CD83、CD1a标记肿瘤浸润性树突状细胞在大肠癌中的表达及其预后意义
树突状细胞的标志物CD1a和CD83在子宫腺肌症中的表达及意义
树突状细胞的标志物CD1a和CD83在子宫腺肌症中的表达及意义魏静波;刘辉;朱小茼;江小华;曲银娥【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2016(039)001【摘要】目的:探讨不同分化阶段树突状细胞(DCs)在子宫腺肌症发病中的作用.方法:收集子宫腺肌症组异位内膜、在位内膜及正常对照组内膜,应用免疫组织化学和免疫印迹检测不同分化阶段DCs的分布、形态及其标志物CD1a、CD83蛋白的表达情况.结果:DCs均分布于腺体间、血管间,CD1a+ imDCs呈圆形、卵圆形,CD83+ mDCs形态不规则,有多个突起;子宫腺肌症组CD1a的表达较正常对照组明显增高,且子宫腺肌症异位内膜CD1a的表达较在位内膜显著增高;子宫腺肌症组CD83的表达较正常对照组明显降低,且子宫腺肌症异位内膜CD83的表达较在位内膜显著降低.结论:局部组织CD1a+imDCs数量的增加及CD83+ mDCs数量的减少促进子宫腺肌症的发生发展.【总页数】4页(P49-52)【作者】魏静波;刘辉;朱小茼;江小华;曲银娥【作者单位】华北理工大学组织学与胚胎学系,唐山 063000;华北理工大学校长办公室,唐山 063000;华北理工大学心理学院,唐山 063000;华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病重点实验室,唐山市慢性病临床基础研究重点实验室,唐山 063000;华北理工大学组织学与胚胎学系,唐山 063000【正文语种】中文【相关文献】1.前列腺癌浸润性树突状细胞CD1a、CD83的表达及与临床指标的相关性分析[J], 潘明沃;陈志强;古炽明;王树声;向松涛;吕立国;代睿欣2.CD1a与CD83标记肿瘤浸润性树突状细胞在乳腺癌中的表达及相关性研究 [J], 王敏学;刘守跃;金永民;崔现;崔演;崔海;沈雄虎;张松男;孙红花3.CD1a和CD83在舌鳞癌中的表达及其意义 [J], 彭参;陈仲伟;徐冬贵;罗朝阳;朱李军;王启朋;冯航;江穗4.结直肠癌组织中树突状细胞标志物CD1 a和CD83的表达及意义 [J], 魏静波;刘辉;谢朝辉;曲银娥5.CD83、CD1a标记肿瘤浸润性树突状细胞在大肠癌中的表达及其临床意义 [J], 刘宙;杨伟明;赵洪远;王超宇;邬江华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大肠癌干细胞标记物及其相关信号通路的研究进展
大肠癌干细胞标记物及其相关信号通路的研究进展
梅命珠;隋华;张怡;程悦蕾;柴妮;朱惠蓉
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2015(0)45
【摘要】存在于大肠癌组织中的大肠癌干细胞,虽只占极少部分,但其对大肠癌的发生、发展起关键作用. 目前,关于大肠癌干细胞的研究主要集中于大肠癌干细胞的筛选和鉴定方面及大肠癌干细胞的产生机制等,关于大肠癌干细胞的标记物有CD44、CD133、CD24、CD26、富含亮氨酸G蛋白偶联受体5与乙醛脱氢酶1,大肠癌干细胞的相关信号通路包括Wnt、Hedgehog和Notch通路. 这些信号通路在维持大肠癌干细胞生长及增殖中具有重要作用.
【总页数】4页(P98-101)
【作者】梅命珠;隋华;张怡;程悦蕾;柴妮;朱惠蓉
【作者单位】上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;上海中医药大学附属曙
光医院,上海 201203;上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203
【正文语种】中文
【中图分类】R735.3
【相关文献】
1.大肠癌相关标记物的研究进展 [J], 李海;侍明海;马晓强;杨银学
2.结直肠癌干细胞相关标记物的研究进展 [J], 钮仕琦;张娜;刘昆;原晋阳;贾彬
3.HIPPO-YAP/TAZ信号通路与干细胞分化相关信号通路交叉作用的研究进展 [J], 顾客;田慧;李傲楠
4.结肠癌干细胞标记物及其相关通路的研究进展 [J], 李福玲;周丽萍;
5.胶质瘤干细胞表面标记物CD133及相关靶向治疗的研究进展 [J], 曾叙;何海平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CD133、β-catenin及hTERT在大肠癌中的表达及意义的开题报告
CD133、β-catenin及hTERT在大肠癌中的表达及意义的开题报告题目：CD133、β-catenin及hTERT在大肠癌中的表达及意义一、研究背景和意义大肠癌作为常见的恶性肿瘤之一，临床上具有高发病率、高死亡率和高复发率的特点。
虽然随着治疗方法的不断更新和完善，大肠癌的综合治疗效果得到了显著提高，但其仍面临着诸多挑战。
因此，对大肠癌的生物学特征和发病机制进行深入的研究，有助于开发新的治疗策略并提高治疗效果。
CD133、β-catenin和hTERT作为肿瘤干细胞标记物及关键的信号通路分子，在多种癌症中的表达受到了广泛的关注。
在大肠癌中，它们的表达与肿瘤的发生、进展以及预后密切相关。
据研究表明，CD133是大肠癌干细胞的标记物，其在大肠癌患者的生存期和预后中发挥着重要的作用；β-catenin是Wnt/β-catenin通路的重要组成部分，其在大肠癌细胞中的异常激活常常引发肿瘤发生、进展和转移；hTERT则是人类端粒酶的催化亚基，其在大肠癌中的异常表达与肿瘤的生长、转移和化疗抵抗密切相关。
因此，本研究旨在探讨CD133、β-catenin和hTERT在大肠癌中的表达及其意义，为大肠癌的治疗和预后评估提供重要的参考依据。
二、研究内容和方法本研究选取100例手术切除的大肠癌组织及其癌旁正常组织作为研究样本，采用免疫组化、实时荧光定量PCR和Western blot等技术手段，分析CD133、β-catenin和hTERT在大肠癌组织和癌旁正常组织中的表达，并探讨其与患者的临床病理特征及预后的关系。
三、研究意义和预期结果通过本研究的实验数据和结果分析，可以更加深入地了解CD133、β-catenin和hTERT在大肠癌中的表达情况及其表达与患者生存期和预后的相关性。
