神经生物学实验讲义
神经生物学课件chapter5A
⑵色觉
色觉是感光细胞受到不同波长的光线刺激后,产 生的视觉信息传入视觉中枢引起的主观感觉。
19世纪初,Young和Holmholtz依据物理学上三原色混合理 论提出了视觉三原色学说：
若红、绿、蓝三种视锥细胞兴奋程度=1∶1∶1→白色觉; 若红、绿、蓝三种视锥细胞兴奋程度=4∶1∶0→红色觉; 若红、绿、蓝三种视锥细胞兴奋程度=2∶8∶1→绿色觉。
(一)听觉器官及听觉传导路 1. 听觉器官
外耳
中耳
内耳
2.声波在耳内的传导途径
2.声波在耳内的传导途径
A.正常情况下，声波在耳内的主要传导途径：（气体传导）
声波
前庭窗
外耳门 外耳道 前庭阶外淋巴
鼓膜
听骨链 蜗孔
蜗窗
前庭膜 蜗管内淋巴 基底膜 螺旋器
毛细胞兴奋 鼓阶
声波在耳内的传导途径
一.视觉
1.视觉器官及视觉传导路： 2.光感受器及其换能机制 3.视网膜内的信息处理 4.外侧膝状体的功能 5.视觉皮层
眼球的结构
眼球壁：外膜：包括角膜和巩膜
中膜：包括虹膜，睫状体和脉络膜
内膜：包括视网膜的盲部和视部
（黄斑，中央凹，视神经盘）
内容物：房水
晶状体
玻璃体
(三)眼的调节
（二）听觉器官对声音的感受和分析
B.行波学说：当声音振动→中耳听骨链振动
→卵圆窗振动→前庭阶外淋巴+基底膜上下振 动，以行波方式从蜗底向蜗顶传播,同时振幅 也逐渐加大,到基底膜的某一部位,振幅达到最 大,以后则很快衰减。基底膜的最大振幅区为 兴奋区,该部位的毛细胞受到刺激而兴奋,从而 引起不同音调的感觉。蜗底的基底膜窄与高频
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2、神经嵴细胞固有信息与神经嵴细 胞的分化
神经嵴细胞的分化也存在内、外因两方面 的因素。真正决定嵴细胞分化大方向的仍 然足神经嵴细胞本身所固有的信息。
神经嵴细胞固有信息的表达必然受到所迁 入的微环境的深刻影响。局部微环境在引 导、加速或者逆转，抑制嵴细胞固有特征 表达的过程中有首要作用。因而，神经脊 细胞的分化方向是嵴细胞内、外因素相互 作用的结果。
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2、神经脊研究历史
像胚胎学或者发生学本身的发展历史一样，对神经脊研究 的历史也可大致分为描述胚胎学、实验胚胎学与现代胚胎 学（发育生物学）3个互相重叠的时期。
第一期是从His到1900年。主要是论证神经脊的来源与基 本衍生物。
第二时期可称作实验胚胎学时期。从1900年到上世纪60 年代。此时期证实了神经脊细胞的多潜能性，它的衍生物 在所有经典的3个胚层的衍生物中均有同源物。
有特殊的功能。从较低等的哺乳动物到灵 长类，大脑皮质的结构与功能的变化趋势 是由简单到复杂。 从大脑皮质的进化过程了解到大脑皮质的 组织发生，其中的神经元数量（尤其是中 间神经元）和神经元间局部环路显著增加 以及组织结构显得高度有序和复杂。
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大脑皮质的神经元发生部位是在脑室的生发层 ( ventricular germinal zone)，也称脑室层 （telencephalic ventricular zone，图101A)．其中的细胞称为神经上皮细胞 (neuroepithelial cell）或称为神经祖细胞 (neurogenitor cell)。大脑皮质的组织发生是通 过神经祖细胞的分裂、增生和分化过程实现的。
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5. 生物芯片技术（biochip） 生物芯片技术是在1个平方厘米大小的薄型载体上，
通过微加工技术获得微米级结构，并与生物化学处理 等技术相结合而发展起来的一种新型技术。它可以把 多至几十万个的生命信息集成在一块芯片上，进行各 种与生命科学和医学相关的生物化学反应，对基因、 蛋白、活体细胞及组织等进行分析和检测。
