分子生物学实验指导
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
分子生物学实验指导
实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
分子生物学实验指导_图文(精)
分子生物学实验指导主编:于冰马春泉高传军杨峰山主审:李海英黑龙江大学生命科学学院2006 年 3月目录绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备................................................... 1 实验一植物基因组 DNA 的分离.................................... 6 实验二 RNA 的分离................................................... 11 实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测.............................. 15 实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整............ 21 实验五聚合酶链式反应(PCR .................................... 24 实验六随机扩增多态性 DNA 反应(RAPD ..................... 28实验七甜菜 M14品系 AFLP 分析.................................... 32 实验八生物信息学 (49)前言黑龙江大学生命科学学院自成立以来,相继成立了生物工程专业,生物技术专业,生物制药专业和食品科学与工程专业。
分子生物学是一门二十一世纪的前沿学科,而实验操作是分子生物学的一个重要组成部分。
我们结合了我院现有的仪器设备及材料情况,为本科生设立了八个分子生物学实验项目(包括一个综合性实验项目 ,以使学生掌握分子生物学领域中最基本的实验技能。
本书编写充分考虑了实验的系列操作性,比如从基因组 DNA 、总 RNA 的提取到琼脂糖凝胶检测,从 DNA 浓度的调整到 PCR 技术,从分子标记技术到生物信息学分析等,完全贯穿了分子生物学的基本实验技术。
对生命科学学院的本科生来说是一本很好的实验教材。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导(总45页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。
以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T 载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。
整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。
其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。
各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。
整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。
我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。
分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。
实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。
因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。
在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
分子生物学实验指导（精）
分⼦⽣物学实验指导（精）分⼦⽣物学实验指导⽣物技术教学室编宁夏⼤学⽣命科学学院2008年8⽉实验⼀分⼦⽣物学实验技术多媒体演⽰[⽬的要求]通过多媒体试验录像进⼀步掌握分⼦⽣物学基本操作技术。
[教学⽅式]多媒体光盘演⽰。
[实验内容]基本的分⼦⽣物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验⼆琼脂糖凝胶电泳检测DNA[⽬的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的⽅法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA⽚段的常⽤⽅法。
DNA分⼦在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，DNA分⼦在⾼于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖磷酸⾻架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA⼏乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极⽅向移动。
不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp⾄50 kb的DNA⽚段。
在琼脂糖溶液中加⼊低浓度的溴化⼄锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分⼦⼤⼩在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数⽬的常⽤对数值成反⽐，分⼦越⼤迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度⼀个特定⼤⼩的线形DNA分⼦,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压低电压时，线状DNA⽚段迁移速率与所加电压成正⽐。
但是随着电场强度的增加，不同分⼦量DNA⽚段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩⼩。
要使⼤于2kb的DNA⽚段的分辨率达到最⼤，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳⾏为受电泳时的温度影响不明显，不同⼤⼩的DNA⽚段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发⽣明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