并可进一步明确这些信号通路分子在大肠癌发生、进展及转移中的作用和机制，为大肠癌的精准治疗提供重要的参考依据。
大肠癌组织中CD1a、Ki-67的表达变化及意义
例 ，Ｄ ａＫ－７表 达与 大肠 癌 患者 临 床病 理 参 数 的 Ｃ 、ｉ ６ 关 系见表 １ 由表 可见 ， Ｄ ａ、ｉ ７表 达 与大 肠癌 。 Ｃ Ｋ－ ６ 患者 Ｄ ｋｓ ｕ ｅ 分期 、 生存 时 间有关 ， Ｐ均 ＜ ．５ ００ 。
进行 抗原 递呈直 接关 系到免 疫激 活或免 疫 耐受 的诱
检 验 。Ｐ≤０ ０ 为 差异有 统计学 意义 。 ．５ 大肠 癌 组织 中 ， Ｄ ａ阳性 ２ Ｃ ４例 ， ｉ ７阳性 ３ Ｋ－ ６ ７
导 。在机 体 的抗 肿 瘤免 疫 反 应 中 ， 细胞 免疫 是 主 要 形式 。只要 机体 产 生有 效 地 抗 肿瘤 细 胞 免 疫 应答 ，
３ 讨 论
能得到 更进一 步 地提 高 。研 究 表 明 ， 源 结肠 癌 患 同 者外 周血 中 的 Ｄ Ｃ和 Ｔ淋 巴细 胞共 孵后 能 抑 制裸 鼠 体 内移植 瘤 的生长 Ｊ ２。本 研 究 发 现 ， 大肠 癌 组 织 中
Ｃ 与 Ｄ ｋｓ Ｄａ ｕ ｅ 分期 密切相 关 。 ｔ５ａ生存 者 大肠 癌 ＞
表 １ Ｃ ａ Ｋｉ ７表达与大肠癌患者 临床病理参数免疫组 化法 检 测 了大肠 癌 组 织 中
的 Ｃ 、 ｉ ７ 并探 讨 二者 在大 肠 癌 发生 发 展 中 的 Ｄ ａ Ｋ－ ， ６
作用 。
１ 材 料与方 法
１ １ 临床 资料 ．
山东 医药 ２ １ ０ ０年第 ５ ０卷 第 ２期
大肠 癌 组 织 中 Ｃ 。 、 ｉ ７的表 达 Ｄ ａＫ一 ６
变 化 及 意 义
刘 宙 ， 伟 明 ’ 赵洪 远 。 杨 。 王超 字 。 邬江华
浅析CD83、CD1a标记肿瘤浸润性树突状细胞在大肠癌中的
作用摘要肿瘤浸润性树突状细胞（tumor-infiltrating dendritic cells，TIDCs）在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视。
CD83和CD1a作为tumor-infiltrating dendritic cells 的标记，是研究tumor-infiltrating dendritic cells在肿瘤中作用的热点之一。
本文通过对CD83和CD1a的简要介绍，以及它们在大肠癌中的作用的浅析，旨在增进对tumor-infiltrating dendritic cells的理解，为肿瘤免疫疗法的开发提供参考。
前言大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，对人类健康造成严重威胁。
越来越多的研究表明，tumor-infiltrating dendritic cells在肿瘤免疫中发挥着重要的作用，并且CD83和CD1a是其常用的标记。
CD83和CD1a标记的TIDCs在大肠癌中的作用是本文要讨论的问题。
什么是CD83和CD1aCD83是一种表达在成熟的树突状细胞（dendritic cell，DC）和淋巴细胞上的膜分子，属于Ig超家族。
CD83在免疫应答中具有重要的调节作用，可以促进T 淋巴细胞的活化和增殖。
同时，CD83还能抑制T淋巴细胞的背景活性，因此在肿瘤免疫中具有很大的潜力。
CD1a也是一种膜分子，在DC中表达得相对较多。
CD1a可以结合到CD1a限制性T细胞的T细胞受体上，从而刺激T细胞对感染的细胞产生反应。
因此，CD1a也是DC在免疫应答中的一个重要分子。
CD83和CD1a在大肠癌中的作用研究表明，在大肠癌的早期，TIDCs数量较多，而在癌细胞的浸润过程中，TIDCs数量逐渐减少，同时其功能也受到抑制。
CD83和CD1a标记的TIDCs在这一过程中的作用有以下几个方面：1.增强抗原递呈和激活T细胞的能力CD83和CD1a标记的TIDCs具有良好的抗原递呈和激活T细胞的能力。
在大肠癌中，TIDCs能够递呈癌细胞表面的抗原，从而激活T细胞对癌细胞的攻击。
CD83,CD1a和Ki-67在大肠癌中的表达及意义
方法: 采用免疫组织化学和流式细胞术检测 60例大肠癌组织中CD83、CD1a和Ki-67的表 达情况, 并分析其与大肠癌临床病理特点和 预后的关系.
结果: 免疫组织化学检测显示, 低Dukes分 期、预后好的癌组织中CD83和CD1a阳性率 均显著高于对应组(均P <0.05), 而FCM检测只 显示CD1a阳性率显著高于对应组(均P <0.05); 两检测均显示, 高Dukes分期、预后差的癌组
Prognostic significance of CD83, CD1a and Ki-67 expression in colorectal carcinoma
Xue-Feng Yang, Wei-Ming Yang, Zhou Liu, Hong-Yuan Zhao, Chao-Yu Wang, Jiang-Hua Wu
0 引言 大肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界第三大 常见的恶性肿瘤, 在欧美国家居恶性肿瘤死因 的第2位[ . 1-2] 随着我国饮食结构、生活习惯和 环境的改变, 其发病率逐年上升[3], 和大多数恶 性肿瘤一样, 大肠癌的预后因素尚不清楚. 新近 研究发现, 树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前 所知机体内功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresenting cell, APC), 是机体免疫应答的始动者. 肿瘤组织内浸润性树突状细胞(tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)的数量与功能对机体免疫有 重要提示意义, 与肿瘤的临床分期和预后相关[4]. CD83和CD1a是鉴定人外周血中DC的特异标志. 本研究采用免疫组织化学和流式细胞术(flow cytometry, FCM)分别检测大肠癌原发病灶中 TIDC的标志物CD83和CD1a的表达状况, 同时 检测与肿瘤细胞增殖密切相关的抗原Ki-67在肿 瘤细胞中的表达, 分析其与大肠癌临床病理特 点和预后的关系, 进而了解大肠癌组织局部免 疫状况对预后的影响.
