单增李斯特氏菌2
单核细胞增生李斯特氏菌检验技术
•小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷
10mLLB2
TSA-YE
鼠李糖
TSA-YE
阳性
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定
革兰氏染色
单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强
革兰氏阳性短杆菌
动力试验
MR试验
一、单核增生李斯特氏菌概况
生物学特性
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，至少15min）和干热灭菌（160-170℃，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。
食品中单核增生李斯特氏菌检验
食品微生物检验技术
李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、 英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。
一、单核增生李斯特氏菌概况
李斯特氏菌属
革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;LM的幼龄菌（16~24h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。在22~25℃环境中形成4根鞭毛，故在25℃肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
食品微生物检验技术W4402单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备-2-微课件
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
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三、标准检测流程
1 增菌
分离
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
2
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3 初筛 鉴定 4
5 结果与报告
综合生化试验和溶血试验结 果，报告 25 g（mL）样品 中检出或未检出单核细胞增 生李斯特氏菌。
A. 单增李斯特氏菌，在靠近
金黄色葡萄球菌接种端 溶血增强。 B. 斯氏李斯特氏菌溶血也 增强。
C. 伊氏李斯特氏菌在靠近马 红球菌接种端溶血增强。
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
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单增李斯特菌 斯氏李斯特氏菌 伊氏李斯特氏菌
马红球菌
金葡
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
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空白对照
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
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三、检测标准流程
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
局部放大的菌落
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三、检测标准流程
显色培养基：
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
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三、检测标准流程
③初筛：
木糖、鼠李糖发酵管
TSA-YE 平板划线纯化
选择性琼脂平板
干制生化鉴定试剂盒 单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
半固体动力培养
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1、简述单增李斯特氏菌的检 测基本步骤？
2、简述增菌液的配制过程。
单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备
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智慧职教 /portal/
校本资源库 / 参考网站： /
三、检测标准流程
①增菌培养： 无菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋中加225mL
单增李斯特氏菌
单增李斯特氏菌
单核细胞增生李斯特菌 (L.monocytohenes)
潜伏期：在感染后3-70天出现症状，健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。
在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2分钟以上。
李斯特氏菌。
该细菌喜冷不爱热，如果人被感染，将有三成的病死率。
李斯特氏菌。
此菌的特性是喜冷怕热，在低温环境中可大量繁殖。
人们习惯于把电冰箱当作食品的保险箱，将一次吃不完的食物随手放进冷藏室，未经加热消毒就食用，这是李斯特氏菌的一种重要传播途径。
人感染该菌后多表现为脑膜炎、败血症，孕妇感染则可引起流产、早产、死胎和新生儿败血症。
在夏季每个家庭都要格外注意饮食卫生，电冰箱要定期清洗，存放的食物要生熟分开，熟食在食用前要加热消毒，温度必须达到70℃以上且持续2分钟以上。
健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，
4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。