免疫组织化学方法—把神经元的功能与其神经递质的 分析熔为一体。
组织培养、细胞培养—把复杂的神经元回路还原成简 单的单元进行分析。
新的电生理技术和分子生物学方法（重组DNA技术等） －神经信号发生、传递的基本单元-离子通道的结构、 功能特性及运转方式；神经递质的合成、维持、释放 及与受体的相互作用。
(2) 诱发电位有一定的类型，是由于诱发电极和记录 电极记录神经元群相对位置影响电位的波形。
(四)生物化学方法
1. 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)
用抗原－抗体反应原理，将抗原标记上放射性同位 素，用来测定与此抗原性质相同的物质。RIA包括以下 基本步骤：样品采集、加样、反应、分离、测定抗原－ 抗体复合物的放射性（cpm）, 与标准曲线对照计算待测 物质含量。
4. 基因敲除(gene knockout) 基因敲除是80年代初出现的一项新的基因工程技术。
采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取 代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物,即 为基因敲除动物。通过分析基因敲除动物单基因缺陷来研 究基因调控、基因功能、建立疾病模型、药物作用及基因 治疗。
液中选择性地大量扩增某一种核酸分子的特定序列。该方法 具有极高的灵敏度和特异性，在含有多种杂质的条件下，可 选择性扩增细胞基因组中一个特定的DNA片段达数百万至数 千万倍。
第五章学习与记忆的神经生物学演示文稿
第三节 学习与记忆的神经基础
一、参与学习与记忆的脑结构 （一）海马与学习记忆 （二）杏仁核和学习记忆 （三）间脑与记忆加工 （四）联合皮层与学习记忆 （五）小脑的学习与记忆功能
二、记忆的痕迹理论 三、脑的记忆系统
（一）陈述性记忆的神经回路 （二）非陈述性记忆的神经回路
（一）海马与学习记忆
（一）学习类型 （二）记忆类型
（一）学习类型
1、联想式学习（联合型学习）：指刺激和反应之间建立联
系的学习，即由两种或两种以上刺激所引起的脑内两个以上的中枢 之间的活动形成联结而实现的学习过程。
典型的联合型学习：尝试与错误学习、经典条件反射和 操作性（工具性）条件反射
2、非联想式学习：在刺激和反应之间不形成明确联系的 学习形式。 典型的非联合型学习：习惯化和敏感化。 （1）习惯化：指当一个不具有伤害性刺激重复作用时， 机体对该刺激的反射性行为反应逐渐减弱的过程。 （2）敏感化（假性条件化）：强的刺激引起一定的伤 害后，同类的弱刺激引起反应增强的现象 。
海马在学习记忆中的功能
（1）海马对建立环境的空间位置记忆有特殊 作用，
（2）海马在考察环境刺激的耦合关系中起主 要作用。
（3）海马和杏仁核是感觉体验转化为记忆的 关键部位。
（二）杏仁核和学习记忆
（1）把感觉体验转化为记忆的另一关键部位。 （2）在记忆汇合过程中有重要作用。
（三）间脑与记忆 加工
发现，损毁海马结构， 并不影响已建立的瞬膜 条件反射，但损毁小脑 皮层，则完全不可能建 立瞬膜条件反射，已训 练好的反射也会消失
二、记忆的痕迹理论
1949年，加拿大神经心理学家Hebb（赫布）提出了 记忆痕迹理论。
内容：短时记忆的脑机制是脑内神经元快速形成的反 响回路；长时记忆的生理机制可能是脑内逐渐形成的 生物化学与突触结构形态的变化。这种理论认为：短 时记忆是脑内神经元回路中电活动的自我兴奋作用所 形成的反响振荡，这种反响振荡可能很快消退，也可 能由外部条件促成脑内逐渐发生着化学的或结构的变 化，从而使短时记忆发展成长时记忆。
神经生物学实验
体激活后第二信使、G 蛋白、膜离子流、调控蛋白及
产生磷酸化和脱磷酸化等各种反应的酶变化；
图 2 LTP 电位示意图
