乳酸测定方法
乳酸 检测标准
乳酸检测标准
1.范围
2.本标准规定了乳酸的检测方法，适用于各种样品中乳酸含量的测定。
3.原理
4.本方法采用高效液相色谱法，通过色谱柱分离乳酸与其他组分，使用紫外
检测器检测乳酸的峰面积，从而计算乳酸的含量。
5.试剂
3.1 乳酸标准品：纯度应大于99%。
3.2 甲醇：色谱纯。
3.3 超纯水：电阻率大于18MΩ·cm。
6.仪器
4.1 高效液相色谱仪：具有紫外检测器。
4.2 色谱柱：C18反相色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
4.3 恒温水浴锅：温度波动±0.5℃。
7.样品制备
5.1 称取适量样品，加入超纯水制成溶液。
5.2 将溶液过膜，供高效液相色谱分析。
8.分析条件
6.1 流动相：甲醇+水=70+30（体积比）。
6.2 流速：1mL/min。
6.3 检测波长：210nm。
6.4 柱温：30℃。
6.5 进样量：10μL。
9.操作步骤
7.1 打开高效液相色谱仪，预热30分钟。
7.2 将乳酸标准品和样品分别注入色谱柱中。
7.3 记录色谱图，得到乳酸的峰面积。
7.4 根据峰面积计算乳酸含量。
10.结果表示
11.根据峰面积计算乳酸含量，可以使用以下公式进行计算：
12.乳酸含量（%）= （峰面积/标准品峰面积）×标准品浓度×100%
13.其中，标准品浓度为乳酸标准品的浓度，单位为mg/mL。
乳酸测定
安捷伦6890气相色谱仪，FID检测器，色谱柱为HP-FＦＡP19０９1F-４13型(30m*0.32mｍ＊0.25μm）毛细管柱。
色谱定量结果：乙酸（记为A乙ｇ／L)下同、丙酸(A丙g／L）、丁酸(A丁ｇ/L）、异丁酸（A异丁g/L)、戊酸(A戊g/L)、己酸（Ａ己g/Ｌ)、庚酸(A庚g/L）、辛酸（Ａ辛g/Ｌ）。
样品
测定值(ｍg/L）
平均值
SＤ
ＲSD(％）
1
2
3
４
5
6
7
乳酸
271.15
271.5３
272.33
27２.１9
２71．69
271.53
271.64
2７１.72
0.41
0.15
1.5.4回收率
取20ml样品各３份，其中1份作本底量,另外2份各添加已知量的标准液，经上述样品预处理后,测出乳酸在样品中的含量，并根据检测量计算出乳酸的回收率和精密度，结果表明样品的回收率及准确度满足分析要求，结果见表2。
3．3乳酸含量的求取
根据陈周平对浓香型白酒的测定,白酒中的有机酸含量有下列趋势:乙酸>己酸>乳酸>丁酸>甲酸>戊酸>棕榈酸>亚油酸>油酸>辛酸>异丁酸>丙酸>异戊酸>庚酸,而乙酸、己酸、乳酸、丁酸的含量加上辛酸、异丁酸、戊酸、庚酸、丙酸的含量占其总酸含量的９5％以上,其他的酸特别是高级脂肪酸的含量只有在发酵期较长的优质酒中才有一定的含量，在一般发酵期和一般质量的酒中，含量甚微,因此,未测出的有机酸基本都可以忽略不计。所以乳酸的含量求得为:
1．3试剂及标准溶液的配制
1.3.1内标溶液的配制
(改)乳酸的对羟基联苯比色法测定
乳酸的对羟基联苯比色法测定1试剂乳酸溶液：称取乳酸钙（C6H10CaO6.5H2O，分子量308.29；乳酸为CH3CH(HO)COOH，分子量为90.08，即乳酸钙中含两份乳酸）0.1730g（即308.29/((90.08-1)×2)=1.730，乳酸含量为0.1g）。
用去离子水定容至100ml溶解，即这1000 ug/ml。
从中取出10ml，定容到100ml容量瓶中。
即含量为100ug/ml。