E-CD、α-cat在大肠癌中表达临床意义的探究
浙江大学硕士学位论文E-CD、α-cat在大肠癌中表达临床意义的研究姓名：董全进申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：何超2001.5.1Ｅ．ＣＤ、ａ．ｃａｔ在大肠癌中表达临床意义的研究浙江大学医学院外科学（肛肠外科）同等学力申请硕士学位人员董全进导师何超邹寿椿中文摘要ｆ大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年上升的趋势。
尽管近年来以手术治疗为主的综合治疗使大肠癌患者的预后有所改善，但术后５年生存率仍徘徊在５０％左右。
肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的两大主要特点，是患者术后死亡的直接原因。
因此，阐明影响大肠癌患者预后及与肿瘤浸润和转移密切相关的分子生物学行为，预测大肠癌的浸润和转移潜能，从而指导临床治疗，采取更积极有效的综合治疗，可望达到减少术后复发和转移、提高术后生存率的目的，同时，将为今后大肠癌的基因治疗提供理论根据。
肿瘤浸润是肿瘤细胞与细胞外基质相互作用的过程，它包括细胞粘附、基质降解和细胞运动三个步骤，其中细胞一细胞间粘附的破裂是肿瘤转移复杂过程的第一步。
近年来发现的粘附分子主要有整合素类（Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）、ＣＤ４４、钙粘附蛋白类（Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ）、免疫球蛋白（Ｉｇ）超家族、凝集素类（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ）等。
表皮—钙粘附素（Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ。
Ｅ—ＣＤ）是一类钙依赖性同种上皮细胞亲合性的粘附分子，是维持上皮细胞结构完整性和极性的跨膜糖蛋白，普遍存在于上皮细胞、间胚层细胞和胎盘等处。
Ｅ－ＣＤ位于细胞边缘，特别是细胞一细胞粘附区域，如果缺乏Ｅ。
ＣＤ的表达，细胞间就不能相互聚集和粘附。
研究表明，Ｅ．ＣＤ在多种人类恶性肿瘤中表达低下，且Ｅ—ＣＤ的表达下降与肿瘤的浸润、转移和预后密切相关。
连接素（ｃａｔｅｎｉｎ，ｃａｔ）是一组膜内蛋白，与胞浆区的Ｅ－ＣＤ形成复合体，该复合体的形成是上皮一钙粘附素发挥粘附功能的必要条件。
许多体外实验研究结果表明，ｏ—ｃａｔ是一种抑制肿瘤浸润和转移的分子，ａ．ｃａｔ蛋白的异常可以促使细胞离解、肿瘤细胞的浸润性增加，从而增加远处转移的可能性。
eif3a2cmcl-1和cd83在结肠癌组织和血清中的表达及临床病理意义
中文摘要[目的]本研究旨在通过高通量数据筛选得到结肠癌差异表达基因，并研究这些基因在结肠癌患者中的表达和对结肠癌的临床病理特征的影响。
[方法]本研究通过对结肠癌患者血清mRNA表达谱芯片数据，筛选得到三个差异表达基因eIF3a,mcl-1和CD83。
对本院38例结肠癌患者，行肿瘤切除手术前后的血清以及手术切除的结肠癌组织和癌旁正常组织中这三个基因的mRNA和蛋白水平作了检测分析。
其中男性占21例，女性占17例。
所有患者术前均未接受过放化疗治疗。
[结果]发现eIF3a,mcl-1和CD83在术后血清中的表达较术前皆明显下降，而在癌旁组织中，eIF3a,mcl-1较肿瘤组织表达低，CD83却较肿瘤组织中高。
eIF3a, mcl-1和CD83均与肿瘤的恶性程度与转移情况呈正相关，与患者的性别，年龄无关。
[结论]1.在CRC患者血清mRNA表达谱芯片中发现eIF3a,mcl-1和CD83三个基因较对照组显著高表达，提示该三个基因在血清中的差异表达可以作为诊断CRC患者的指标之一.2.通过体外验证eIF3a,mcl-1和CD83三个基因在结肠癌细胞中的表达高于结肠上皮细胞。
3.对eIF3a,mcl-1和CD83这三个基因的表达与结肠癌肿瘤临床病理参数分析，发现eIF3a和mcl-1这两个基因表达与结肠癌肿瘤的存在呈正相关,其血清中含量还可以作为CRC患者诊断与预后的一项指标.CD83可以作为CRC患者预后的一项指标4.eIF3a,mcl-1和CD83均与肿瘤的恶性程度与转移情况呈正相关,与患者的性别,年龄无关.[关键词]结肠癌,eIF3a,mcl-1,CD83,基因表达谱芯片作者：张叶指导老师：冯一中The expression and clinicopathological significance of eIF3a,mcl-1and CD83in colorectal carcinoma tissueand serumAbstract[Objective]To investigate the differential expression genes screened from the colorectal carcinoma associated mRNA profiling and to study the expression of these candidate genes in colorectal carcinoma patients and the relationship with the clinical pathological characteristic.[Methods]We screened3differential expression genes eIF3a,mcl-1and CD83 from the mRNA profiling of serum of colorectal carcinoma patients(GDS2918),and detected the expression of these3genes mRNA and protein level of the serum before and after colorectal cancer radical resection as well as the excised colorectal cancer tissues and pericarcinomatous tissues from38colorectal carcinoma patients without radiotherapy or chemotherapy treatment before.There were21cases of men and17 cases of women in the colorectal carcinoma patients.[Results]We found the expression of eIF3a,mcl-1and CD83in serum decreased after resection compared to before.And the expression of eIF3a,mcl-1in cancer tissues is higher while CD83was lower than pericarcinoomatous tissues.All of these3genes had a positive correlation with the malignant degree and metastasis of tumor but were independent with the patients gender and age.