SrRNA扩增常用引物
香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选
Ｙ ｈ ｎ ・ｕ Ｈ Ｎ Ｇ ｎ ‘ Ｈ Ｎ ｕ Ｉ ｉ －ｅ，Ｚ ＮＧ Ｙ ｎｒ Ｅ Ｓ ｅ ｇｙ ｅ，Ｃ Ｅ ａ ｇ，Ｚ Ａ Ｇ Ｈ ｉ ，ＬＵ Ｊａ ｊ Ｅ ａ— ，ＷＵ Ｈｕ— ｎ ｎｉ ｕ ｉ 。 ｍｉ
浙 江 林 学 院 学 报
２ １ ，２ （ ） ７—９ ０ ０ ７ １ ：８ ２
Ｊｕｎ ｌｆＺ ｅ ａ ｇＦ ｒｓ ｙＣ ｌ ｇ ｏ ｒａ ｈｊ ｎ ｏｅｔ ｏｌ ｅ ｏ ｉ ｒ ｅ
香 榧 Ｉ Ｓ ． Ｃ 扩 增 条 件 的优 化 和 引物 筛 选 Ｓ ＲＰ Ｒ
叶 生月 ， 陈 钢 ，张 慧 ，刘 建 杰 曾燕 如 ， ，吴 慧敏
７ ７个 Ｉ Ｓ 引 物 中 筛 选 出 ３ ＳＲ ４个适 合 香 榧 ＩＳ Ｓ Ｒ分 析 的 引物 ．且 通 过 梯 度 Ｐ Ｒ 确 定 了各 自最适 的退 火 温度 。研 究 结 果 为 Ｃ
香榧 遗 传 图谱 构建 打 下 了基 础 图 ４表 １ １ 参 ２
关键 词 ：经 济林 学 ；香 榧 ；ＩＳ Ｐ Ｓ Ｒ—ＣＲ；引 物 筛选
（． 江 林 学 院 浙 江省 现 代 森林 培 育 技 术 重点 实验 室 ，浙 江 临安 ３ １０ ；２ 浙 江 省 临 安市 林 业 局 ，浙 江 １浙 １３ ０ ．
临安 ３ １ ０ １ ３ ０）
摘 要 ： 以香 榧 Ｔ ｒ ｙ ｒｎ ｉ ‘ ｒ ｌｉ ｏｒ ａｇａ ｄｓ Ｍｅｒｌ ’基 因 组 Ｄ Ａ 为 材 料 ， 对 影 响 简单 序 列 重 复 区 间扩 增 一 合 酶 链 式 反 应 （Ｓ Ｒ ｅ ｉｉ Ｎ 聚 ＩＳ — Ｐ Ｒ） Ｃ 的 酶 用量 、Ｍ 浓度 、模板 Ｄ Ａ 用 量 、磷 酸 碱 基 脱 氧 核 苷 酸 （ Ｎ Ｐ ） 度 和 引物 浓 度 等进 行 了优 化 试 验 。优 Ｎ ｄ Ｔ ｓ浓
引物相关知识点总结大全
引物相关知识点总结大全一、引物的概念引物是指用于核酸杂交、PCR、定量PCR、DNA测序以及RNA分子的反向转录（RT）等实验技术中的一种短链DNA或RNA，通常是15-30个核苷酸的长度。
引物的主要作用是与目标序列中的互补序列形成双链结构，从而引发特定的生物学反应。
在实验室中，引物通常由合成核酸技术制备而成。
二、引物的分类根据引物作用的目标序列不同，引物可分为DNA引物和RNA引物两种。
DNA引物主要用于PCR、序列特异性分析等实验中，而RNA引物则主要用于RT-PCR等实验技术中。
根据引物的长度和作用位置不同，引物可以分为引导引物和扩增引物。
引导引物通常用于核酸杂交、PCR等实验中，用于可选择的结合目标序列，一般长度为15-30个碱基。
扩增引物则主要用于PCR实验中，其长度和序列将直接影响到PCR扩增的结果。
三、引物的设计原则1. 引物的互补性：DNA引物或RNA引物与待扩增的目标序列的互补性是引物设计的基本原则，引物与目标序列要求完全互补，并且在同一温度下具有相似的Tm值。
2. 避免引物二聚体和含量：引物的设计应避免引物自身的二聚体和寡聚体的产生，并且要避免引物的富含量，以提高PCR扩增的效率和特异性。
3. 引物的特异性：引物的设计要求尽量确保引物特异性，即引物只与目标序列特异性结合，不与其他非靶标序列结合。
4. 引物长度和GC含量：引物的长度和GC含量对PCR扩增的特异性和效率有一定的影响，一般长度在18-25个碱基，GC含量在40-60%之间。
5. 引物的5’端末修饰：引物的5’端末修饰，如磷酸化和生物素化等，可以增强引物与酶和材料的连接性和稳定性。
四、引物的应用引物作为实验室技术中的重要工具，在许多生物学实验中都扮演着重要的角色。
其主要应用包括：1. PCR扩增：PCR扩增是引物最常见的应用之一，引物特异性与目标序列的互补性可以实现PCR扩增特定基因或序列。
2. DNA测序：引物也常用于DNA测序技术中，引物和DNA降解酶一起作用可以在酶刻蚀DNA链的末端，并且通过引物的特异性与酶反应的DNA片段在随后的扩增和测序中得到全面和特异性的测序结果。
常用引物序列
常用引物序列引言引物序列是指在分子生物学实验中用来特异性引导DNA或RNA复制和扩增的短链核酸序列。
常用的引物序列在科研和实验室工作中起着重要作用。
本文将介绍几种常用引物序列及其在实验中的应用。
1. 通用引物序列通用引物序列是指适用于多种物种的引物序列。
常见的通用引物序列包括16S rRNA引物序列用于细菌和古细菌的分析，18S rRNA引物序列用于真核生物的分析，以及ITS引物序列用于真菌的分析。
这些通用引物序列具有高度保守性，可以用于不同物种的物种鉴定和进化分析。
2. 物种特异引物序列物种特异引物序列是指只在特定物种中存在的引物序列。
这些引物序列通常用于物种鉴定和种群遗传分析。
例如，人类特异引物序列可以用于人类DNA的特异扩增，从而进行人类个体的鉴定。