⑶突触前或突触后结构的可塑性，包ห้องสมุดไป่ตู้突触前树突棘体积增大，数目增多 ，
突触界面扩大及突触后致密物质增大增厚等；
⑷非神经元修饰：如胶质细胞及胶质-神经元相互作用的变化；
⑸上述某些变化或所有变化的综合表现。
（蔡 葵）
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实习二 大鼠海马 LTP 的实验观察
1. LTP 的基本概念
LTP(long-term potentiation, 长时程增强), 对突触前神经元进行高频强直
电刺激后导致突触后神经元产生突触传递效应增强的现象，该效应可持续一
个小时以上，其具体表现为：
①峰电位幅值增大；
②潜伏期缩短；
③兴奋性突触后电位(EPSP)幅值增大；
兔脑：兔的头部固定在脑定位仪上时，其前囟(Bregma，即冠状缝与矢 状缝的交点)比λ(人字缝与矢状缝的交点)高 1.5mm，在这种情况下，以通过 前囟的水平面作参考平面，而以在该平面下 12mm 处的水平面作为水平标准 平面(HO, 零平面)，在此平面上方为 V+，在此平面下方为 V-。经过前囟并 与矢状缝垂直又与水平面垂直的面，作为额面标准平面(APO)，在此平面之 前为 AP+，在此平面之后为 AP-。
单管玻璃微电极是一根尖端开口很细的硬质玻璃管，内充电解质溶液作 为电极。由于电解质溶液可以导电，利用单管玻璃微电极可以记录到中枢神 经系统神经元的电活动。用于细胞内记录的微电极，其尖端直径应小于 0.5mm，尖端的倾斜度应相当缓和，以免穿入细胞膜时造成大的伤害。这种 微电极适合于从细胞内引导电活动和测量膜电位。用于细胞外记录的微电 极，其尖端直径约在 1~5mm。一般认为尖端内径 1~4mm 的玻璃微电极适宜 于记录神经元胞体的电活动。微电极的长度应视需要而定，但插入脑组织内 的部分不宜太粗，以免插入时造成显著的损伤。制作玻璃微电极应选用熔点 高，化学稳定性高，电阻率高和膨胀系数低的硬质玻璃管。国外常用 Pyrex 玻璃管，国内一般采用 GG17 和 95 玻璃管。 3.3.2 多管玻璃微电极
神经生物学的常用研究方法ppt课件
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多克隆抗体 （polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。
单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）
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组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
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研究方法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。 可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原 blue labelling neurons
DRG
Spinal cord
20×
20×
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Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina
20×
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优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。 缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。 应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。