[Conclusion] 1.Found in CRC patients serum mRNA expression profile chip eIF3a, MCL-1and CD83expression was significantly higher than three genes,prompt the three genes differentially expressed in serum can be used as a diagnostic indicator of CRC patients.2.In vitro validation eIF3a,MCL-1and CD83three genes expression is higher than in colon cancer cells in the colon epithelial cells.3.And CD83eIF3a,MCL-1of the three genes expression and clinical pathological colon tumor parameter analysis,found that both eIF3a and MCL-1gene expression and the existence of colon tumors were positively correlated,the serum content in the diagnosis and prognosis of CRC patients can also be used as an indicator.CD83can be used as an indicator of the prognosis of patients with CRC.4.EIF3a,MCL1and CD83information were positively correlated with malignant degree and metastasis of tumors,and the patient's gender,age has nothing to do.[Key words]colorectal carcinoma,eIF3a,mcl-1,CD83,gene expression profilesWritten by:Zhang YeSupervised by:Feng Yizhong目录前言 (1)第一部分从结肠癌mRNA芯片中筛选差异表达基因 (4)一.结肠癌mRNA芯片中筛选差异表达基因 (4)1.1.材料 (4)1.2.方法 (4)1.3.结果 (4)二.差异基因的验证 (5)2.1.材料与试剂 (5)2.2.方法 (6)2.3.统计学方法 (8)2.4.结果 (8)第二部分eIF3a,mcl-1和CD83在结肠癌中的表达 (10)1.材料 (10)2.方法 (10)3.统计学方法 (10)4.研究结果 (11)4.1.eIF3a在结肠癌组织中的表达 (11)4.2.eIF3a在CRC患者手术前后血清中的表达 (11)4.3.mcl-1在结肠癌组织中的表达 (14)4.4.mcl-1在CRC患者血清中的表达 (14)4.5.CD83在结肠癌组织中的表达 (17)4.6.CD83在结肠癌患者血清中的表达 (17)4.7.所选基因的表达与结肠癌临床病理学特征之间的关系 (21)讨论 (25)结论 (29)参考文献 (30)综述：结肠癌临床分子诊断研究进展 (34)英文缩略表 (39)前言结肠癌(CRC)是消化道常见恶性肿瘤之一，由于目前生活水平的提高，高糖高酒精高胆固醇的饮食和吸烟都增加了CRC危险性，尤其在工业化地区发病率显著升高，在全球范围内，结肠癌（Colorectal cancer CRC）新发病例数居常见恶性肿瘤发病率第二位，占恶性肿瘤总发病数的9.74%.有一半CRC位于直肠和直肠乙状结肠,1/4位于乙状结肠,还有1/4位于盲肠,升结肠,横结肠和降结肠.肿瘤的发生发展是一个错综复杂的,包含环境和基因等诸多因素,涉及到多个基因多条通路的协调参与,累及多种细胞类型和组织器官等的分子病理过程.与大多数肿瘤一样,由于缺乏特异性临床表现，在早期难以发现.多数CRC患者在发现时已属中晚期.因此如何提高CRC早期诊断率，尤其是寻找CRC在早期发生时的一些重要生物学指标,已经成为该疾病研究的重点课题.表达谱芯片主要以转录本为研究对象，可以对所有基因的转录水平进行差异性检测，同时具有动态分析的优点，可以在整个事件发展过程中不同时间点进行分析，从而揭示一些肿瘤相关疾病的发生发展迁移等分子机制.目前表达谱芯片技术在肿瘤领域的应用主要由两个角度入手:一是通过对不同来源的肿瘤转录谱进行分析,借助数据库检索来确定这些肿瘤相关表达基因的种类和功能,从而获得肿瘤表达谱的信息,不同肿瘤类型,不同物种的肿瘤样本以及不同的肿瘤样本中共同表达差异的基因在一定程度上可以反映其与肿瘤致病的相关性,为进一步肿瘤相关的研究提供基因;另一方面采用差异比较肿瘤与正常组织之间的表达谱,着眼于表达量有差异的基因,进一步研究这些差异基因的细胞定位,蛋白功能及上下游通路等生物学功能,从而揭示肿瘤发病或预后的分子机制.基因表达谱分析为我们提供了寻找结肠癌肿瘤相关基因的可行性．通过对已有高通量数据进行分析，我们发现eIf3a,mcl-1和cd83这三个因子在结肠癌组织中有高表达，提示其与肿瘤发生存在密切关系，但目前在结肠癌相关方面的研究仍然为数不多．编码真核细胞起始因子(eukaryotic initiation factors)，eIf作为一种看家基因，参与真核生物的翻译过程．eIf3是eIf家族中分子量最大，结构最复杂的蛋白因子，有13个亚单位组成的复合体，主要是通过结合与40S核糖体亚基来形成翻译前起始复合体1,2，所涉及到的多种翻译起始的反应，包括mRNA招募，核小体扫描以及翻译起始密码子的定位1．eIF3家族成员参与翻译起始的有5个核心蛋白，包括eIF3a,eIF3b,eIF3c,eIF3g和eIF3i3，的每个亚基单独的功能目前仍然不全清楚4. eIF3a是其中最大的亚基，酵母中的研究认为，其对翻译前起始复合体的活性并无明显影响5，但是在一些特定蛋白翻译调控过程中，如细胞周期依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)相关蛋白6,7，却有重要作用．这就提示eIF3a对细胞周期有调控作用．随后的研究表明，eIF3a突变的酵母大部分停滞在G1期8；而在哺乳动物细胞中，eIF3a则在S期表达至顶峰，可以有效促进这一时期合成DNA的一些关键蛋白质表达7．到目前为止，eIF3a在肿瘤中的功能主要认为是异常活化的eIF3a 会引起翻译起始状态的高度激活，从而引起蛋白的高效率合成9．此外eIF3a阳性的患者对铂类药物治疗的敏感程度高于阴性病人10．这提示eIF3a也可能对肿瘤细胞中DNA修复途径中的一些重要蛋白产生影响．eIF3a在肿瘤中的高表达已经在宫颈癌，食管癌和胃癌中得到证实11-13，是一种潜在的具有价值的预测肿瘤浸润的早期分子标志物．髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemin-1,Mcl-1)是Bcl-2家族中抗凋亡蛋白成员之一.Mcl-1有两种转录本，其中Mcl-1L也就是通常所说的Mcl-1主要分布在线粒体膜上14，可以螯合促凋亡蛋白Bax/Bak异二聚化15，从而抑制肿瘤细胞的凋亡．