多重连接依赖性探针扩增技术在产前诊断中的应用

多重连接依赖性探针扩增技术在产前诊断中的应用发表时间：2012-07-03T14:38:52.873Z 来源：《医药前沿》2012年第3期供稿作者：刘青松朱兴春唐中[导读] 染色体非整倍体改变在临床上十分常见，传统的检测方法有胎儿标本的核型分析和荧光原位杂交技术。

刘青松1, 2 朱兴春1, 2 唐中1, 2 (通讯作者)(1川北医学院医学检验系四川南充 637000；2川北医学院附属医院检验科四川南充 637000)【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）03-0135-03产前诊断是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患胎的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。

多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术是在多重扩增探针杂交(MAPH)技术的基础上改进而来，基本原理是针对基因组内拷贝数变异(CNV)对可与样本DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和半定量分析，具有精确度高、重复性好、操作简便及通量大等特点。

MLPA已广泛应用于染色体数目异常、遗传性疾病基因缺失重复、单核苷酸多态性、甲基化等多个研究领域等。

随着MLPA不断被改进，目前已成为临床上常用的产前诊断工具之一，因此本文就其在产前诊断中的应用做一总结。

1 MLPA原理MLPA是集DNA杂交技术、PCR技术、连接酶反应技术和毛细管电泳技术与一体，具有高特异性、高灵敏性和高通量的一种分子生物学技术。

MLPA最大特点在于探针的设计。

探针包括两个长短不一的荧光标记寡核苷酸片段。

短探针(5' 端探针)为化学合成而来，长约50-60bp，包括一段3'端与靶序列完全互补的杂交序列和一段5' 端长19 nt的共同PCR上游引物互补序列。

长探针(3'端探针)是经M13噬菌体衍生法制备而来，长约60-450bp，包括一段5'端与靶序列完全互补的杂交序列和一段3'端23nt共同PCR下游引物相互补序列及一段长度不一的中间填充序列。

由于填充序列长短不一，连接后总长度在130 nt-480nt之间，相邻两探针扩增产物长度相差6-9 nt，因而能在一个反应体系中，仅用一对引物即可扩增达45个不同的核苷酸序列。

由此可见，MLPA所得到了产物不是直接针对原始样本中存在的序列，而是由两条探针经连接反应形成的片段。

连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，连接反应才能进行，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。

当连接反应完成，随后进行PCR扩增，产物经毛细管电泳，收集相应扩增峰。

如果检测的靶序列发生突变、缺失或扩增，相应探针的扩增峰便会消失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或突变存在。

2 MLPA 在产前诊断中的应用2.1 胎儿染色体非整倍体检测染色体非整倍体改变在临床上十分常见，传统的检测方法有胎儿标本的核型分析和荧光原位杂交技术。

然而核型分析具有细胞培养周期长，甚至培养失败而得不到分析结果的风险；荧光原位杂交技术价格高，且只能针对部分染色体。

MLPA作为新发展的产前诊断技术代表，因其具有分析周期短、高通量等特点，在其发展初期就应用于临床，尤其是对非整倍体变异的检测。

Slater [1], Hochstenbach[2]和Gerdes [3]就采用商业化MLPA SALSA P001试剂盒对非整倍体进行产前诊断。

最近，vanOpstal [4], Gerdes[5], Kooper[6,7]和 Boormans [8]采用商品化MLPA P095试剂盒对10110分未经培养的羊水标本和2525份绒毛标本进行13, 18, 21, X和Y 染色体拷贝数进行分析。

发现MLPA不仅可对非嵌合体变异能够做出准确诊断，对于部分三体的嵌合体变异也能做出相应的检出。

国内，江雨[9]等采用MLPA技术对179例羊水、90例脐带血和13例绒毛标本进行13号、18号、21号和X、Y染色体进行检测，共发现染色体异常标本17例，其中21三体7例、18三体5例、45,X单体3例、13三体1例和47, XYY三体1例。

2.2 先天性心脏病检测先天性心脏病是常见的胎儿临床表现，其发病机制复杂，涉及基因众多。

目前，临床对先天性心脏病的诊断是通过经胸心脏彩色超声、胸部x线、心电图以及临床症状和体征进行诊断。

这些方法可以帮助判断畸形部位或脏器功能，但不能提供病因学方面的信息，也无法对再次妊娠的风险进行精确评估。

因此有必要对先天性疾病的靶基因进行进一步的检测。

Jeroen [10]等采用MLPA技术对与先天性心脏病有关10q23.2.q23.31微缺失进行检测，并确定了BMPR1A为主要效应基因。

该研究团队认为BMPR1A的缺失与房室间隔缺损相关。

国内，陈瑛 [11]等采用MLPA P250商品化试剂盒对100例散发的先天性心脏病标本(40例产前超声诊断为心脏畸形的胎儿，60例为先天性心脏病患儿)22q11微缺失情况进行了检测，发现胎儿标本中有2例为22q11微缺失，先天性心脏病患儿有1例22q11微缺失，3例检测出22q11微缺失的患儿，2例为3M典型缺失，1例为非典型缺失。