分子生物学实验指导
实验一、动、植物组织总RNA的提取一、材料、试剂和仪器材料：动物组织，一次性塑料手套，200 μl、1000 μl吸头。
试剂：TRIzol总RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，0.1％DEPC，75％乙醇（用RNase-free 水配制），RNase-free水。
仪器：烘箱，超低温冰箱，高速冷冻离心机，普通离心机，高压灭菌锅，微量取样器，研钵二、提取操作步骤1、匀浆处理：a、动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。
取新鲜或-70'C冻存组织，大约10-30 mg组织加1m1 TRIquick，用一次性组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
b、单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIquick裂解细胞，每10cm2面积加1ml TRIquick。
用取样器吹打混匀。
c、细胞悬液：离心收集细胞。
每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1 ml TRIquick。
d、血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，8，000-10，000 rpm离心1分钟。
彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。
每100-200 μl 血液收集的白细胞沉淀加入1 ml TRIquick。
2、将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
如不连续进行实验，加入TRIquick的匀浆样品可在－70'C下保存1-2个月。
3、可选步骤：4℃12，000 rpm离心5-10分钟，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4、每使用1ml TRIquick向匀浆样品中加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟，使其自然分相。
如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代替。
5、4℃12，000 rpm离心10-15分钟。
分子生物学实验指导
北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。
严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。
每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。
松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。
该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。
分子生物学实验指导
分子生物学实验教案第一部分茶树CBF基因的克隆实验一目标基因的5’-末端的PCR扩增、3’-末端的PCR扩增一、实验目的通过本实验学习和掌握用RACE方法扩增cDNA的5’-末端和3’-末端的方法和技术。
二、实验原理1. 聚合酶链反应的原理聚合酶链反应（the polymerase chain reaction, PCR）是一种在模拟DNA复制反应的基础上对一个DNA分子某一特定区域进行选择性扩增的方法。
DNA分子上任何一个区域，只要它两端的序列是已知的，都可以利用PCR进行特异性扩增，获得大量的扩增产物。
PCR反应体系包括：①模板：其上待扩增的序列称为靶序列；②一对特异性引物：它们是人工合成的10 ~ 30个核苷酸长的单链DNA片段，与靶序列的两端互补；③耐热DNA聚合酶：用于延伸引物合成DNA，PCR反应中常用的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶；④四种脱氧核糖核苷三磷酸：dATP、dGTP、dCTP和dTTP是DNA合成的前体分子。
PCR实验的基本步骤如下：①高温变性：反应混合物被加热到94℃，在该温度下，DNA 双螺旋两条链之间的氢键被打断，DNA分子发生变性；②低温退火：当温度降低时，引物与单链模板杂交；③适温延伸：退火后，温度又被升高到了72℃，这是Taq DNA聚合酶的最适工作温度，Taq DNA聚合酶延伸引物合成与模板互补的新链。
这三步构成一个循环，接下来温度又被升到94℃，双链DNA分子又变性成为单链，于是便开始了第二轮变性－退火－延伸的循环（图1-1）。
由于每一次循环的产物都可以作为下一次循环反应的模板，通常经过25 ~ 30次后，被扩增的DNA片段可以达到几百万个拷贝。
2. RACE技术的原理以4℃处理24 h的茶树幼叶为材料，利用SMART cDNA synthesis Kit构建了SMART cDNA文库。
首先以3' SMART™ CDS Primer II A为引物，以RNA为模板合成第一链cDNA。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验I. 实验概述分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其在生命过程中的作用。
在现代生命科学研究中，分子生物学技术的应用越来越广泛，包括基因克隆、基因表达、蛋白质结构、信号转导等多个方面。
本实验将介绍几种基本的分子生物学实验操作，包括DNA的提取、PCR扩增、电泳检测和蛋白质的SDS-PAGE分析，旨在提高学生对分子生物学基础知识和实验技能的掌握。
II. 实验材料及设备1. 细菌培养基、磷酸盐缓冲液、EDTA、裂解液等试剂；2. 离心管、洗涤管、PCR管、电泳槽等设备；3. 离心机、PCR仪、电泳仪等设备。
III. 实验步骤1. DNA的提取(1) 收集细胞收集需要提取DNA的细胞，如细菌、白细胞等。
将细胞转移到1.5mL离心管中。
(2) 细胞裂解加入200μl裂解液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分裂解。
离心管可置于65°C水浴中处理10分钟，使DNA完全裂解。
(3) DNA提取加入500μl磷酸盐缓冲液和10μl EDTA，混匀后离心5分钟。
取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置，使DNA在异丙醇界面上结团。