也有研究认为，MCL-1分布于细胞核内，与CDK-1和增殖细胞核抗原(PCNA)相互作用，从而调控细胞分化16．因此Mcl-1的表达与肿瘤的恶性呈正相关，许多肿瘤细胞能过度表达MCL-1蛋白，越来越多的证据认为Mcl-1在临床诊断中可以作为一个有效的预测指标17，而人为干扰Mcl-1的表达可以有效抑制肿瘤的恶性增殖18．此外Mcl-1的表达对恶性肿瘤的预后也有关系，但有趣的是，Mcl-1在接受放疗的患者直肠癌组织中表达反而比未接受放疗的要高19，因此Mcl-1的表达与直肠癌恶性肿瘤生存关系需作进一步评估．CD83是成熟树突状细胞(DC)的表面标志性糖蛋白抗原．由胞膜外区，跨膜区和膜浆区三个功能片段组成，其表达受多种炎性因子的调控．CD83在DC细胞免疫应答中起非要作用，不仅可以活化DC细胞，还能为T细胞提供信号20，有研究认为CD83敲除小鼠无法产生CD4+T细胞21,也与B细胞存在密切关系22,23．因此CD83常常可以作为一种分子标记物来检测免疫细胞的动向和变化，从而预测炎症，肿瘤等相关疾病．CD83在食管鳞癌24，胃癌25和大肠癌组织26中均有显著的变化，表现为恶性程度越高，CD83阳性率最低．推测CD83表达受到抑制导致肿瘤抗原引起的免疫应答失效，机体免疫系统无法对肿瘤细胞进行识别和杀伤27．目前CD83的生物学功能研究并不透彻，在结肠癌中的研究更是非常少，与其相互作用的分子仍然需要做进一步寻找和鉴定工作．上述提到的三个分子是从结肠癌mRNA表达谱芯片中筛选得到的差异基因，从功能来看，分别是涉及到细胞周期，有氧呼吸和免疫应答三个方面；从定位来看，分别是核内，线粒体和膜表面三个不同部位；从与肿瘤的关系来看，eIF3a是保守基因，调控大部分蛋白翻译过程，mcl-1与促进肿瘤生成相关而CD83则是通过免疫介导来抑制肿瘤．之所以从不同角度和不同方面来对候选基因进行选择，目的是希望通过涉及不同的细胞通路，不同的调控网络，不同结构部分来更准确地预测结肠癌的发生，发展和转移．第一部分从结肠癌mRNA芯片中筛选差异表达基因一.结肠癌mRNA芯片中筛选差异表达基因1.1材料本研究的目的是为了从实验室诊断中选择有意义的分子标记物．一般在临床上快速检测常常使用的实验材料为血清，而不是结肠组织．因此本实验从NCBI 的GEO DataSets上发布的免费数据库中找到与结肠癌相关的高通量数据芯片时，更侧重血清相关的芯片数据，所以选择了编号为GDS2918的芯片组进行分析. GDS2918是将12名结肠癌患者与8名健康志愿者的血清进行mRNA表达谱的比较．1.2.方法对于芯片数据中已经给出的差异基因，(/geoprofiles? cmd=HistorySearch&hinit=true&query_key=11)须满足P值小于0.05，且表达倍数差异(fold change,FC)须大于2倍或小于0.5倍，即logFC大于1或小于-1，表示与正常组相比，差异基因的mRNA表达值高于2倍以上或低于1/2以下，且具有统计学意义．这些差异基因可以认为是在结肠癌中表达异常的基因，很有可能参与或影响了结肠癌发生的过程．1.3.结果满足lgFC>1或<-1，且P值<0.05条件的基因共有451个基因，其中上调的有279个，下调的有172个．在此我们列出上下调倍数最大的前十个基因，如表1，认为这些表达差异最为明显的基因，可以作为潜在的有效分子诊断标记物．通过文献检索，发现其中eIF3a，mcl-1和CD83三个基因，在其他肿瘤中参与了重要的生物学功能，但在结肠癌中研究不多，同时在GO分析中发现，eIF3a，mcl-1和CD83基因涉及到不同的生物学过程(biological process,BP)，细胞学组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF),这就提示我们，这三个基因有可能从不同的方面参与了结肠癌的肿瘤发生，发展与转移．表1.GDS2918芯片组中差异基因的表达上调表达倍数差异(logFC)P值下调表达倍数差异(logFC)P值CRAT 3.890.000774TNFRSF11B-3.430.002641ARMC1 3.350.000243RBM39-3.060.007515 CXCL10 3.110.025004CCDC91-2.820.007187 EIF3A 3.030.001906GPR98-2.810.001083 EPAS1 2.990.000638ACBD3-2.680.014555 TBC1D9 2.970.013127JRKL-2.670.004664 MON1A 2.930.006427MED15-2.670.032408 CD83 2.910.001368ST8SIA2-2.630.002123 MCL1 2.910.002177STRN-2.630.00796 AADAT 2.870.012085FRS2-2.530.012739二.差异基因的验证2.1.材料与试剂结肠癌HT29细胞系(购自中科院上海生化细胞所)人结肠上皮细胞HCEpi C(购自美国SceinCell,货号2950)75cm2细胞培养皿六孔培养板倒置光学显微镜RPMI1640培养液DMEMTRIZOL氯仿异丙醇无水乙醇DEPC水逆转录Kit(购自Roche)荧光定量PCR Kit(购自Roche)细胞裂解液(购自Fermentas)PMSF(购自碧云天)eIF3a一抗(购自millipore,货号07-1522)mcl-1一抗(购自santa cruz,货号SC-819)CD83一抗(购自santa cruz,货号SC-20083)beta-actin一抗(购自碧云天)抗大鼠二抗(购自碧云天)荧光检测试剂盒ECL(购自碧云天)引物序列如下:CRAT(F:5'-CCACAGCCAACCTCCCG-3',R:5'-CCACAGCCAACCTCCCG-3'),ARMC1(F:5'-AGGATCAGGGATGTCTGCCT-3',R:5'-CTAAGCCAGCTAGCTCCACC-3') CXCL10(F:5'-AGAACTGTACGCTGTACCTGC-3',R:5'-CGTGGACAAAATTGGCTTGC-3'), eIF3a(F:5'-GCCACTAGAGAGTTCGCTGAC-3',R:5'-GCGAAGATCCACGCAAAGTT-3'), EPAS1(F:5'-GGCCGTACTGTCAACCTCAA-3',R:5'-CCCCTTGCCACTGCTATCAA-3')TBC1D9(F:5'-TGATGACCATGTATCGGCGG-3',R:5'-AGTCTCGTGCTAGCTCCTCA-3') MON1A(F:5'-CTGCTGCTTGTCTCCACTGA-3',R:5'-GTTGGGGCCCGTGTAGTAAA-3')CD83(F:5'-AGAGAGGATGGAGACACCCC-3',R:5'-AGCCGTGCAAAACAAGTGAA-3') mcl-1(F:5'-GCATGCTTCGGAAACTGGAC-3',R:5'-TCCTGCCCCAGTTTGTTACG-3'), AADAT(F:5'-TGAGTGAGAAACGGGCTGAC-3',R:5'-TGTCCTTGACTGGGTGGGTA-3') beta-actin(F:5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',R:5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3')2.2.