杨月华[12]等也对22q11区域的基因拷贝数进行检测，在181例先天性心脏病患儿和14例胎儿中发现8例异常患者，涉及房间隔缺损、房室间隔缺损、肺动脉狭窄和法洛四联症。

2.3 遗传性代谢性疾病检测遗传性代谢病是指一类因基因突变引起蛋白质结构和功能紊乱，特异酶催化反应消失、降低或升高而导致细胞和器官功能异常的疾病。

涉及蛋白质、糖、脂肪、电解质和无机元素等代谢障碍，临床上常见的如白化病、血红蛋白病、半乳糖血症、糖原储积症等等。

临床上传统检测方法是通过PCR技术对所涉及基因进行检测。

然而随着MLPA技术的发展，该技术在对这类疾病的病因学分析优势越发凸显。

Annalisa [13]团队对因α半乳糖苷酶缺乏引起的Fabry疾病进行检测，他们采用MLPA技术对GLA基因的多个外显子进行了检测，并通过测序技术进行了验证，不仅验证了该方法的可行性而且还发现了两个新缺失。

Kent [14]和Albena [15]团队采用MPLA技术检测DMD疾病，Kent 在所检测的63个对象中有43个为DMD/BMD患者，另有20个为女性携带者。

MLPA不仅检测出了传统多重PCR方法检测出的所有的缺失和重复，另外还发现了4个多重PCR未检测出的突变。

Albena对27个DMD/BMD患者进行了分析，发现了17个缺失，6个重复和1个点突变，另有2个点突变(其中一个为新突变)未检测出。

上述两个研究团队的实验说明MLPA不仅具有强大的DMD/BMD疾病常见突变的检测能力，而且还可用来检测点突变。

Alessia [16]等采用MPLA技术检测α地中海贫血。

他们采用MLPA技术对α-globin基因进行了分析，共检测了25个个体，其中18位携带者，5位患者和2位含有β-globin基因突变的地中海贫血中间患者。

发现了13为携带者和全部5位患者含有致病突变，2为地中海贫血中间型患者为α-globin三体。

2.4 智力障碍智力障碍/脑发育迟缓是多种原因引起的发育时期认知和社会适应能力下降。

其临床表型多样，病因复杂，包括遗传因素和非遗传因素，遗传因素日益突现，其中亚端粒异常占有较大的比例。

季涛云[17]等采用MLPA和基因芯片技术对627例智力障碍/脑发育迟缓患儿亚端粒区拷贝数异常进行检测，发现41例阳性标本，其中30例为单一缺失，6例单一重复，还有5例同时存在缺失和重复。

2.5 胎儿其他先天性异常检测早在2005年，Mario [18]等就报道用MLPA技术用于对遗传病的诊断。

该研究团队第一个研究对象是一个25个月大的小女孩，临床表现为色素减退，无其他异常，染色体分析为19号染色体为环状。

通过采用MLPA等技术并未发现亚端粒缺失，从而排除了该患者的表型与该染色体亚端粒缺失的关系。

第二个对象为一个9岁的女孩，临床表现有特殊面容，中等身材和智力迟缓。

染色体分析为在2p有一段不确定增加，用MLPA等技术检测发现这段增加的片段为2q35-q37.3的重复，并没有伴随2pter及其他染色体区域的丢失，从而认为该患儿是2q部分三体。

该研究从另一个侧面反映了MLPA技术在对遗传性疾病表型与基因型的关系更具实际意义。

2009年，Paola [19]等采用MLPA技术对先天性肾上腺增生症做出检查。

该研究团队对已经用测序和Southern杂交技术对已经确诊的18例先天性肾上腺增生症胎儿采用MLPA技术对CYP21A2基因进行检测，发现了7个已知的缺失和两个重复序列。

3 总结遗传学检测尤其是分子生物学检测方法在产前诊断中的应用对遗传性疾病的病因学分析具有重要作用，MLPA是近十年发展起来的突出代表，是集DNA探针杂交和PCR技术于一体，且充分利用连接反应高度特异特点的一种新分子生物学技术。

MLPA不仅对已知突变具有诊断能力，还具有发现新突变作用，且因其高通量特点不仅具有对单基因遗传病和染色体病的诊断作用，且对多基因遗传病也具很好的诊断作用。

MLPA的检测分辨率也是其一项重要优势，从单个碱基突变到整条染色体数量变化都在它的检测范围之内。

随着基因芯片微阵列技术的结合，MLPA达到了高通量水平，将更适合于特定疾病的研究，对于临床应用有更大的价值。

综上所述，相信随着分子生物学技术的发展，MLPA在产前诊断领域中的应用必将更广泛、更成熟。

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