放置室温下10分钟，使用洗涤管将DNA结团转移到另一离心管中。
加入70%乙醇溶液洗涤2-3次，最后去除乙醇，用无菌水溶解DNA。
2. PCR扩增(1) 设计引物、制备PCR反应液按照所需扩增的DNA序列设计引物，制备PCR反应液，包括所需模板DNA、引物、Taq聚合酶、MgCl2等。
(2) PCR条件将PCR反应管放置PCR仪中，经过若干个循环，达到最终PCR产物的扩增。
PCR条件通常应选择对应引物特异性、Tm温度适中，并根据Taq聚合酶的活性和反应体系的最适条件优化所得。
常用的PCR条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，Tm温度退火30s，72℃延伸1min，循环30-35次，最后72℃加延伸10min。
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分子生物学实验B实验指导实验一植物总DNA和RNA的提取与鉴定（一）植物总DNA的提取一、目的与要求1、学习和掌握CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
2、掌握紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度的方法。
二、实验原理CTAB法是一种提取植物总DNA的常用技术。
CTAB是十六烷基三甲基溴化铵的缩写，是一种非离子型去污剂。
植物叶片经液氮研磨导致细胞壁破裂后，加入去污剂CTAB，可使核糖核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA 进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化DNA。
CTAB与核酸形成的复合物在高盐（>0.7mmol/l NaCl）浓度下可溶；但在低盐浓度（0.1～0.5 mmol/l NaCl）下沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280约1.8，且1μg/ml的DNA溶液A260约0.020。
三、基本步骤1.称取0.2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，吸水纸轻轻吸干水分；2.将叶片剪成1cm长，置研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末；3.在液氮完成挥发之前，将粉末转入加有750μL预热（65℃）的CTAB提取缓冲液的2mL离心管中，65℃水浴保温30-60 min，不时地轻轻摇动混匀，使其充分裂解；4.取出，冷却到室温，加入等体积（750μL）的24：1的氯仿/异戊醇，盖上盖子，温和摇动，使成乳状液，静置10min；5. 10000rpm离心10min；6.取出离心管（出现3层），小心地吸取上层清液转移到干净的2mL离心管中（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次，去除杂质）；7.沿离心管壁慢慢加入2倍体积预冷的无水乙醇（或2/3体积的异丙醇），（注：为使DNA沉淀完全，可将离心管放于－20℃冰箱中，静置30min以上）。
8.10000rpm离心10min，并室温干燥（或真空干燥）。
9. 用0.2ml 70％乙醇洗涤沉淀 1次，室温下微干，加入70µl 高盐TE缓冲液和1 µl的RNaseA，颠倒混匀，37℃保温0.5h。
10.将沉淀用70%乙醇清洗两次后，晾干，加入50µl TE或无菌水溶解沉淀。
11.加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，于4℃,7 500g（对于小样品，在离心机上以10000 r/min）离心15min。
12.测定该溶液在紫外光波260nm和280nm的吸光值计算提取DNA的浓度(也可同时进行琼脂糖电泳)。
五、实验材料与耗材1、实验材料：植物叶片（幼嫩叶片为佳）。
2、耗材：2ml离心管×1，玻璃棒×1，陶瓷研钵和杵子×1，50ml烧杯×1，剪刀×1，滴管×1。
3、试剂：液氮，CTAB，Tris碱，Na2EDTA，NaCl，β-巯基乙醇，盐酸，氯仿，异戊醇，乙醇六、仪器与设备冰箱，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，紫外分光光度计七、注意事项1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。
2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。
（二）植物总RNA的提取和含量测定一、目的与要求1、了解RNA的特性。
2、掌握Trizol法提取RNA的原理及操作技术。
二、实验原理RNA分子是化学性质非常活跃的分子。
在提取细胞内RNA的过程中，RNA 分子容易受细胞内核酸酶、化学试剂、机械震荡等多种因素影响而破坏分子结构，导致提取失败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放的核酸酶活性。
Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总的RNA。
三、基本步骤1、称取1g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，吸水纸吸干水分。
2、将叶片剪成1cm长，置预冷的陶瓷研钵中，倒入液氮，快速研磨成粉末。
3、待液氮蒸发完后，快速称取0.1g粉末移到1.5ml离心管中，加入1ml Trizol.试剂,充分振荡,冰上静置3～5min。
4、加入200μl氯仿/异戊醇(24:1)或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。
5、离心12000rpm，4℃，10min。
6、将上清液小心转移到新1.5ml离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，-20℃，30分钟。
注：不要吸取任何中间层物质，否则会出现DNA 污染。
7、离心12000rpm，4℃，5分钟。
8、小心移去上清液，防止沉淀丢失。
9、加入700μl 70%酒精洗涤，离心12000rpm，4℃，5分钟。
10、重复步骤‘9’。
11、离心结束后，弃去上清，防止丢失RNA沉淀。
12、室温干燥，让乙醇挥发完全。
13、加入30～50μl的DEPC水溶解，可以-70℃保存。
注：可以采用电泳技术或光谱技术检测RNA的浓度、纯度情况。
四、溶液配制1、Trizol试剂:直接使用供应商提供的Trizol类试剂；每组1ml。
