厌氧菌的培养方法共30页
厌氧菌的分离和培养
实验十厌氧菌的分离和培养（第三篇）实验十厌氧菌的分离和培养1 目的1.1 了解厌氧微生物的生长特性1.2 观察厌氧微生物（双歧杆菌）的形态特征1.3 掌握厌氧微生物的滚管分离、培养与计数技术2 原理目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。
这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。
而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害腐败菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。
3 材料3.1 样品双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。
3.2 培养基改良MRS培养基，PTYG培养基。
3.3 仪器和器具亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。
4 流程铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数5 方法5.1铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、C O2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
当然H2源也可以由氢气发生器产生。
厌氧培养方法
厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。
现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。
其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。
厌氧生物处理相关资料(ppt 30页)
概述
原理
ห้องสมุดไป่ตู้
主要构筑物及工艺
厌氧生物处理——概述
在断绝与空气接触的条件下，依赖兼性厌氧菌和专性厌 氧菌的生物化学作用，对有机物进行生物降解的过程， 称为厌氧生物处理法或厌氧消化法。
厌氧生物处理法的处理对象是：高浓度有机工业废水、 城镇污水的污泥、动植物残体及粪便等。
（1）氧化还原电位（ORP或Eh） 厌氧环境是厌氧消化过程赖以正常进行的最重要的条件。
厌氧环境，主要以体系中的氧化还原电位来反映。
一般情况下，氧的溶入无疑是引起发酵系统的氧化还原电 位升高的最主要和最直接的原因。但是，除氧以外， 其它一些氧化剂或氧化态物质的存在（如某些工业废 水中含有的Fe3+、Cr2O72-、NO3-、SO42-以及酸性 废水中的H+等），同样能使体系中的氧化还原电位升 高。当其浓度达到一定程度时，同样会危害厌氧消化 过程的进行。
厌氧生物处理——原理
（2）温度 温度是影响微生物生命活动过程的重要因素之 一。温度主要影响微生物的生化反应速度，因而与有 机物的分解速率有关。
工程上： 中温消化温度为30~38℃（以33~35℃为多）； 高温消化温度为50~55℃。
厌氧消化对温度的突变也十分敏感，要求日变化小于 ±2℃。温度突变幅度太大，会招致系统的停止产气。
三、厌氧接触系统 普通消化池用于处理高浓度有机废水时，为了强化有机物 与池内厌氧污泥的充分接触，必须连续搅拌； 同时为了提高处理效率，必须改间断进水排水为连续进水 排水。但这样一来，会造成厌氧污泥的大量流失。 为了克服这一缺点，可在消化池后串联一个沉淀池，将沉 淀下的污泥又送回消化池，因此组成了厌氧接触系统（图 9-4）。 污泥回流量约为进水流量的2~3倍。消化池内的MLVSS 为6~10g/L。
污水处理培养菌种方法
污水处理培养菌种方法一、引言污水处理是保护环境和人类健康的重要措施之一。
在污水处理过程中，菌种的使用起着至关重要的作用。
本文将详细介绍污水处理中常用的菌种培养方法。
二、菌种的选择在污水处理中，常用的菌种包括厌氧菌、好氧菌和兼性厌氧菌。
厌氧菌可在缺氧条件下生长，好氧菌需要氧气进行代谢，而兼性厌氧菌则可在缺氧和有氧条件下生长。
根据不同的处理需求，选择合适的菌种进行培养。
三、菌种培养方法1. 厌氧菌培养方法（1）制备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵等溶解于蒸馏水中，加热煮沸后冷却，加入适量的硫酸镁、氯化钠等，调整pH值至7.0左右。