神经生物学-突触ppt课件
EPSP总和达阈电位，爆发动作电位
（ 2）抑制性突触后电位（inhibitory postsynaptic potential，IPSP）
突触前膜释放抑制性递质→作用于突触后膜的受体 →后膜上的Cl-通道开放→Cl-内流→超极化(抑制）
（四）突触后神经元在产生动作电位时的运算过程
突触后膜的电位改变取决于同时 产生的EPSP和IPSP的代数和。
1. 对递质释放的调制： 递质释放量主要取决于进入末梢的Ca2＋量。 突触前抑制、突触前易化、强直后增强、习惯化、敏感化均可改变 突触前膜的Ca2＋内流量，从而影响递质释放量。 突触前受体：某些神经递质或调质可作用于突触前膜的受体，促进 或抑制递质的释放。 2. 对后膜受体的调制： 受体上调(up regulation)：递质或激素↓→受体数量↑亲和力↑ 受体下调(down regulation)：递质或激素↑ →受体数量↓亲和力↓
兴奋性突触和抑制性突触传递的比较
兴奋传至神经末梢 ↓ 突触前膜去极化 ↓ 前膜电压门控式Ca2＋通道开放 ↓ Ca2＋进入突触前膜 ↓ 兴奋性递质通过出胞作用释放到突触间隙 ↓ 递质作用于突触后膜的特异性受体或 化学门控式通道 ↓ 突触后膜上Na＋或Ca2+通道开放 ↓ ＋ 2+ Na 或Ca 进入突触后膜 ↓ 突触后膜去极化 (EPSP) ↓ 总和达阈电位 ↓ 动作电位(兴奋） 兴奋传至神经末梢 ↓ 突触前膜去极化 ↓ 前膜电压门控式Ca2＋通道开放 ↓ Ca2＋进入突触前膜 ↓ 抑制性递质通过出胞作用释放到突触间隙 ↓ 递质作用于突触后膜的特异性受体或 化学门控式通道 ↓ 突触后膜上Cl－通道开放 ↓ － Cl 进入突触后膜 ↓ 突触后膜超极化（IPSP） （抑制）
Three synaptic junctions, 2 are stimulatory, 1 is inhibitory.
神经生物学实验指导
实验9-3 脊髓背根与腹根的机能【目的要求】1.学习暴露脊髓和分离脊神经背、腹根的方法。
2.了解背根和腹根的不同机能。
【基本原理】脊神经的背根是由传入神经纤维组成，具有传入机能；腹根由传出神经纤维组成，具有传出机能。
若切断背根，则相应部位的刺激不能传入中枢；若切断腹根，不能传出冲动，则其所支配的效应器也不再发生反应。
【动物与器材】蟾蜍或蛙、常用手术器械、金冠剪、弯头金冠剪、刺激器或多用仪、小型弯头露丝电极、蛙板、蛙腿夹、滴管、棉花、红色和白色细丝线、任氏液。
【方法与步骤】1.将蟾蜍或蛙毁脑后腹位固定于蛙板上。
沿背部中线剪开皮肤，向前开口至耳后腺水平，向后开口至尾杆骨中段。
用剪刀小心剪去脊椎两侧的纵行肌肉及椎间肌肉，暴露椎骨。
2.用金冠剪横向剪断环椎，然后将弯头金冠剪小心伸入椎管，自前至后逐节剪断两侧椎弓（图9-3），移去骨片，暴露全部脊髓（勿损伤脊髓）。
3.用眼科镊轻轻挑开脊髓表面的银灰色或黑色脊膜，再用任氏液冲洗马尾部，小心识别第7~10对脊神经背根和腹根（图9-4）。
用玻璃分针分离一侧第9对脊神经的背、腹根（背根近椎间孔处有淡黄色、半个小米粒大小的脊神经节），将背根穿两条白色丝线，腹根穿两条红色丝线备用。
放松两后肢即可进行实验观察。
（1）提起白丝线，轻轻用刺激电极钩起背根，打开刺激器，用较弱的单脉冲刺激背根(只引起同侧后肢抖动)，记录结果。
（2）用同样的方法刺激腹根，记录结果。
（3）将两条白线双结扎背根后从中间剪断神经，分别刺激其中枢端和外周端（刺激强度不变），记录结果。
（4）用同样的方法结扎并剪断腹根，重复刺激背根中枢端，记录结果。
（5）分别刺激腹根中枢端和外周端，记录结果。
【思考题】根据实验结果，说明背根和腹根的机能。
（赵静）生理学实验第二版P148-149实验9-4 损伤小白鼠一侧小脑的效应【目的要求】一侧小脑损伤后的动物，躯体运动表现异常，通过对异常运动的观察，了解小脑的运动机能。