20%硫酸铜溶液：称取20克硫酸酮（CuSO4.5H2O）用100ml去离子水溶解。
对-羟基联苯试剂：称取1.5g，用浓度为5%（W/V）氢氧化钠溶液20ml溶解，去离子水定溶到100ml，棕色试剂瓶中冷藏保存备用。
不能加热溶解。
5%的氢氧化钠：称取5g氢氧化钠溶于100ml的蒸馏水中。
2步骤①青贮饲料浸提液1ml用去离子水进行稀释，稀释浓度根据青贮料的乳酸含量决定。
用20g，加入100ml去离子水，5℃下静置24h。
再取1ml浸提液稀释至100ml，即测出结果约为50ug左右，取1ml从②-⑧中直测。
（测出乳酸的结果一般为2%左右）。
②加入一滴20%硫酸铜溶液，摇匀。
③将试管置于冰水中，缓慢加入6ml浓硫酸，并混匀。
④放入沸水浴中煮沸5min。
⑤试管从沸水浴中取出后，用水冷却到室温，并加入0.2ml的对-羟基联苯试剂，小心摇匀试管内容物。
⑥将试管放入30℃恒温水浴中反应30min显色，振荡摇匀。
⑦为去除多余对-羟基联苯试剂，将试管在沸水浴中再煮沸3min。
⑧取出，冷却后，分光光度计波长560nm（乳酸的吸收波长为243nm）处比色测定OD值。
3 标准曲线的制作①取12支大试管，分为2组（原数据为6组），分别向每组试管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml浓度为100ug/ml的标准乳酸溶液。
系列中各乳酸含量为：0、20、40、60、80、100ug。
②向各试管中添加去离子水，即：1、0.8、0.6、0.4、0.2、0，定容至1ml。
乳酸测定
乳酸的测定:
另取4支洁净、干燥的试管，编号，各加入浓硫酸2ml ，将试管置于冰浴中冷却。
用小滴管取各样品滤液2滴逐滴加到已冷却的上述浓硫酸溶液中，边加边摇动冰浴中的试管，避免局部过热。
将各管混匀后，放入沸水浴5min ，加入对羟基联苯试剂2滴混匀，冷却后，比较和记录各管溶液的颜色深浅。
编号 试剂 样品 空白
1
2
3
4
肌肉靡（g ） 0.5
20%三氯乙酸（ml ）
3 3
1/15M 磷酸缓冲液（ml ） 3 0.5%淀粉溶液（ml ）
1
充分摇匀，加液体石蜡封口隔绝空气，37℃水浴1h ，后吸出石蜡。
20%三氯乙酸（ml ） 3
3
饱和硫酸铜溶液（ml ） 1 氢氧化钙粉末（g ）
0.4
充分搅拌，放置10min,并不时搅动内容物，分别过滤，弃去沉淀。
五、实验结果：
肌糖原酵解作用实验结果
空白组（左，基本透明无色）样品组（右，紫罗兰色）
根据实验图判断，样品管中发生了肌糖元酵解，生成的乳酸转变为乙醛后与对羟基联苯反生明显的显色反应，呈现紫罗兰色，空白管因酶失活未发生反应，无颜色变化。
六、实验注意事项
1、实验中用淀粉代替了肌糖元，因为淀粉与肌糖元结构类似，均为葡萄糖分子的高聚糖，淀粉因支链少分解较糖原稍慢，应保证37度水浴时间充足。
2、滴加液体甘油石蜡不宜过多，避免后期过滤困难。
3、测定乳酸的试管必须保证干燥、洁净。
4、最后除糖及蛋白质步骤一定要彻底，保证滤液无杂质干扰，以免影响显色结果。
乳酸含量的测定
乳酸的测定—中和滴定法应用范围：本方法采用滴定法测定乳酸(C3H6O3)的含量。
方法原理：供试品加水溶解后，再精密加入氢氧化钠滴定液（1mol/L）25mL，煮沸5分钟，加酚酞指示液2滴，趁热用硫酸滴定液（0.5mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正，酚酞指示液变红时停止滴定，读出硫酸滴定液使用量，计算乳酸含量。