（2）接种培养基：将污水样品取适量加入培养基中，摇匀后封闭。
（3）培养条件：将培养基置于恒温培养箱中，温度控制在35℃左右，保持缺氧状态。
（4）观察和收获：培养一段时间后，观察菌落的生长情况，根据需要收获菌种。
2. 好氧菌培养方法（1）制备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖、氯化钠等溶解于蒸馏水中，加热煮沸后冷却，调整pH值至7.0左右。
（2）接种培养基：将污水样品取适量加入培养基中，摇匀后封闭。
（3）培养条件：将培养基置于恒温培养箱中，温度控制在25℃左右，保持有氧状态。
（4）观察和收获：培养一段时间后，观察菌落的生长情况，根据需要收获菌种。
3. 兼性厌氧菌培养方法（1）制备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵等溶解于蒸馏水中，加热煮沸后冷却，加入适量的硫酸镁、氯化钠等，调整pH值至7.0左右。
（2）接种培养基：将污水样品取适量加入培养基中，摇匀后封闭。
（3）培养条件：将培养基置于恒温培养箱中，温度控制在30℃左右，保持缺氧和有氧交替状态。
（4）观察和收获：培养一段时间后，观察菌落的生长情况，根据需要收获菌种。
四、菌种培养的注意事项1. 严格控制培养条件：包括温度、光照、氧气浓度等，以保证菌种的正常生长。
2. 选择合适的培养基：不同的菌种对培养基的要求不同，应根据菌种的特性选择适宜的培养基。
厌氧菌的培养方法
1 液体培养基的厌氧培养法
培养基煮沸：驱气后置流水中急速冷却 添加还原剂：
0.03～0.05％L-盐酸半胱氨酸 0.01～0.02％硫乙醇钠 0.5～1％葡萄糖 0.1％抗坏血酸 其它还原剂 添加琼脂
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2 固体培养基的厌氧培养法
厌氧罐法 简易厌氧罐和厌氧袋法 钢丝绒法 焦性没食子酸法 抽气换气厌氧培养法 生物好氧厌氧培养法 转管技术和气体喷射培养法 厌氧手套箱法 （又称厌氧室法）
2.6 生物好氧厌氧培养法
疱肉培养基:
牛肉渣
0.5g
牛肉浸液 7ml
液面上加盖3～4mm厚的融化凡士林，灭菌。
生物好氧厌氧培养方法
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2.7 转管技术和气体喷射培养法
钢瓶进气 除氧气体
微量O2 H2源
铜柱
360℃ （亮黄色）
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CuO （黑色）
2.8厌氧手套箱法
又称厌氧室法
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干燥器容内径（厘米） 容器3
容积（毫升）
容器1
0.2克
柠檬酸0.6克
15cm（约2150毫升）
和
1.5克
碳酸氢钠0.7克
容器2
硼氢钠
氯化钴
或
0.6克
钯粒
18cm（约3500毫升） 1克
硼氢钠
氯化钴0.33克
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柠檬酸
2.2.2 厌氧袋法
聚碳酸酯（复合塑料膜）制厌氧袋 产气袋 厌氧指示剂 触媒
融化的白蜡封边
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2.5 抽气换气厌氧培养法
玻璃干燥罐 混合气钢瓶:
10％二氧化碳、10％的氢气、80％的氮气
三通阀 触媒:钯粒 / 浸泡钢丝绒 / 氯化钴 厌氧指示剂
厌氧培养的规范化操作
泰兴市人民医院检验科微生物室 刘鸿丽
概述: 厌氧菌感染通常是内源性的， 存在于人体的各个部位，病种遍及 临床各科。各种器官和组织都可以 发生厌氧菌感染，大部分是与需养 菌混合感染。常规细菌培养阴性， 很有可能是厌氧菌感染。因此，进 一步分离鉴定病原菌对感染的诊断、 治疗有重要意义。
厌氧菌鉴定流程 转种需氧培养 ↓ 35℃18-24h
转种厌氧培养 ↓ 35℃48~72h
↓ ↓ ↓ 阳性 阴性 阳性 ↓ ↓ ↓ 做需氧菌鉴定 考 虑 厌 氧 菌 ↓ 菌落革兰色染色、触酶试验、API20A鉴定 报告 报告菌种名或厌氧菌未生长
2.具体采样要求