【基本原理】小脑具有维持身体平衡，调节肌紧张和协调肌肉运动等机能。
神经生物学常用研究方法PPT课件
加尔（19世纪初 ）：德国的解剖学家，专门从事颅骨和脑 的研究。颅相学指分析人的心理与头颅形状之间关系的理 论学说。加尔从小就喜欢观察人的外表（尤其是颅骨外表） 同心理的关系。例如，他根据个人长期的个案观察，发现 眼睛明亮的人，一般记忆力较好；头骨隆起的人，可能象 征着贪婪的脑机能，是监狱中扒手的特征等。根据当时生 理和解剖知识，写了一套名为《神经系统的解剖学和生理 学》的系列著作，除了就神经系统及其机能进行严谨、保 守的阐述之外，还兼论颅相学。
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Positron Emission Tomography (PET， 正电子发射计算机断层显像)
FDG or F18 fluorodeoxyglucose
O15 Water
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18F-FDG PET脑代谢显 像，正常人与老年性痴呆 对照，患者双侧顶叶、颞 叶皮质对称性低代谢。
18F-DOPA PET脑受体显像， 正常人与帕金森氏病脑纹状体 多巴胺受体密度影像对照，患 者双侧纹状体密度明显减少
MRI vs MEG
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Magnetic Resonance Imaging (MRI)
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fMRI (functional magnetic resonance imaging)
Brain activity
Oxygen consumption
Cerebral blood flow
神经生物学实验教案
神经生物学实验教案南昌大学生命科学学院实验一脊髓、脑干【目的和内容】通过对脊髓标本、脊髓模型、挂图和脊髓横切片的观察，以了解脊髓的大体解剖结构和显微构造。
通过对脑干标本、挂图和模型的观察，了解脑干的外部形态和脑神经进出脑干的位置。
【材料和用具】锯开人椎管显露脊髓的标本、脑干标本。
人的脊髓解剖模型、人脑模型。
颈部脊髓横切片（银染色）。
【操作】一、脊髓的大体解剖结构通过挂图及人的脊髓模型观察下列结构。
（一）脊髓的位置脊髓位于椎管内，上端通过枕骨大孔与延髓相连续，下端以脊髓圆锥终于第一腰椎下缘。
（二）脊髓的外形脊髓呈前后稍扁的圆柱形，全长有两个膨大部分，上方的叫颈膨大，位于第4颈椎到第2胸椎范围内；下方的叫腰膨大，自第10胸椎处逐渐扩大，到第12胸椎处最粗，向下渐渐缩小成为脊髓圆锥。
自脊髓圆锥向下伸出一根细丝，叫终丝，止于尾骨的背面。
脊髓表面有下列数条平行的纵沟：1.前正中裂为脊髓前面正中较深的裂。
2.后正中沟为脊髓后面正中较浅的沟。
3.前外侧沟为脊髓前方两侧的一对沟。
4.后外侧沟为脊髓后方两侧的一对沟。
5.后中间沟在颈髓和上部胸髓，后外侧沟和后正中沟之间的浅沟。
这些沟裂在脊髓横切片上更易观察。
在前外侧沟的全长发出一系列根丝，许多根丝组合成前根。
在后外侧沟的全长也有一系列根丝，许多根丝组合成后根。
每一节段的前、后根在椎间孔处汇合成脊神经。
在汇合前，后根有一膨大，为脊神经节。
上部的脊神经根多呈直角地进出于脊髓的两侧，并立即进入其相应的椎间孔。
中部的神经根逐渐向下斜行到相应的椎间孔。
下部的神经根更为倾斜，腰、骶、尾部的脊神经根，未出相应的椎间孔前在椎管内几乎垂直下行，围绕终丝聚集成束，称为马尾。
（三）脊髓的被膜脊髓周围包有结缔组织被膜，叫脊膜，脊膜自外向内分为：l.硬脊膜最外层，坚厚。
硬脊膜与椎管内面骨膜之间的窄腔，叫硬膜外腔，内含血管和脂肪组织等，并有脊神经根通过。