方法HT29与HCEpi C细胞分别在含10%DMEM的RPMI1640培养液的六孔板中培养,培养条件为37℃,5%CO2培养箱中进行.养培至106数目左右的细胞量,可以进行后续分子实验.加入1ml trizol用于mRNA抽提；加入50ul含0.1%PMSF的细胞裂解液用于蛋白抽提．如不马上进行实验，则放置-80℃保存．mRNA检测方法为:1)加入1mlTRIZOL,2)室温静止5min,3)加入200ul氯仿,充分振荡20s,4)4℃13000rpm离心10min,5)抽取上清并加入新的1.5mlEP管中(避免吸取中间蛋白层),6)加入等体积冷异丙醇约500ul,充分振荡,7)4℃13000rpm离心10min,8)小心倒弃上清,9)加入75%乙醇(用DEPC水配制),振荡,10)4℃7500rpm离心5min,11)小心弃上清,12)室温晾干,13)根据白色沉淀大小加入DEPC水进行溶解,浓度测定.14)RNA检测方法为将抽提的mRNA进行浓度测定后,每一个样品均调成100ng,15)根据逆转录试剂盒说明书,依次加入和随机引物,65℃10min,迅速放至4℃,16)再依次加入RNase Out,Buffer,dNTP和逆转录酶,轻轻混匀,进行逆转录反应,条件为25℃10min,55℃30min,85℃5min,4℃终止反应.17)所得cDNA可-20℃长期保存.18)Realtime配制体系,模板2ul,引物1ul,SYBR Green10ul,ddH2O7ul配成20ul 体系,19)反应条件预变性94℃30s,然后94℃5s,60℃30s40次循环.蛋白检测方法为:1)在冰上加入50ul含0.1%PMSF的细胞裂解液轻轻吹打5min左右,2)处理后的细胞悬液若不立即实验，则放-80℃保存,3)测得蛋白浓度并将所有样品进行归一化,4)加入20%上样缓冲液,5)95℃变性10min.6)加入12%的PAGE胶内,7)80V电压下10min,120V电压下进行约1.5h.8)PVDF膜甲醇浸泡1min,随后在电转缓冲液中浸泡30min以上,9)待PAGE电泳结束,取出胶,按阴极-滤纸-膜-胶-滤纸-阳极的顺序放置,10)进行湿转,100V1h,11)电转结束后,加入TBST清洗10min,共3次,12)加入5%的脱脂奶粉-TBST封闭过夜,13)次日倒弃奶粉,加入TBST清洗10min,共3次,14)按marker指示,剪下对应大小的膜,15)加入相应一抗(1:1000),摇床孵育2h,16)倒弃或回收一抗,将膜在TBST中清洗10min,共3次,17)加入相应二抗(1:5000),孵育1h,18)倒弃或回收二抗,将膜在TBST中清洗10min,共3次,19)在暗室中用荧光检测试剂盒ECL进行发光.对所得条带进行灰度分析.2.3.统计学方法计量资料以均数±标准差()表示,多组间比较采用方差分析.p<0.05为差异有统计学意义.2.4.结果本研究对10个候选基因在HT29与HCEpi C细胞中的mRNA表达值进行realtime PCR验证,如图1,可以发现除TBC1D9,EPAS1和ARMC1三个基因的mRNA表达值无明显差异之外,其余候选基因的表达值在HT29中均比HCEpi C中要高(p<0.05),这与芯片预测结果是吻合的.其中eIF3a,mcl-1和CD83三者的表达差异最为明显(p<0.001),且其相对表达值较于其他候选基因更大,有利于实验检测.此外,此实验对eIF3a,mcl-1和CD83的蛋白水平同样在HT29与HCEpi C中进行了检测,如图2,可以发现蛋白水平与mRNA水平基本一致(eIF3a,F=13.254, p<0.001;mcl-1,F=17.429,p=0.023;CD83,F=29.018,p<0.001).因此决定选取这三个基因作为结肠癌实验室诊断指标的研究对象.图1.10个候选基因在HT29与HCEpi C细胞中的mRNA表达值图2.eIF3a,mcl-1和CD83在HT29与HCEpi C细胞中的蛋白表达第二部分eIF3a,mcl-1和CD83在结肠癌中的表达本研究从芯片中筛选得到CRC差异表达基因eIF3a,mcl-1和CD83,这三个基因在结肠癌肿瘤细胞HT29中无论是mRNA还是蛋白水平都高表达于正常结肠上皮细胞.这提示我们eIF3a,mcl-1,CD83三个基因均涉及到结肠癌的发生.那么在体内这三个基因的表达又是如何的呢?1.材料收集本院2011年6月至2013年4月间共38例CRC患者手术切除标本,含结肠癌组织以及周边10cm处正常组织,并收集这些患者手术前后血清标本.其中周边正常组织用以对照试验研究.38例患者年龄范围37-76岁,平均年龄54.31±8.94岁,中位年龄58岁,其中男性占21例,女性占17例.所有患者术前均未接受过放化疗治疗.根据WHO结肠癌组织学2010年的分类标准进行分型,管状腺癌20例,乳头状腺癌6例,粘液癌,未分化癌有12例;高,中分化29例,低,未分化9例.2.方法通过real time PCR与Western blot对上述样品中eIF3a,mcl-1和CD83的mRNA 与蛋白水平进行检测.组织样品冻于-80℃中,进行mRNA抽提前,将组织块放入事先用DEPC水浸泡过的研钵内,加入少量液氮,并加入1mlTRIZOL,用研杵进行充分研磨,待无明显组织块后,结束研磨,恢复室温,进行后续mRNA抽提,步骤同2.2进行蛋白抽提时,加入蛋白裂解液后,用匀浆机在冰上进行匀浆,每次5-10s,避免因高速匀浆造成的温度过高使蛋白降解.4℃离心13000rpm10min,沉淀为组织间质,细胞碎片等弃之,取上清分装-80℃冻存.后续western blot步骤同2.23.统计学方法计量资料以均数±标准差()表示,组间比较采用配对t检验,肿瘤组织与血清中表达量相关性用Pearson相关性分析,样本信息比较用χ2检验法,p<0.05为差异有统计学意义.4.研究结果4.1eIF3a在结肠癌组织中的表达结肠癌组织中mRNA表达值明显高于周边正常组织(t=8.336,p<0.001),蛋白水平的趋势与mRNA相同(t=6.780,p<0.001)(表2).其中我们可以发现,在肿瘤组织中eIF3a表达值相对较低的患者,其与周边正常组织的表达差距也不明显,例如12号,14号,18号,38号等患者;而eIF3a表达相对较高的患者,则在周边正常组织中表达差距则非常大,例如7号,9号,20号,33号患者.这就提示我们,eIF3a在正常结肠上皮组织中表达对于整个群体来讲相对稳定,而一旦出现结肠癌组织,eIF3a就会有非常明显的变化,这说明eIF3a在结肠癌发生中是一个较为敏感的基因,可以作为用于CRC患者分子诊断的一项指标.4.2eIF3a在CRC患者手术前后血清中的表达CRC患者术前血清中eIF3a的mRNA表达值明显高于术后(t=11.310,p<0.001),蛋白水平的趋势与mRNA相同(t=9.363,p<0.001)(表3).我们可以认为,术前血清中eIF3a无论是mRNA还是蛋白表达之所以在术后都会有明显下降,很有可能是由于肿瘤的切除,使得eIF3a在血清中不再持续性高表达.对此,我们对eiF3a在血清中与结肠癌组织中mRNA与蛋白的表达变化作了相关性分析,认为eIF3a在结肠癌组织与血清中表达均是呈正相关性的(术前mRNA,r=0.680,R2=0.463,p<0.001;术后mRNA,r=0.578,R2=0.335,p<0.001;术前蛋白,r=0.362,R2=0.535,p<0.001;术后蛋白,r=0.307,R2=0.094,p=0.031)(图3),因此检测血清中eIF3a的表达可以作为检测结肠癌发生以及预后的一项分子指标.