2、氯仿-异戊醇混合液（24:1，V/V）：分别量取96ml氯仿和4ml异戊醇混合均匀；每组200μl。
3、70%乙醇：量取70ml无水乙醇用水定容到100ml,4℃保存；每组1.5ml。
4、0.1% DEPC超纯水：用移液枪吸取1ml DEPC，加入1l待处理超纯水，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC 和乙醇）；每组用少量。
分解为CO2五、实验材料与耗材1、实验材料：植物叶片（幼嫩材料为佳）。
2、耗材：1.5ml离心管（DEPC处理），移液器（规格1000μl、10μl），Tip 头（DEPC处理）。
3、试剂：Trizol试剂，氯仿，异戊醇，无水乙醇，超纯水，DEPC(二乙基焦碳酸酯)，超纯水（DEPC处理）。
六、仪器与设备冰箱，超净工作台，冷冻高速离心机，制冰机。
七、注意事项全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染抽提的RNA并成为RNA酶的来源。
实验项目二：质粒DNA的提取一、目的与要求1、学习碱裂解法提取质粒的基本原理。
2、掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。
二、实验原理质粒是细菌细胞内独立于染色体外的遗传物质，是环状的双链DNA分子。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异而分离。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA和共价闭合环状质粒DNA的氢键都会被断裂，双螺旋结构解开而变性。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链复性迅速而准确，重新溶解在液相中；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、基本步骤1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2、取1ml培养物倒入1.5ml管中，12000rpm/min，离心1min。
3、弃去培养液上清，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
5、加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，快速颠倒5次，混匀内容物，将离心管放在冰上。
6、加入150μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管盖，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。
7、12000r/min，离心10min，将上清液转至新1.5ml离心管中。
8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。
9、12000r/min，离心5min，将上清液转至新1.5mL离心管中。
10、向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min 离心5min。
倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
11、1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
12、20μl TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。
13、琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒DNA样品。
四、溶液配制1、1.0mol/l Tris（pH8.0）：称取12.11g Tris用约80ml水溶解后，加入约4.2ml 浓盐酸将溶液pH调到8.0，最后用100ml容量瓶定容；每组不到0.1ml。
2、0.5mol/l EDTA（pH8.0）：称取18.61g Na2EDTA用约80ml水溶解后，加入约2g NaOH,调节pH至8.0，最后用100ml容量瓶定容；每组不到0.1ml。
3、0.4mol/l NaOH：称取0.8g NaOH固体溶解后定容到50ml。
4、2% SDS：称取1g SDS固体溶解后定容到50ml。
5、5mol/l乙酸钾：称取49g乙酸钾固体，溶解后定容到100ml。
6、溶液Ⅰ（pH8.0）:含有50mmol/l葡萄糖、5mmol/l Tris、10mmol/l EDTA。
称取0.9g葡萄糖，用约50ml蒸馏水溶解后，分别量取0.5ml的1.0mol/l Tris溶液和4ml的0.5mol/l EDTA溶液加入混匀，加水定容到100ml。
121℃湿热灭菌15 min，4℃保存；每组100μl。
7、溶液Ⅱ：将等体积的0.4mol/l NaOH和2% SDS混合，新鲜配制；每组200μl。
8、溶液Ⅲ：含有5mol/l乙酸钾和3mol/l冰乙酸。
分别量取60ml的5mol/l乙酸钾和11.5ml冰乙酸，加水定容到100ml。
121℃湿热灭菌20 min，4℃保存；每组150μl。
9、70%乙醇：量取70ml无水乙醇用水定容到100ml；每组1ml。
10、TE缓冲液（pH8.0）：该溶液含有10mmol/l Tris和1mmol/l EDTA。
分别量取1ml 1.0mmol/l Tris和0.2ml 0.5mol/l EDTA，混合均匀后定容到100ml；每组50μl。
五、实验材料与耗材1、实验材料：含有目标质粒DNA的大肠杆菌细胞。
2、耗材：1.5ml离心管×3，移液器（规格1000μl、100μl、10μl）。
3、试剂：葡萄糖，Tris碱，盐酸，Na2EDTA，NaOH，SDS，乙酸钾，冰乙酸，乙醇，tip头（需要高压灭菌处理）。
六、仪器与设备恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，制冰机。
七、注意事项1、实验中使用的溶液和tip头都需要高压灭菌处理。
2、由于溶液Ⅰ中含有葡萄糖，高压灭菌的时间过长，会导致葡萄糖碳化。
3、加入溶液Ⅱ后，要温和混匀。
4、溶液Ⅰ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE溶液都应4℃保存。
实验项目三：PCR基因扩增一、目的与要求学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。
两个寡核苷酸引物分别结合在待扩增的目标DNA片段的两侧，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。