人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。
该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。
单增李斯特菌使用说明
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h
储存温度：-‐80℃
基 因 组 ：
单增李斯特菌
简 介 ：
斯特菌（学名：Listeria monocytogenes），又名单核球增多性李斯特
菌、李氏菌，是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌症的病原体。李斯特菌是
革兰氏阳性菌，属厚壁菌门。它主要以食物为传染媒介，是最致命的食源
性 病 原 体 之 一 。
操 作 说 明 ：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
单增李斯特菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00470
单增李斯特菌
单核细胞李斯特氏菌检验原始记录第二法平板计数法
1.1—计算系数；
d一稀释因子（第一稀释度）。
结果报告（根据公式计算结果,报告每g（m1）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU∕g（m1）表示；如T值为0,则以小于I乘以最低稀释倍数报告。）
报告人报告日期复核人复核日期
培养基及试剂：
缓冲葡萄糖蛋白陈水：m1配制日期：
李氏增菌肉汤1B：m1配制日期：
李斯特氏菌显色培养基：m1配制日期：
实验过程：
1.样品稀释：
根据样品状态，无菌操作，称取25g∕吸取25m1样品，加入到装有225m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌均质袋中均质，制成1:10样品匀液。
用Im1无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液Im1,沿管壁缓慢注于盛有9m1缓冲葡萄糖蛋白陈水或无添加剂的1B肉汤的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支In1I无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
3.培养
在通常情况下，涂布后，将平板静置10min,如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36C±IC培养Ih;等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36℃±IC培养24-48hJ_/__/时〜_/_/时）
典型菌落计数和确认：注：“一”表示在选择性平板中无可疑菌落生长。
样品编号
菌落特征以产品说明为准
第一稀释度：
d）所有稀释度的平板菌落数大于150CFU且有」
e）所有稀释度的平板菌落数均不在15CFU~150CF时，应计数最接近15CFU或150CFU的稀释度平标
收，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15CFU~150CFU
）CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；
单增李斯特氏菌说明书安全操作及保养规程
单增李斯特氏菌说明书安全操作及保养规程一、引言单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食品中毒病原菌，可引起人类严重的感染。
为了确保操作过程的安全性和实验结果的准确性，本文档将介绍单增李斯特氏菌的安全操作和保养规程。
二、实验前准备1.工作区域：选择干净整洁、通风良好的实验室，并确保无人员流动和非实验人员进入实验区域。
2.实验器材：准备好需要使用的培养皿、试管、移液器、离心机等实验器具，并进行消毒处理。
3.个人防护措施：穿戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。
三、操作步骤1.培养基准备：根据实验需求，制备适当培养基，并严格按照配方进行配置、混合和消毒。
2.菌株接种：取一支保存有单增李斯特氏菌的细菌种子液，并使用无菌的移液器将其接种到培养基中。
3.培养条件：将接种好的培养基置于恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。
根据具体需要，可以选择不同的培养条件。
4.培养时间：根据菌株的生长特性和实验目的，设定适当的培养时间。
在培养过程中，定期观察培养基的变化情况。
四、实验后处理1.菌株保存：实验结束后，将培养好的菌株进行分装并保存。
使用无菌的容器和保护液，防止菌株失活或变异。
2.器材清洗：实验器材需要彻底清洗，以防止交叉污染。
使用适当的消毒剂和清洁剂，对实验教具进行彻底清洁和消毒处理。
3.工作区清理：清理工作区域，包括实验台面、废弃物和其他杂物的清理。
确保实验室的环境整洁，以减少潜在的污染风险。
五、安全注意事项1.个人防护：在实验操作过程中，要正确佩戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。
2.实验环境：选择合适的实验环境，保持实验室的通风良好，并避免非实验人员进入实验区域。
3.消毒处理：在实验前后对实验器材、工作区域进行彻底的消毒处理，以减少交叉污染的风险。
4.废弃物处理：将实验中产生的废弃物，如培养基、菌株等，正确处理和清理，并根据实验室的要求进行垃圾分类处理。
单增李斯特菌
市场情况
1999年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食 品而引发的最严重的食物中毒事件，据美国疾病控制和防 治中心资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被该菌污 染的“热狗”和熟肉而死亡，在另外22个州97人患此病，6 名妇女流产。1992～1995年法国出产的奶酪及猪肉中发现 李斯特菌。2001—2009年以来，我国质检部门多次从美国、 加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等20多家肉类加工 厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等30多批近千吨猪副产 品中检出单增李斯特菌、沙门氏菌等致病菌。为了解北京 市食品受单核细胞增生性李斯特菌污染状况，2004—2005 年间，崔京辉等从北京市几个市场及宾馆饭店共采集了270 份熟食、生肉制品、水产品等8类食品进行检测LM。