1）从正常无菌部位或通过严格无菌操作采取，如血 液、胸腔液、腹腔液、心包积液、CSF、关节液以及 通过外科无菌手术或穿刺抽得脓液，或通过特殊技 术如纤维支气管镜取得下呼吸道标本及由阴道后窟 窿穿刺抽得盆腔脓液等。采集和运输过程中应避免 接触空气，及时送检。 2）经口吐出的痰不能避免咽喉部正常菌群感染，不 适宜做厌氧菌培养。可用纤维支气管镜采集。人工 气道如气管切开或气管插管患者，可用吸痰管理经 人工气道口插收标准
1）使用不合格的容器：有渗漏、污染或非无菌 的容器。
2）申请单不符合要求：无姓名、住院/门诊号，
无检验目的，检验目的与标本不符合。
3）标本不符合要求：未与空气隔绝，要求做厌
氧菌培养，经口吐出的痰要求做厌氧菌培养。采
样至送检超过2小时而未用运用培养基等。
4.样品的处理
厌氧菌在适当的培养基上，经35℃、厌氧环境 （80%N2、10%H2、10%CO2）下孵育48~72小时,经涂 片染色、菌落特征、耐氧试验、生化反应等作出 鉴定。
检验流程
1.流程图
厌氧菌的采集送检培养分离鉴定及注意事项
厌氧菌的采集送检培养分离鉴定及注意事项厌氧菌是一类在缺氧或无氧条件下生长的微生物。
由于其独特的代谢方式和生长环境的要求，厌氧菌的采集、送检、培养分离和鉴定需要特殊的注意事项。
下面将详细介绍厌氧菌的采集、送检、培养分离和鉴定的方法及注意事项。
一、厌氧菌的采集方法：1.采集样品时应尽量避免与空气接触，以防止厌氧菌暴露于氧气中而失活。
2.采集厌氧菌的样品应尽快送检，以确保其最佳生长环境。
常见的厌氧菌采集样品包括：创伤分泌物、组织切片、血液、体液、粪便等。
二、厌氧菌的送检和保存：1.送检时应明确注明样品为厌氧菌的检测，以便实验室作出相应的处理。
2.采样后，尽量将样品封存，避免与氧气接触，以确保厌氧菌生长环境的完整性。
3.若无法封存样品，应尽快送检至实验室。
三、厌氧菌的培养方法：1. 使用厌氧培养基来提供适宜的生长环境，如：血寒胁素琼脂培养基、Schaedler琼脂培养基等。
2.培养瓶或培养皿密封完好，以维持厌氧条件。
3.培养培养基时，应将其加热至48-50℃，以刺激厌氧菌的孢子萌发。
4.培养温度通常为35-37℃。
四、厌氧菌的分离方法：1.采用分离培养基，在含有抗生素的培养基上分离厌氧菌。
2.厌氧菌通常会在培养基上产生特殊的形态特征，如：斑点、颜色变化等。
3.通过剖析菌落形态特征，并进行细胞的染色观察来鉴定培养物中的厌氧菌。
五、厌氧菌的鉴定方法：1.根据厌氧菌的生物学特征进行初步鉴定，如：形态特征、生理特性等。
2.利用生化试验对厌氧菌进行进一步的鉴定，如：糖、氨基酸、营养盐的利用能力等。
3.利用分子生物学方法，如PCR、16SrRNA测序等进行鉴定。
六、厌氧菌的注意事项：1.在操作过程中应严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性菌的污染。
2.在培养过程中要注意保持相应的厌氧环境，如密封培养瓶或培养皿，避免与氧气接触。
3.在采集和送检过程中要注意样品的完整性和新鲜度，以提高厌氧菌的培养成功率。
4.在菌落鉴定过程中要仔细观察形态特征和生物学特性，以确保鉴定结果的准确性。
厌氧菌的培养方法 ppt课件
2 0.1 0.2
厌氧
无色
残存有氧气
蓝色
10
卢卡斯固体厌氧指示剂
2％硼砂溶液
5毫升
9％硫乙醇酸
1毫升
酚红溶液
0.1～0.2毫升
0.02％美兰溶液
10毫升
琼脂
1％
厌氧
无色
残存有氧气
蓝色
11
布鲁氏指示剂
60％羟甲基氨基甲酯 4％葡萄糖 0.02％美蓝
厌氧
无色
残存有氧气
蓝色
1 1 1
12
疱肉培养基:
牛肉渣
0.5g
牛肉浸液
7ml
液面上加盖3～4mm厚的融化凡士林，灭菌。
生物好氧厌氧培养方法
30
2.7 转管技术和气体喷射培养法
钢瓶进气 除氧气体
微 H2源
360℃
铜柱
（亮黄色）
量
O2
CuO （黑色）
31
2.8厌氧手套箱法
又称厌氧室法
32
33
3 厌氧培养方法的选择
亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培 养法
Gas-Pak法的使用操作程序 平皿培养基装入平皿架中置厌氧罐内； 打开内盖居中金属网袋，装入触媒钯粒； 打开锡箔纸袋，取出厌氧指示剂片； 剪开气体发生袋一角，注入10毫升水，迅速紧闭
罐盖，置培养箱中培养。 约经5～10分钟后，放入厌氧指示剂片。
注：操作较复杂，需注入水作为触媒。
13
2.2.1 简易厌氧罐
22
氧气指示剂颜色变化图解
1.新鲜指示剂为粉红色（无氧，左）和蓝色（有氧，右）， 重复使）和淡蓝色（有氧，中右）。 2.厌氧培养2-3小时后指示剂颜色变化稳定。