2.脊髓蛛网膜是硬脊膜和软脊膜之间的薄膜。
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实验一鼠脑灌注固定和取材一、原理固定是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞的溶解和腐败，并保持其原来的细微结构及原位保持生物活性物质的活性；能使细胞内蛋白质、脂肪、糖、等各种成分沉淀而凝固，尽量保持它原有的结构；使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得原本在生活情况下看不清楚的结构，变得清晰可见；使得组织细胞各部经媒染作用容易染色；经过固定，使组织硬化，以利于以后切片时切薄片。
体循环：左心室→升主动脉→主动脉的各级分支→毛细血管→各级静脉→上下腔静脉→右心房，完成体循环的整个循环。
二、实验步骤1、正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，或昆明小鼠，20g左右，雌雄不拘；2、动物麻醉后，用左手持镊子夹起腹部皮肤，右手持剪刀自胸骨剑突下腹部剪一小口，由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌，分离皮下组织，将皮肤翻向两侧，再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨，沿膈肌向两侧剪开，并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧，将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏，小心用镊子将心包膜打开；3、将灌注针（大鼠12#，小鼠7#）插入左心室并送至升主动脉内，用止血钳把灌注针固定在心脏上，打开灌注泵开关，同时剪开右心耳，使血液排出。
先快速灌注0.9%NaCl（大鼠80-120ml，小鼠30ml），至肝脏逐渐变白色或右心耳流出清亮液体为止，再灌注4℃预冷的固定液（大鼠200ml，小鼠50ml，根据动物体重定量），其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分钟内灌注完；4、固定液进入血管后，大鼠四肢和尾巴开始抽动，表明灌注液进入大鼠大脑，待抽动完全停止，全身组织器官变硬后即可停止灌注；5、断头后，剥离颅骨、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。
6、后固定（post-fixed）：剥出鼠脑后，切取含目的区域的脑段，放入相同固定液4～12h，4℃。
附4%多聚甲醛的配制：40g多聚甲醛用0.1mol/L PB（pH7.4）溶解后定容至1L，过滤后置于4℃保存。
实验二大鼠脑立体定位一、目的和应用脑立体定位仪是利用颅骨外面的标志或其它参考点所规定的三维坐标系统，来确定皮层下某些神经结构的位置。
它是神经解剖、神经生理、神经药理和神经外科等领域内的重要研究设备，以便在非直视暴露下对其进行定向的刺激、破坏、注射药物、引导电位等研究。
可用于帕金森氏病、癫痫、脑内肿瘤动物模型建立，还可用于学习记忆，脑内神经干细胞移植，脑缺血等研究。
二、步骤1、实验动物的选择：正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，雌雄不拘；2、麻醉（anesthetized）：10%水合氯醛0.35ml/100g，i.p.