眼镜蛇毒对荷 S180 小鼠有抑癌 作用, 不同浓度的眼镜蛇毒均可使荷鼻咽癌裸鼠移植肿瘤 体积缩小。利用中华眼镜蛇毒膜毒素特异的膜破坏作用进 行免疫导向治疗鼻癌出现显微镜下癌细胞溶解、 死亡现象。
眼镜蛇神经毒素研究进展
眼镜蛇神经毒素(Cobrotoxin ,CT )不但在镇痛作用上具有持久、无耐受性、无成隐性和不良反应少等优点,同时具有抗癌作用。
因此,其可开发成新型的镇痛药和抗癌药,应用前景广阔[1]。
1眼镜蛇神经毒素的结构1965年,Yang 等通过CM-cellulose 柱和Sephadex G-25柱从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到一种棒状晶体蛋白,将其命名为神经毒素,其毒性为粗毒的6.7倍,并具有热稳定性,但是通过胰蛋白酶消化后活性丧失[2]。
CT 的分子量约为7KDa ,由15种常见氨基酸组成,缺乏丙氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸,其空间结构为三指形,分子结构中一端为4个二硫键形成的致密内核,由内核向外伸出3对互为平行的肽链成三指形展开,分子中4个二硫键分别为Cys3-Cys24、Cys17-Cys41、Cys43-Cys54、Cys55-Cys60[3-6]。
Yu 等[7]研究发现CT 的二硫键可以发生改变从而变成其同分异构体Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ,Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ二硫键分别变为Cys43-Cys55、Cys54-Cys60和Cys43-Cys60、Cys54-Cys55(图1)[8]。
2眼镜蛇神经毒素的药理作用眼镜蛇神经毒素属于短链突触后神经毒素,能以极强的亲和力与突触后膜上的烟酰胺型乙酰胆碱受体结合,阻止神经-肌肉通路的去极化,阻碍神经冲动传导[9]。
若过量的CT 将神经传导完全阻碍时,生物个体将会死亡,Meng 等[10]从孟加拉眼镜蛇毒液中纯化得到的CT 对小鼠的LD50仅为0.08mg/g 。
关于CT 的作用机制及其作用的位点一直是研究的热点,许多研究工作者已经做了不少探究工作。
Chang 等[11]对CT 分子中的酪氨酸残基与其生物活性的关系进行了研究,发现Tyr-25残基的完整性在保持CT 的活性构象中起着至关重要的作用。
Yang 等[12]研究发现,CT 分子中精氨酸残基的修饰与CT 的致死性和抗原性相关,Arg-30和Arg-33与CT 的致死性有关,而Arg-30和Arg-36则与CT 的抗原性有着密切关系。
眼镜蛇咬伤的中毒机制与治疗新进展
用清热解毒 草药 如半枝 莲加雄 黄一起 捣 烂， 外敷伤处 ， 口更换 １ 。伤 口溃 烂 每 次 有腐 肉者 ， 以％ － 丹撒 于溃 烂处 ， 外敷 红 油膏纱布 ， 待腐 脱新生 后改 用生 肌散 、 红
油膏外敷 。
眼镜蛇是腺管牙类毒蛇 ， 毒是 以神 其 经毒为主 的混 合毒 ， 即神经毒 和血 循毒 。 眼镜蛇一次咬伤放毒量约 为 １０ Ｏ ｇ 干 ０．ｍ （
竭 及 急 性 。功 能 衰 竭 而 死 亡 。 肾
治 疗
酰胆碱 对该 受体 不 发挥 作 用 （ 箭毒 样 作
用 ） 从 而 导 致 骨 骼 肌 松 弛 。 另 外 ， 过 ， 通
身 毒症状 消失 后 １～ ｝ １ ２天停药 ； 红卫 ②
蛇 药 ， 次 服 ６片 ， 口 ４次 ， 每 每 首剂 加 倍 。 西 医 治 疗 ： 抗 因 注射 液加 地 塞 米 普 松局部 环封 能 抑制 蛇 毒 的扩 散 、 少疼 减
痛、 对抗 炎痱 、 减轻过敏反应 ， 是早期 防治
局 部 反 应 的有 效 措 施 。
胰 蛋 白酶 的 局 部 应 用 ： 期 应 用 能 取 早
眼镜 蛇 ， 名 饭 匙 倩 、 蝠 蛇 、 颈 又 蝙 胀 蛇 、 风蛇 、 头 风。因其 遇异 常或 被激 吹 扁 怒 时 ， 部 膨 胀 出现 眼 镜 一 样 的花 纹 而得 颈