试剂：1. 水（新沸放置至室温）2. 氢氧化钠滴定液（1mol/L）3. 硫酸滴定液（0.5mol/L）4. 酚酞指示液5. 甲基红-溴甲酚绿混合指示液6. 乙醇7.基准邻苯二甲酸氢钾8.基准无水碳酸钠试样制备：1. 氢氧化钠滴定液（1mol/L）配制：取澄清的氢氧化钠饱和溶液56mL，加新沸过的冷水使成1000mL。
标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约6g，精密称定，加新沸过的冷水50mL，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示液2滴，用本液滴定，在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。
每1mL氢氧化钠滴定液（1mol/L）相当于204.2mg的邻苯二甲酸氢钾。
根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。
C(NaOH)=m/0.2042*(V1-V2)M——邻苯二甲酸氢钾的质量；V1——氢氧化钠的消耗量；V2——空白贮藏：置聚乙烯塑料瓶中，密封保存；塞中有2孔，孔内各插入玻璃管1支，1管与钠石灰管相连，1管供吸出本液使用。
2.酸滴定液（1 mol/L）配制：取硫酸30m L，缓缓注入适量的水中，冷却至室温，加水稀释至1000mL，摇匀。
标定：取在270-300℃干燥恒重的基准无水碳酸钠约1.5g，精密称定，加水50mL 使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10滴，用本液滴定至溶液由绿色变为紫红色时，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液颜色有绿色变为暗紫色。
有机酸的分析与检验——对羟基联苯比色法测定乳酸含量
有机酸的分析与检验——对羟基联苯比色法测定乳酸含量有机酸是一类含有羧基（COOH）的有机化合物，具有特殊的化学性质和广泛的应用。
有机酸的分析与检验对于实验室研究和工业生产都具有重要意义。
其中，对羟基联苯比色法可以用于测定乳酸含量。
乳酸（lactic acid）是一种常见的有机酸，是由乳酸菌在发酵过程中产生的。
乳酸广泛应用于食品工业、药品工业和医药领域。
因此，测定乳酸含量是非常重要的。
对羟基联苯比色法基于乳酸与对羟基联苯反应生成有色产物的原理进行测定。
该方法操作简便，灵敏度高，具有较高的准确性和精密度。
具体操作步骤如下：步骤一：制备标准曲线1.准备一系列乳酸浓度逐渐递增的标准溶液。
可以使用已知浓度的乳酸溶液进行稀释，或通过乳酸的溶液配制。
2.将标准溶液分别转移到不同的容量瓶中，加入定量的对羟基联苯试剂。
3.在常温环境下，利用分光光度计测量乳酸和对羟基联苯试剂反应产生的有色产物的吸光度。
4.利用所得吸光度数据绘制乳酸浓度与吸光度之间的标准曲线。
步骤二：样品处理1.取适量待测样品，用水稀释至一定体积。
2.将稀释后的样品分别转移到不同的容量瓶中。
3.各个容量瓶中加入定量的对羟基联苯试剂。
4.在常温环境下，利用分光光度计测量样品和对羟基联苯试剂反应产生的有色产物的吸光度。
步骤三：计算样品中乳酸含量1.根据标准曲线，利用所得吸光度数据计算出样品中乳酸的浓度。
2.根据样品的稀释倍数和最初样品的体积，计算出样品中乳酸的实际含量。