表2.38例CRC患者中结肠癌组织与周边正常组织中eIF3a的mRNA与蛋白表达CRC患者编号结肠癌组织结肠癌周边正常组织CRC患者编号结肠癌组织结肠癌周边正常组织mRNA蛋白mRNA蛋白mRNA蛋白mRNA蛋白123.3217.9415.4212.952033.2331.5415.4213.35 231.2725.8926.0923.622123.9522.2614.5312.46 319.0513.6712.8310.362221.0519.3615.6313.56 426.4421.0617.3014.832335.0133.3222.0019.93 530.6725.2922.1219.652423.0221.3321.4919.42 623.0217.6420.9318.462542.0440.3532.8230.75 734.7829.412.8210.352641.0239.3339.6537.58 839.7434.3625.6723.22721.7820.0920.7418.67 933.8828.514.0311.562825.4223.7321.0418.97 1042.0536.6728.0425.572941.3939.725.3723.3 1141.9436.5632.7030.233038.5036.8123.6521.58 1223.0517.6722.0119.543142.4540.7638.4136.34 1332.0126.6329.8527.383236.4234.7327.4125.34 1419.0513.6716.4213.953332.0730.3812.019.94 1532.0426.6629.0126.543437.7436.0528.5326.46 1635.3029.9220.7618.293539.0237.3324.2022.13 1729.0523.6721.7419.273623.4221.7321.6819.61 1818.0312.6516.3913.923718.4216.7312.5310.46 1923.4218.0419.0316.563819.4017.7118.7516.68表3.38例CRC患者手术前后血清中eIF3a的mRNA与蛋白表达CRC患者编号术前术后术前术后CRC患者编号术前术后术前术后mRNA mRNA蛋白蛋白mRNA mRNA蛋白蛋白113.679.108.49 6.722013.237.129.48 6.13 211.27 6.35 6.99 3.242115.789.6411.16 6.47 312.7011.1610.168.092211.0010.609.02 4.78 413.5411.3711.368.722325.8012.0216.727.33 521.6518.7115.9310.152410.08 6.999.07 2.11 624.8710.6614.348.292531.0827.4110.25 6.42 724.779.0313.17.002624.9719.008.63 5.50 823.6115.3314.309.102710.84 3.048.06 1.47 918.8612.0711.3410.272815.338.07 6.23 4.55 1031.8828.7416.5712.532920.4612.6417.79.3 1121.9412.7016.5710.003028.6214.2516.418.54 1219.4512.717.43 5.023133.4428.4220.1115.24 1322.719.8518.637.773230.2417.4524.889.32 1419.4412.4113.6012.403322.2212.8110.56 4.65 1522.6612.8117.34 6.013426.6321.3715.8914.36 1615.3010.769.028.233530.2120.4118.878.96 1719.0511.7413.67 6.273618.2217.329.85 6.66 188.07 2.49 4.64 1.993726.3515.419.147.36 1912.41 5.038.44 6.553817.2511.0210.69 5.21图3.eIF3a结肠癌组织与血清中mRNA与蛋白的相关性分析4.3mcl-1在结肠癌组织中的表达与eIF3a类似,mcl-1在结肠癌组织中mRNA与蛋白的表达如表4.发现mcl-1在肿瘤中相比正常对照组均高表达.4.4mcl-1在CRC患者血清中的表达mcl-1在CRC患者血清中mRNA与蛋白的表达如表5.可以发现mcl-1在术前血清中相比术后血清均高表达.同时mcl-1在CRC患者血清与结肠癌组织中表达的相关性分析如图4.我们发现mcl-1在结肠癌组织与血清中表达均是呈正相关性的(术前mRNA,r=0.651,R2=0.424,p<0.001;术后mRNA,r=0.603,R2=0.312,p<0.001;术前蛋白,r=0.327,R2=0.302,p<0.001;术后蛋白,r=0.265,R2=0.091,p=0.045),因此血清中mcl-1可以作为检测结肠癌发生以及预后的一项分子指标.表4.38例CRC患者中结肠癌组织与周边正常组织中mcl-1的mRNA与蛋白表达CRC患者编号结肠癌组织结肠癌周边正常组织CRC患者编号结肠癌组织结肠癌周边正常组织mRNA蛋白mRNA蛋白mRNA蛋白mRNA蛋白126.9721.3320.69 6.712025.7624.4511.9510.35 223.8719.7619.9218.032118.5717.2611.269.66 314.5410.449.797.912216.3215.0112.1210.51 420.1816.0813.2111.322327.1425.8317.0515.45 523.4119.3116.8915.002417.8416.5316.6615.05 617.5713.4715.9814.092532.5931.2825.4423.84 726.5522.449.797.902631.8030.4930.7429.13 830.3426.2319.6017.712716.8815.5716.0814.47 925.8621.7610.718.822819.7118.4016.3114.71 1032.1027.9921.4019.522932.0930.7819.6718.06 1132.0227.9124.9623.083029.8428.5318.3316.73 1217.6013.4916.8014.923132.9131.6029.7828.17 1324.4420.3322.7920.903228.2326.9221.2519.64 1414.5410.4412.5310.653324.8623.559.317.71 1524.4620.3522.1520.263429.2627.9522.1220.51 1626.9522.8415.8513.963530.2528.9418.7617.16 1722.1818.0716.6014.713618.1616.8416.8115.20 1813.769.6612.5110.633714.2812.979.718.11 