眼镜蛇毒是以神经毒为主的混合毒素 ， 眼 镜蛇咬伤后可 引起 以神经 系统损 害为 主 要表现 的多脏 器 功 能 衰竭 ， 不 及 时抢 若
救 ， 后极差 。 预
发 病 机 制
１１ｍ。咬伤处 有 麻痒 感 及 轻 度 的灼 痛 ．ｃ 和肿胀 ， 麻木感沿同侧肢体呈红丝线向心 扩散 ； 严重 时波 及对 侧 ， 亦可 出现 瘫 痪。
眼镜蛇神经毒素低分子量水解物的镇痛研究
1999-03-31收稿,1999-05-25修回。
广西科学Guang xi Sciences 1999,6(3):205～207,212眼镜蛇神经毒素低分子量水解物的镇痛研究The Analgesic Action of Low Molecular Catabolite from the -Cobrotoxin of Chinese Cobra Venom班建东 蓝秀万 舒雨雁 汤圣希Ban Jiandong Lan Xiuwan Shu Yuyan Tang Shengxi (广西医科大学蛇毒研究所 南宁市滨湖路6号 530021)(Snake Venom Research Institute,Guangxi M edical Univ.,6Binhulu,Nanning,Guangx i,530021,China)摘要 眼镜蛇神经毒素( -cobro tox in 或N T )经胃液水解后超滤得分子量<3000u 低分子量 -co br otox in 胃液水解物( -cobrot oxin fr agment ,N T F )。
该低分子量产物在小鼠热板及大鼠电尾嘶叫测痛实验,都显示出明显的镇痛作用,并有剂量—效应关系。
NT F 毒性比N T 明显降低,N T F 的镇痛显效时间比N T 提前,维持时间长,不产生耐受现象。
关键词 眼镜蛇 神经毒素 低分子量水解物 镇痛作用 吗啡中图法分类号 R 996.3Abstract The -cobrotox in,NT ,is the neurotox in from the venom of Chinese cobra,N aj a naj a atr a .T he -cobrotox in fragment,NT F,is the catabolite by the human gastric juice in vitro and is ultrafiltrated to obtain the fragm ent of low m olecular w eight less than 3000u.T he analgesic action of NTF w as tested by the hot-plate method for mice and the electric tail-stimulation m ethod forrats.Both analg esic methods demonstrated analgesic action and had a dose-effect relationship.The analgesic start-time of NT F w as quicker than the NT and the analgesic duration w as longer than the NT.T he toxicity of NTF w as low er than that of NT by means of LD 50for mice.It was no drug tolerance in successive doses daily for NTF in rat.Key words Chinese cobra, -cobrotoxin,low m olecular catabolite,analgesic action,morphine 眼镜蛇神经毒素( -cobrotox in)具有镇痛作用,连续小剂量给药可明显提高大、小鼠的痛阈。
眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究