需要注意的是，实验过程中应该严格控制温度和时间，避免有色产物与空气中的氧气反应产生误差。
此外，对乳酸本身的特性和分子结构也需要了解，以正确操作和解读实验结果。
通过对羟基联苯比色法测定乳酸含量，可以实现对有机酸乳酸的定量分析。
这种方法具有操作简便、准确度高的特点，适用于实验室研究和工业生产过程中乳酸含量的测定。
乳酸的测定——EDTA滴定乳酸钙法
乳酸的测定——EDTA滴定乳酸钙法1 实验原理1.1 乙二胺四乙酸（简称EDTA，常用H4Y表示）难溶于水，通常使用其二钠盐配制标准溶液。
标定EDTA溶液常用的基准物有Zn、ZnO、CaCO3、Bi、Cu、MgSO4·7H2O、Hg、Ni、Pb等。
通常选用其中与被测组分相同的物质作基准物，这样滴定条件较一致。
EDTA溶液若用于测定石灰石或白云石中CaO、MgO的含量，则宜用CaCO3为基准物。
首先可加HCl溶液与之作用，其反应如下：CaCO3+2HCl═CaCl2+H2O+CO2↑然后把溶液转移到容量瓶中并稀释，制成钙标准溶液。
吸取一定量钙标准溶液，调节酸度至pH≥12，用钙指示剂作指示剂以EDTA滴定至溶液从酒红色变为纯蓝色，即为终点，其变色原理如下：钙指示剂（常以H2Ind表示）在溶液中按下式电离：H3Ind═2H++HInd2-在pH≥12溶液中，HInd2-与Ca2+离子形成比较稳定的络离子，反应如下：HInd2-+Ca2+═CaInd-+H+纯蓝色酒红色所以在钙标准溶液中加入钙指示剂，溶液呈酒红色，当用EDTA溶液滴定时，由于EDTA与Ca2+离子形成比CaInd-络离子更稳定的络离子CaY2-，因此在滴定终点附近，CaInd-络离子不断转化为较稳定的CaY2-络离子，而钙指示剂则被游离了出来，其反应可表示如下：CaInd-+H2Y2-═CaY2-+ HInd2-+H2O酒红色无色纯蓝色由于CaY2-离子无色，所以到达终点时溶液由酒红色变成纯蓝色。
用此法测定钙，若Mg2+离子共存（在调节溶液酸度为pH≥12时，Mg2+离子将形成Mg(OH)2沉淀），此共存的少量Mg2+离子不仅不干扰钙的测定，而且会使终点比Ca2+离子单独存在时更敏锐。
当Ca2+、Mg2+离子共存时，终点由酒红色变到纯蓝色，当Ca2+离子单独存在时则由酒红色变紫蓝色，所以测定单独存在的Ca2+离子时，常常加入少量Mg2+离子溶液。
乳酸检验方法
乳酸检验方法
乳酸的检验方法较多，包括EDTA定钙法、羟基联苯法、乳酸脱氢酶法、高效液相色谱法和酶电极分析法等。
1、EDTA定钙法。
通过发酵液中的乳酸与CaCO3反应生成乳酸钙，再用EDTA标准溶液滴定乳酸钙中的钙，最终计算乳酸含量。
但该方法测得值高于实际乳酸含量，误差较大。
2、羟基联苯法。
通过发酵饲料中加入硫酸铜和浓硫酸，使乳酸与羟基联苯反应生成加色产物，再通过测定光吸收值来计算乳酸含量。
该方法准确度稍高。
3、乳酸脱氢酶法。
利用乳酸脱氢酶催化乳酸与辅酶NADH反应，通过测定NADH的生成量来确定乳酸含量。
该方法准确性较高，速度较快，但成本较高，适用于特定时期快速检测乳酸含量的场合。
4、高效液相色谱法。
通过简单处理发酵液样品，使用反相色谱柱并以磷酸为流动相，在特定波长下进行检测，可以准确分离并测定乳酸、苹果酸和富马酸。
5、酶电极分析法。
利用固定化乳酸氧化酶催化乳酸的氧化反应产生电流变化，通过测量电流来计算乳酸含量。
该方法具有高专一性、长期稳定性和快速灵敏的特点，适用于快速测定乳酸含量的情况。
此外，还有电位滴定法、离子交换树脂法、气相色谱法、光度法和磁共振法等乳酸含量测定方法。