物种特异引物序列的选择和设计需要根据目标物种的基因组序列进行。
3. 定量引物序列定量引物序列是指用于定量PCR实验的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以通过PCR扩增目标基因的特定片段，并通过实时荧光定量PCR技术进行定量分析。
定量引物序列的设计需要考虑引物的特异性和扩增效率，以确保准确的定量结果。
4. 荧光标记引物序列荧光标记引物序列是指在引物序列上加入荧光标记分子，用于检测和定量特定基因的表达水平。
常用的荧光标记引物序列包括荧光探针和荧光引物。
荧光标记引物序列可以通过荧光定量PCR或原位杂交等技术进行检测。
5. 反向引物序列反向引物序列是指用于反转录PCR实验的引物序列。
反转录PCR是一种将RNA转录成cDNA的技术，常用于研究基因的表达调控和mRNA的定量分析。
反向引物序列通常与反向转录酶结合，将RNA逆转录成cDNA，并通过PCR扩增特定基因的cDNA片段。
6. 基因特异引物序列基因特异引物序列是指用于特定基因扩增的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以选择性地扩增目标基因，从而进行基因型鉴定和基因表达分析。
rna恒温扩增法
rna恒温扩增法
RNA恒温扩增法是一种用于扩增RNA的恒温核酸扩增技术。
相较于传统的PCR扩增技术，RNA恒温扩增无需进行多步温度循环，避免了非特异性产物的产生，提高了扩增的特异性和效率。
RNA恒温扩增法的原理是在恒温条件下，利用特定引物对RNA 进行快速、特异的扩增。
这个过程可以在42℃左右的恒温条件下进行，大大简化了实验设备的需求。
同时，该技术利用M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA
多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100~1000个）RNA拷贝。
每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。
此外，RNA恒温扩增技术具有灵敏度高、检测时间短、产物不易发生污染等优点，在临床上已经得到广泛应用。
例如，该技术可用于建立7种常见致病NTM的RNA恒温扩增实时快速检测方法（SAT），通过对临床分离株和痰标本的检测，评估其临床应用价值。
PCR扩增16SrDNA实验原理、材料和操作步骤以及常见问题分析
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•浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩
增产物太少
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三、反应体系对PCR扩增的影响
反应Buffer
Mg 2＋浓度
dNTP Mixture
•••••过过稳浓p易H高低定度值生非无剂适w,特扩盐物,当增w异增离强w性产子.剂e严物浓b重度
¾ 现象：空白对照出现目的扩增产物
1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列 吸入加样枪内或溅出离心管外；
对 策
2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有 试剂或器材均应高压消毒。所用离 心管及加样枪头等均应一次性使用。
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低 温贮存。
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问题二：非特异性扩增
1. 2. 3. 4. 5.
原
om 因
e.c 引物特异性差
物 bio 模板或引物浓度过高
生 w.e 酶量过多
对
易 w Mg2+浓度偏高
策
w 退火温度偏低
1. 重新设计引物或者使用巢 式PCR
2. 适当降低模板或引物浓度 3. 适当减少酶量 4. 降低镁离子浓度 5. 适当提高退火温度或使用
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量
2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚
4. 反应条件：退火温度太高，延 策
体和链内二级结构）或者换一
伸时间太短
管新引物
4. 降低退火温度、延长延伸时间
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•避免反复冻融
ddH2O
qPCR引物篇（5）BioTNTmRNA引物筛选，引物定制或specificprimer..