华西药学杂志W C J ・P S 2007,22(3):247～249性 F I TC -insulin -5-Fu 对正常肝细胞和肝癌细胞的体外结合的研究发现,肝癌细胞组具有明显的荧光染色,而正常细胞未见明显荧光。
说明在体外,偶联物能够与肝癌细胞特异性的结合。
同时发现,偶联物与肝癌细胞的结合十分迅速,加药15m in 后,肝癌细胞即呈现出较明显的荧光,4h 时最大;48h 时,荧光强度基本稳定。
在测试4100mg ・m l -1～0104μg ・m l -1时,不同浓度荧光标记物的荧光强度无明显变化。
2 讨论体外细胞亲和性实验中,由于肝癌细胞上胰岛素受体高度表达,以胰岛素为靶向载体的偶联物能与其识别并被内吞进入细胞,从而呈现明显的荧光。
体外细胞毒性实验中,偶联物对正常肝细胞和肝癌细胞具有一定的选择性。
因为正常细胞不存在癌细胞上胰岛素受体的高表达;与原药组相比,偶联物的分子量增大,不利于其穿透细胞膜进入细胞内部;与癌细胞组相比,正常细胞的酰胺酶浓度较低,也不利于药物从偶联物上释放出来而产生毒性。
当12h 时,偶联物与原药的抑瘤效果好。
由于初期胰岛素主动靶向作用占主导,加速了药物进入细胞抑制肿瘤细胞生长。
随着时间的延长,insulin -5-Fu 与5-Fu 在细胞内外的量达到动态平衡,使两者在胞内的浓度基本一致,故抑瘤效果相同。
实验结果还证明,偶联物进入细胞后,由于细胞内酰胺酶降解胰岛素,可以释放出与原药具有同等抑瘤活性的5-Fu,保证了偶联物主动靶向的抑瘤效果。
高浓度的偶联物在体外的细胞毒性较大,可能是由于5-Fu 与胰岛素相连所引入的连接桥具有一定细胞毒性的缘故。
从胰岛素-5-氟尿嘧啶偶联物的体外细胞毒性和细胞亲和性的实验可以说明,以胰岛素为靶向载体的偶联物能够靶向到肿瘤细胞,在低浓度时即可达到与原药相近的抑瘤效果,且对正常细胞的毒性较小,但在高浓度时,则具有一定的细胞毒性。
参考文献:[1] Ler oith D,Charles T,Roberts JR.The insulin -like gr owth fac 2t or syste m and cancer [J ].Cancer Lett,2003,195(2):127-137.[2] Kurtaran A,L i SR,Raderer M ,et al .Technetium -99m -ga 2lact ocyl -neoglyco -album in combined with i odine -123Tyr(A14)insulin visualized human hepat ocellular carcinomas[J ].JNuclMed,1995,36(10):1875-l881.[3] Huang J,W ang J W ,Gong T,et al .Synthesis and charaterizati onof insulin -5-Fu conjugate,enable insulin as multi -drug carri 2er via dendritic app r oach [J ].Chin Che m Lett,2007,18(3):247-250.[4] 李勇,何竣,但德忠,等.异硫氰酸荧光素标记人血清白蛋白[J ].华西药学杂志,2001,16(1):25-26.[5] 李超英.肝靶向给药系统的研究及展望[J ].中国中医急症,2001,10(6):354-355.收稿日期:2006-11作者简介:朱天新(1973-),男,湖北襄樊,硕士,从事生物制品的研发工作。
眼镜蛇毒的化学成分研究进展
药物生物技术ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００４，１１（４）：２７１～２７３２７１眼镜蛇毒的化学成分研究进展甘茂罗１，张平２，谢平１，孙业兵１（】．江西中医学院中药化学教研室，江西南昌３３０００６；２．江西新余钢铁公司第一医院，江西新余３３８０１３）摘要眼镜蛇毒具有广泛的生物学活性。
文章综述了近年来眼镜蛇毒中研究较为深入的一些组分的分离提纯、理化性质及其生物活性等方面的研究进展。