（4） PCR试剂盒
1）北京吉诺思科贸公司：美国伯乐iQ-Check单增李斯特 菌的检测：iQ-Check系统采用了所有的实时荧光PCR方法 的优点为食品中病原微生物提供快速和可靠地检测解决方 案。iQ-Check试剂盒为食品和环境样品中的单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes)定性检测试剂盒。 2）陆桥： 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）荧 光定量PCR检测试剂盒 报价：1680 48T 3）索奥： 单增李斯特菌(LM)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 报价：2800 40T
在美国LM被列为7种主要的食源性致死病菌之一,已经被 WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病原菌之一。
二、单增李斯特菌的检测方法
（1）食品安全国家标准：单核细胞增生李斯特氏菌 检验 （2010年最新）平板培养法
2007年食品中单增李斯特菌国 家标准检验方法实验 室验证及结果分析：用不同浓度的沙门菌菌悬液人 工染菌二类食品各40份，用增菌液两步增菌，两种 分离培养基分离，对比检出率及分离效果。检出率 62．5％，最低检出限为0.5cfu/25g-13cfu/25g。
单增李斯特菌检测技术
CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差
L.M在PALCAM培养基生长特征
L.M在OXA培养基生长特征
单增李斯特菌在科玛嘉李斯特显色培养基上 的菌落形态
染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 利斯特菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为0.4～ 0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻 滚样的运动。
单增李斯特菌溶血反应 阳性对照：CMCC54004、
CMCC54007 阴性对照：英诺克李斯
特菌（Lin） L1：（-）；L2、L3、L4、
L5：（+）
协同溶血试验 (cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红
球菌 (R.equi), 在它们中两者之间垂直接种
可疑利斯特菌, 但不要触及它们, 于30℃培 养24h～48 h, 检查平板中垂直接种点对溶 血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的 单核细胞增生李斯特菌的溶血增强, 斯氏李
加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌 病暴发，导致十几人死亡。很多国家都已经采取措 施来控制食品中的单增李斯特氏菌，并制定了相应 的标准。
形态与染色
革兰氏阳性小杆菌，长 0.5~2 μ m ，宽 0.4~0.6 μ m，直或稍弯，常呈 V 字形，成对 排列。
无芽胞，一般不形成荚膜。
22~25 ℃环境中形成 4 根鞭毛，运动活泼； 32 ℃时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。
腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，观察小 鼠死亡情况。致病株于2～5d 内死亡。 试验时可用已知菌作对照。单核细胞增
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单增李斯特氏菌
一、单增李斯特氏菌是什么
单核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogens，以下简称单增李斯特氏菌)是李斯特氏菌属的8个菌种中对人类致病的力最强的菌种，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定致病性，其余李斯特氏菌均无致病性。
单增李斯特氏菌是一种革兰氏阳性小杆菌，有13种血清型，其中1/2a，1/2b，4b是最常见的食物中毒型别。
其引起的食源性李斯特菌病相对少见但十分严重，是致死率非常高的食源性致病菌。
单增李斯特氏菌在0℃～45℃都能生存，生命力非常顽强，在冰箱的冷藏温度4～6℃下仍可以大量生长繁殖，这意味着食物在冰箱内冷藏也无法将单增李斯特氏菌置于死地，也是该菌不同于其他食源性致病菌的重要特征。
二、危害、典型症状、易感人群
单增李斯特氏菌感染分两种：
(1)肠道型感染。
肠道型的潜伏期很短，通常从食入污染食物的8～48小时，病人会出现发热、肌肉酸疼、恶心、呕吐等症状，几天即可痊愈。
(2)侵袭型感染。
侵袭型的潜伏期非常长，2～12周。
单增李斯特氏菌入侵神经系统和循环系统，引起严重的脑膜炎和败血症，发病率虽低，病死率却高达30％～70％。
单增李斯特氏菌是一种细胞内寄生菌，人体主要靠细胞免疫功能对其进行清除，因此，易感人群为免疫系统未发育完全或有缺陷的新生儿、孕妇、慢性病患者、老年人等。
其中，孕妇感染李斯特氏菌本人只会表现出轻微感冒症状，但却能引起胎儿感染，造成胎停、流产等严重后果，据统计约1/3的感染孕妇会发生流产。
三、最常见的污染食品
单增李斯特菌广泛分布于自然界，在土壤、污水、粪便、植物、饲料、原料乳中都能被离出。
WHO的调查表明，4％～8％的水产品、5％～15％的乳及乳制品、30％的肉及肉制品均被单增李斯特氏菌污染。
同时，该菌还能寄居在人类肠道中，一般人群粪便带菌率为2～10％。
我国近几年食品安全风险监测结果显示，单增李斯特菌在生肉和即食食品中污染率最高。
单增李斯特氏菌通过食物污染传播，经消化道感染。
引起中毒的原因往往是食用未经彻底加热的污染食品。
例如冰箱内冷藏的牛奶、冰淇淋，若受到生肉表面李斯特氏菌的交叉污染，取出直接食用就会导致食物中毒。
四、流行状况
1 / 2。