版本号：20100001BioTNTqPCR Primer Assay for specific mRNA genes目录号：SER-PCR –编号（500T）;说明书Part A一、产品简介：本试剂盒是基于最可靠的SYBR® Green-based定量real-time PCR试剂盒并应用基因表达分析。
我们的实验为基因特异性定量PCR验证具有统一、高效和标准化特点的扩增反应条件。
每一对引物都是经过严格的实验验证的。
已经使用适当的real time PCR Mix的时候，合适的片段大小和高的扩增效率成为保证。
qRT-PCR Primer pair kits统一的扩增效率和条件为荧光定量pcr实验中多基因表达的检测提供了准确而灵活的解决方案。
完整的试剂盒说明书由part A 和Part B构成。
Part A 主要描述了本试剂盒的使用方法和注意事项，Part B主要注明了assay 的特异情况。
二、产品特点：本产品适用于有一定q PCR实验经验的客户或者无经验的客户在公司的技术指导下进行。
三、保存条件：可在常温下运输。
常期保存请在-20℃保存，效期12个月。
警告：本产品仅供科研使用，请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等其他用途。
安全提示：本产品中部分试剂有腐蚀性或毒性，请勿直接接触皮肤或吞咽；操作时请穿戴实验服、防护镜和手套；如果接触皮肤，应立即用洗涤剂和大量清水冲洗；误食或其他危急情况，请及时到医院就治；部分试剂易燃，请注意消防安全。
四、注意事项：请在收到此试剂盒后立刻检查试剂盒组成，BioTNT公司只负责受理在试剂盒签收后三个工作日内的试剂缺失报告；五、试剂盒组成：其他特点请参照Part B。
六、保证结果可使用的qPCR试剂：BioTNT real time PCR Premix 货号：A2010A0112七、其他需要自己准备的：1、耗材：0.5 mL或1.5mL Eppendorf管（无菌、无酶、RNase-free；货号Axygen-MCT-150-C），Tips(RNase-free)（1000μL、200μL、10μL的枪头；）；2、检测的样本CDNA；3、无菌无酶的 PCR 水（货号：A2010B0X03）；4、离心机；移液器（10μL，200μL，1000μL）；5、手套，口罩。
逆转录PCR实验重要要素详解
逆转录PCR试验紧要要素详解RT—PCR 就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录 PCR（reverse transcription—PCR, RT—PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。
在 RT—PCR 中，一条RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA扩增。
逆转录（reverse transcription）是以 RNA为模板合成DNA的过程，即 RNA引导下的 DNA 合成，逆转录试验包含3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：1.引物：逆转录引物紧要有3种，包含 Oligo（dT）、Random Primers和基因特异性引物（GSP）。
其中 Oligo（dT）具有12—20个 T 碱基，而且与真核生物 mRNA的 3Poly A 尾配对，可合成全长的 cDNA，但仅扩增有 polyA尾的 mRNA，对模板质量要求高，较适合克隆试验。
而 Random Primers具有6—9个碱基，可随机识别模板并结合，适合多而杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续 qPCR试验。
基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。
所以依据不同试验需求可进行相应引物的选择。
2.逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链构成，具有聚合酶活性和很强的 RNaseH活性，它最适温度是42℃，最适 pH8.3，在高反应温度时可除掉 mRNA的二级结构对逆转录的阻拦，然而高水平的 RNaseH的活性既抑制 cDNA产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒（M—MLV），是单肽链的，有 RNA 聚合酶活性和相对较弱的 RNaseH活性，最适温度37℃，最适 pH7.6，较弱的 RNaseH活性对获得2—3kb的 mRNA的全长 cDNA 有很大好处。
狗牙根SRAP_PCR反应体系优化及引物筛选_王志勇
狗牙根SRAP -PCR 反应体系优化及引物筛选王志勇1,2,袁学军2,刘建秀2＊,郭海林2(1.南京农业大学园艺学院,江苏南京210095;2.江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京210014)摘要:利用正交设计,从M g 2+、dN T P 、引物浓度和D NA 聚合酶4种因素3个水平以及不同的模板D NA 浓度来优化狗牙根S RAP -PCR 反应体系,并对引物进行了全面筛选。
狗牙根S RAP -PC R 优化反应体系结果为:2μL 10×buffe r 、40ng 模板DN A 、M g 2+1.25mmol /L 、dN T P 260μmol /L 、引物0.2μmol /L 、T aq D NA 聚合酶1.0U ,总体积20μL 。
运用该结果从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRA P 引物34对。
优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用S RA P 标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础。
关键词:狗牙根;SRA P 标记;正交试验;体系优化;引物中图分类号:S543+.902 文献标识码:A 文章编号:1004-5759(2008)03-0079-07 目前,常用的DNA 分子标记有RFLP 、RAPD 、AFLP 和SSR 等,它们各有优缺点[1,2]。
美国加州大学蔬菜作物系Li 和Ouiros[3]于2001年在研究芸薹属(B rassica )作物中开发的一种基于PCR 的新型标记SRAP (se -quence -related amplified polym orphism ),该标记具备RFLP 、RAPD 、SSR 和AFLP 等分子的优点,克服了它们的缺点,并已经在许多植物研究中得到应用,如在构建图谱[4,5]、遗传多样性[6～8]、Q TL 定位[9]、杂种优势的预测[6]以及其他方面[10]的研究。
狗牙根属(Cynodon spp .)属禾本科(G ramineae )画眉草亚科(Eragaostoidee )虎尾草族(Chlo ridoieae )多年生草本植物[11]。