；3、定位：用耳棒和上颌固定器将大鼠头部固定在动物脑立体定位仪上（固定好的标准：鼻对正中，头部不动，提尾不掉），调门齿杆的高度为﹣3.3mm，固定好门齿，使前囟点（Bregma）和人字缝尖点（lambda）在同一水平面上；4、碘伏消毒颅顶皮肤，根据所选区域切开皮肤，3%双氧水擦拭骨膜，清晰暴露出前囟点；5、将微量注射器夹持在固定器上，调节三维旋钮使其针头刚好接触Bregma点，此时读出三维坐标数值并记下，此为原点数值；4、参照Paxinos and Watson（1986）的大鼠脑图谱，读出注射部位的三维坐标数值，在原点坐标三维值基础上加或减相应的数值（Bregma值为正就加，为负减；右侧加，左侧减；深度减），即得到一个最终定位的三维坐标值；5、微量注射器吸入药液，调节前后和左右的旋钮使其针头刚好接触到颅骨，并在此点做一标记，在此钻孔后，将注射器针头缓慢插入相应的深度；6、缓慢注射液体，注射速度2μl/5min，注射后留针10～15min；7、缓慢退针后，缝合皮肤，待其苏醒后放入笼中饲养；8、根据实验需要，决定动物存活时间。
9、本实验中，若需要查验注射部位是否正确，可以在退针后取下动物，将其断头后，小心地剥离出鼠脑，顺着注射点将大脑切开，观察注射部位是否正确。
实验三冰冻切片及贴片一、组织块浸糖目的：冰冻时，组织中水分易形成冰晶，对组织结构有影响，故将组织浸入20%-30%的糖液中是为了置换出组织中大部分水分，使其在切片时尽量少出现冰晶。
方法：将鼠脑从后固定液移入15%蔗糖0.1mol/L PB，4℃，过夜；再移入30%蔗糖0.1mol/L PB，4℃，至组织块沉底。
二、冰冻切片将组织块从蔗糖中取出，用滤纸吸干表面液体。
在样品台上滴上适量的包埋剂，将组织粘于其上，然后再滴适量包埋剂于组织块上，直至将整个组织块完全包裹住。
放在切片机速冻台处，按下“PE”速冻键。
调节好冻台及箱体温度；将速冻完成的样品头夹在冻台上，进行鼠脑冰冻连续冠状切片，片厚20μm。
按顺序收集切片于盛有0.01 mol/L PBS的培养皿内。
三、贴片用毛笔将脑片平整贴片于粘附载玻片上，每张载玻片贴三张脑片，自然凉干后，置于切片盒中放—20℃保存。
一张优质的切片要求组织完整，厚薄均匀，无刀痕、皱褶、气泡，染色时不脱片。
附：0.01mol/L PBS（pH 7.4）：Na2HPO4 3.75gNaH2PO40.43gNaCl 7.2g加水定容至1000ml0.1mol/L PB（pH 7.4）：Na2HPO428.7gNaH2PO4 2.96g加水定容至1000ml15%蔗糖：蔗糖15g 加0.1mol/L PB溶解定容至100ml30%蔗糖：蔗糖30g 加0.1mol/L PB溶解定容至100ml实验四尼氏（Nissl）染色一、原理尼氏体（Nissl body）：是神经细胞的一种特殊结构，具有嗜碱性的特点，易被碱性染料，如焦油紫、亚甲蓝、甲苯胺蓝及硫堇等将其染为蓝色，呈块状(形如虎斑)或粒状，又称虎斑。
尼氏体分布在神经细胞除轴突之外的细胞质中，核周围颗粒较大，近边缘处较小而细长。
尼氏体可因生理状态的改变而变化，在生理情况下尼氏体大而数量多，反映出神经细胞旺盛的功能状态；在神经元受损伤时，神经元的胞体肿胀，细胞核从中央移到胞体边缘，胞质内尼氏体明显减少甚至消失，故胞质着色浅淡。
电镜下可见尼氏体由发达的粗面内质网和游离的核糖核蛋白体构成。
二、冰冻切片尼氏染色实验步骤1、浸片：切片在PBS液中浸泡2min；2、染色：切片入0.1%焦油紫水溶液，37℃，30～60分钟；3、漂洗：蒸馏水10sec，洗去浮色，4、分色、脱水、透明：依次移入70%、80%、95%（两次），每道10sec；移入100%乙醇两次，每次1min；移入二甲苯两次，每次5-10min；5、封片：中性树胶封片。
结果：胞浆着色，高倍镜下可见尼氏小体紫红色，核仁呈深蓝色，背景无色。
三、注意事项1、在70%、80%乙醇内分色作用明显，所需时间应根据切片性质（冰冻切片或石蜡切片等）、切片厚度、染色深浅等灵活变动，必要时随时在显微镜下检测分色程度。
如分色不够，可退回70%、80%乙醇；分色过度，可退回水中再移入染液重染。
2、应用酒精分色，要迅速，防止过度分色，将组织切片上的颜色全部脱掉。
3、透明剂能使材料清净透明，增加组织折光系数，使细胞的色度与细胞的重叠不致影响镜下检查。