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乳酸的测定：
对羟基联苯比色法（参照高庆，2005）
1.材料、试剂与仪器
无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸、蔗糖、无水葡萄糖均为分析纯试剂。
主要溶液：
①钨酸溶液：L硫酸及10%(W/V)钨酸钠(Na2WO4·2H2O)溶液等体积混合，当天使用前配制；
②20%(W/V)硫酸铜溶液：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O) 20g，加蒸馏水70ml，加热使之溶解，再加入蒸馏水定容至100ml；
③对羟基联苯溶液：称取对羟基联苯溶于100ml 的L氢氧化钠溶液中( 配制时加热助溶，溶解后为澄清液体) ，贮存于棕色瓶中，保存于4℃冰箱，可使用一个月；
④乳酸标准储存液(1mg/ml)：精确称取无水乳酸锂，溶于50ml 蒸馏水中，加L 硫酸20ml，后加蒸馏水定容至100ml，混匀后保存于4℃冰箱。
⑤4%(W/V)硫酸铜溶液：20%硫酸铜溶液10mL 加蒸馏水稀释至50mL。
⑥乳酸标准应用液(200μg/mL):使用时取储存液10mL用蒸馏水稀释至50mL。
在冰箱中可保存数天。
主要仪器：
UNIC UV-2100 紫外可见分光光度计、TGL-16B 离心机、恒温水浴锅、具塞试管5ml及具塞比色管20ml。
2. 方法
青贮浸提液样品预处理
取适量青贮浸提液样品5000r/min离心10min，取上清液适当稀释，吸取稀释液于洁净离心管中，加入钨酸溶液，混匀，室温静置，直至溶液中出现明显絮状物（约30～45min），10000r/m 离心10min，取上清液置于5ml 洁净具塞试管中，60℃水浴保温30min 左右，冷却待用。
标准曲线的制作
①用200Lg/mL乳酸应用标准液
同青贮样品浸提液预处理方法一样预处理后(可以不稀释),按下表数量在预先编好号的试管中加入标准乳酸滤液和蒸馏水。
②各管中分别加入氢氧化钙粉末100mg,混匀,8000r/min离心5min,取上清液,加入预先加有20mg氢氧化钙粉末的小试管中,混匀,加20%硫酸铜溶液,称重,迅速混匀,沸水浴3min,水浴冷却,补足重量,3000r/min离心5min,各吸上清液加入比色管中。
③在各管加入25μL的4%硫酸铜溶液,混匀后置冰水浴内冷却。
④将预冷的浓硫酸缓缓加入各管中,每管各加,边加边摇,混匀后置沸水浴中准确加热5min,取出后迅速置冰水浴中冷却3min左右。
⑤在各管中加%对羟基联苯溶液,充分振摇后,放置,其间每10min 混摇一次。
⑥各管置于沸水浴中准确加热90s,立即放入冰水浴中冷却。
在波长565nm处用lcm比色皿,1管作为参比,分别测定吸光度(A)。
所得数据以乳酸含量为横坐标,以565nm处的光吸收为纵坐标,作标准曲线。
青贮样品浸提液中乳酸含量的测定
取青贮样品浸提液滤液按标准曲线的测定
方法,以蒸馏水为空白测定其在560nm处的光吸收,所得数据在标准曲线上查得相应的乳酸含量,即为青贮样品浸提液中的乳酸含量。
样品中乳酸含量=计算值×稀释倍数
需要试剂：
无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸、蔗糖、无水葡萄糖均为分析纯试剂。
需要器材：
分光光度计、离心机、离心管、恒温水浴锅、具塞试管5ml及具塞比色管20ml。