关键词眼镜蛇毒；化学成分；研究进展中图分类号：Ｑ５１文献标识码：Ａ文章编号：１００５—８９１５（２００４）０４一０２７１一０３眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的一种天然毒蛋白，其化学成分非常复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性。
随着蛇毒毒理学、药物学、生物化学和分子生物学的发展，眼镜蛇毒的许多组分已得到分离纯化和序列测定，并广泛应用于理论研究和临床应用。
１眼镜蛇毒因子眼镜蛇毒因子（Ｃｏｂｒａｖｅｎｏｍｆａｃｔｏｒ，ＣＶＦ），又称为眼镜蛇抗补体蛋白（ＣｏｂｒａａｎｔｉｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｐｒＯｔｅｉｎ），是眼镜蛇毒中的主要抗补体成分。
ＣＶＦ是一种球状酸性糖蛋白，由ａ、８、ｙ３个亚基通过二硫键及其它非共价键的次级键相互联接而成［１］。
它的分子质量因提纯方法、分子质量的测定方法及眼镜蛇毒来源的不同而有所差异。
全分子ＣＶＦ的分子质量为１３００００～２３０ｏｏｏｕ，等电点５．２～６．２。
ＣＶＦ对温度有较好的稳定性，１０～６５℃稳定，６５℃以上迅速变性失活。
Ｃ＿、，Ｆ的氨基酸组成以酸性氨基酸为主，二级结构以ｐ折叠为主，占４７％，盯螺旋占１１％。
Ｃ、伊分子含寡糖链，经碳水化合物分析发现，糖的含量约占２．８％～７．４％，其中有较多的岩藻糖，极少有唾液酸。
ａ链有２～３个糖基化位点，Ｂ链有一个，７链则没有。
Ｇｏｗ斟２］等利用凝集素亲合色谱等方法分析了ｃＶＦ糖链部分的结构，其中大约８０％的寡糖链为含二种糖基的杂聚糖，１２％为３或４种糖基组成的杂聚糖，约８％为低聚甘露糖的形式，大多数的杂聚糖非还原端的４糖为：Ｇ山（１—３）ＧａｌＢ（１—４）［Ｆｕｃｄ（卜３）］ＧｌｃＮＡ邙１，该４糖结构是一旷半乳糖基化的Ｌｅｘ抗原，此结构在高等动物的正常组织中并不存在，而大量存在于肿瘤细胞中，是一潜在的肿瘤寡糖抗原。
蛇毒神经毒素的研究进展
药物生物技术Pharmaceutical Biotechnology2013，20（6）：564 568蛇毒神经毒素的研究进展李凤君1，2，韩丽萍2*，蒋琳兰2，李玉华2（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006；2.广州军区广州总医院药剂科，广东广州510010）摘要蛇毒神经毒素是蛇毒毒液中主要的毒性成分，是一种低分子质量的碱性多肽。
神经毒素因其能够治疗神经性疼痛、癌痛及神经硬化症等，应用于临床；而且是研究神经系统中神经递质的产生和传递过程分子作用机制的重要探针，神经毒素具有科学研究及临床应用的重要前景。
该文就各类神经毒素的研究进展状况及镇痛机制方面的研究作了综述。
关键词蛇毒；神经毒素；镇痛机制中图分类号Q51文献标志码A文章编号1005-8915（2013）06-0564-05蛇毒是毒蛇腺分泌的一种天然的蛋白质毒液，新鲜毒液呈蛋清样，具有特殊的腥味，其化学成分非常复杂，其中有5 15种酶、3 12种非酶蛋白质和多肽，以及少量的中性脂、磷酸和游离的单糖；无机盐钠、钾、锌离子含量较高，其次是钙、锰等离子［1］。
目前蛇毒中研究比较广泛的蛇毒组分是心脏毒素、神经毒素、磷脂酶、细胞毒素、神经生长因子及抗凝和促凝血毒素等。
其中神经毒素因其可以抑制神经肌肉之间的传递而应用于镇痛。
因此，蛇毒在科学研究及医药方面发挥着重大的作用。
1神经毒素概述蛇毒神经毒素是蛇毒毒液毒性最大的组分，能抑制中枢神经系统，尤其是延髓呼吸中枢，对周围神经系统的作用主要是阻断神经———肌肉接头处的冲动的传导，导致骨骼肌尤其是呼吸肌瘫痪。
可使动物产生松弛型麻痹和呼吸衰竭，导致动物死亡；使人类脑神经麻痹，表现为上睑下垂，视力模糊，呼吸困难，言语不清和面肌无力。
神经毒素主要存在于眼镜蛇科、海蛇科、金环蛇和银环蛇中，同时也存在于极少数的蝰蛇科和响尾蛇中。
从Chen和Ｒobinson及Brazil发现的蛇毒液中具有止痛作用的成分即是其中的神经毒素类开始［2］，进入研究神经毒素单体的时代。