常用的透明剂为二甲苯，它折射率是1.494，与载玻片的折射率1.515较为匹配。
此外，它能与乙醇、石蜡以及封片用的中性树胶互溶。
但切片浸入前必须脱干净水分，否则会发生乳状混浊。
如果二甲苯溶液变得浑浊，一定要更换新液。
实验五、神经髓鞘染色一、原理髓鞘是包裹在神经轴突外面的管状鞘，由髓磷脂所构成，其主要成分是类脂质和蛋白质，类脂质含有脂肪、卵磷脂、脑苷酯及胆固醇。
在正常髓鞘中，由于磷脂极性基团和亲水基团的存在，对水具有亲和力，因此水溶性氧化剂可渗入髓鞘，有利于磷脂对染料的摄入。
髓鞘染色方法有多种，基于不同的原理，可利用媒染剂、油溶性染料或锇酸等与类脂质的特殊反应而进行。
Luxol Fast Blue（LFB，罗克沙尔坚牢蓝）属于铜-酞箐染料（copper-phthalocyanine dye），具有在乙醇溶液内能与髓鞘磷脂结合的染色特性。
LFB染色后髓鞘着色鲜明，是鉴定神经髓鞘比较好的特异性标记物。
根据正常和不同病变时期髓鞘的组织结构特点，通过髓鞘染色来观察正常和病理情况下髓鞘是否完整，有无变性、坏死及修复情况，对神经组织的病理诊断和研究有实用意义。
二、冰冻切片髓鞘染色实验步骤1、提前1h把LFB染液放在60度烘箱里预热；2、切片在PBS液中浸泡2min；3、洗好的切片依次浸入70%、80%、90%、95%乙醇，每个浓度2min；4、将切片放入预热好的LFB染液，60度烘箱中孵育1.5～2h；5、将染色缸取出冷却到室温后，切片依次浸入95%乙醇1min、双蒸水10sec，饱和Li2CO3、70%乙醇、双蒸水10sec。
（饱和Li2CO3和70%乙醇起分色作用，时间根据分化的程度而定，这两步之间可以反复，同时用显微镜观察分色情况）；6、待切片自然晾干后入100%乙醇5min，二甲苯两道，每道10min，中性树胶封片，晾干后在显微镜下观察拍照。
参考结果：(2012级神经生物郭瑞供图)实验六&七免疫荧光（双标）染色技术一、原理免疫荧光技术是最早建立的一种免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广，但是标本不易保存，因为荧光素易降解。
抗体与抗原结合方式主要有两种：①直接法：用带有标记物的抗体与标本中的相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原；②间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体（第二抗体是用第一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物）与特异性的第一抗体结合，通过这样的放大作用，使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接法的敏感性大为增高，约高5～10倍，故应用更为广泛。
二、冰冻切片免疫荧光双标步骤1、切片入0.01 mol/L PBS（pH 7.4）5 min，室温；2、封闭：滴加10%正常山羊血清（0.01 mol/L PBS配），室温，30 min；3、滴加混合一抗（兔抗GFAP，1：500，Sigma，小鼠源MCT1，1：200，abcam，用含0.3% TritonX-100的0.01 mol/L PBS稀释），4℃，过夜或37℃，2h；4、0.01 mol/L PBS洗切片，5 min /次×3次，室温；5、滴加混合的荧光素标记的二抗（Cy-2标记的山羊抗小鼠1：200，Sigma，Cy-3标记的山羊抗兔1：200，Sigma ，0.01 mol/L PBS配），37℃，1h或4℃过夜；6、0.01 mol/L PBS洗切片，5 min /次×3次，室温；7、DAPI复染，室温10min后0.01 mol/L PBS洗切片，5 min /次×3次；8、荧光封片剂封片后在荧光显微镜下观察拍照。