1917.8813.7714.5312.643815.0413.7314.5312.93表5.38例CRC患者手术前后血清中mcl-1的mRNA与蛋白表达CRC患者编号术前术后术前术后CRC患者编号术前术后术前术后mRNA mRNA蛋白蛋白mRNA mRNA蛋白蛋白1 5.92 3.94 3.68 2.9120 5.73 3.08 4.10 2.652 4.88 2.75 3.03 1.4021 6.83 4.17 4.83 2.803 5.50 4.83 4.40 3.5022 4.76 4.59 3.90 2.074 5.86 4.92 4.92 3.772311.17 5.207.24 3.1759.378.10 6.90 4.3924 4.36 3.03 3.930.91610.77 4.61 6.21 3.592513.4511.87 4.44 2.78 710.72 3.91 5.67 3.032610.818.23 3.74 2.38 810.22 6.64 6.19 3.9427 4.69 1.32 3.490.6498.16 5.23 4.91 4.4528 6.64 3.49 2.70 1.971013.8012.447.17 5.42298.86 5.477.66 4.03 119.50 5.507.17 4.333012.39 6.177.10 3.70 128.42 5.50 3.22 2.173114.4812.308.71 6.60 139.83 4.268.06 3.363213.097.5510.77 4.03 148.42 5.37 5.89 5.37339.62 5.55 4.57 2.01 159.81 5.557.51 2.603411.539.25 6.88 6.2216 6.62 4.66 3.90 3.563513.088.848.17 3.88178.25 5.08 5.92 2.71367.897.50 4.26 2.8818 3.49 1.08 2.010.863711.41 6.67 3.96 3.1919 5.37 2.18 3.65 2.84387.47 4.77 4.63 2.26图4.mcl-1结肠癌组织与血清中mRNA与蛋白的相关性分析4.5CD83在结肠癌组织中的表达CD83在结肠癌组织中mRNA与蛋白的表达如表6,可以发现CD83在肿瘤中相比癌旁正常组织中为低表达.4.6CD83在结肠癌患者血清中的表达CD83在CRC患者血清中mRNA与蛋白的表达如表7.发现CD83在术前血清中相比术后血清均高表达.同时CD83在CRC患者血清与结肠癌组织中表达的相关性分析如图5.发现CD83在结肠癌组织中表达与血清中表达均呈正相关性(术前mRNA,r=0.748,R2=0.573,p<0.001;术后mRNA,r=0.567,R2=0.282,p<0.001;术前蛋白,r=0.832,R2=0.409,p<0.001;术后蛋白,r=0.264,R2=0.191,p=0.012),因此血清中CD83可以作为检测结肠癌发生以及预后的一项分子指标.表6.38例CRC患者中结肠癌组织与周边正常组织中CD83的mRNA与蛋白表达CRC患者编号结肠癌组织结肠癌周边正常组织CRC患者编号结肠癌组织结肠癌周边正常组织mRNA蛋白mRNA蛋白mRNA蛋白mRNA蛋白137.04 5.1654.7543.732021.397.9652.2950.12 235.6613.8748.4640.512120.167.4337.735.38 317.52 6.0829.5221.42221.698.0833.1330.77 423.658.7140.9732.962330.5211.8855.0952.95 530.2311.5447.5239.592429.8211.5836.2233.89 628.6010.8435.6727.612545.5418.3466.1664.12 717.52 6.0853.9462655.0222.4164.5562.5 835.0813.6261.5953.772728.7811.1334.2731.92 919.17 6.7852.544.612829.1911.3240.0137.72 1038.3115.0265.1657.382935.2113.8965.1463.1 1144.6817.756557.223032.8112.8760.5858.49 1230.0711.4835.7327.653153.3121.6766.8164.78 1340.7916.0849.6141.683238.0415.1157.3155.19 1422.438.1929.5221.43316.66 5.9350.4748.28 1539.6515.5849.6541.723439.5915.7859.457.3 1628.3710.7454.7146.823533.5813.2061.4159.33 1729.7111.3245.0337.043630.0911.6936.8634.52 1822.398.1827.9319.83717.38 6.2428.9926.59 1926.019.7236.328.233826.019.9530.5328.15表7.38例CRC患者手术前后血清中CD83的mRNA与蛋白表达CRC患者编号术前术后术前术后CRC患者编号术前术后术前术后mRNA mRNA蛋白蛋白mRNA mRNA蛋白蛋白114.15 3.20 4.08 2.772013.69 2.50 4.55 2.52 211.66 2.24 3.36 1.332116.32 3.39 5.36 2.67 313.15 3.93 4.88 3.332211.38 3.73 4.33 1.97 414.01 4.00 5.46 3.592326.70 4.238.04 3.02 522.39 6.597.66 4.182410.42 2.46 4.360.87 625.74 3.75 6.89 3.422532.159.65 4.93 2.65 725.62 3.18 6.29 2.892625.84 6.69 4.15 2.27 824.43 5.40 6.87 3.752711.21 1.07 3.870.61 919.50 4.25 5.45 4.242815.87 2.84 3.00 1.88 1032.9810.117.96 5.162921.18 4.458.50 3.84 1122.71 4.477.96 4.123029.61 5.027.88 3.52 1220.12 4.47 3.57 2.073134.6110.009.67 6.29 1323.49 3.468.95 3.203231.29 6.1411.95 3.84 1420.12 4.37 6.54 5.113322.99 4.51 5.07 1.91 1523.45 4.518.34 2.483427.567.527.64 5.92 1615.82 3.79 4.33 3.393531.267.199.07 3.70 1719.72 4.13 6.57 2.583618.86 6.10 4.73 2.74 188.340.88 2.230.823727.27 5.42 4.40 3.04 1912.83 1.77 4.05 2.703817.85 3.88 5.14 2.15图5.CD83结肠癌组织与血清中mRNA与蛋白的相关性分析4.7所选基因的表达与结肠癌临床病理学特征之间的关系此外,本研究对eIF3a,mcl-1和CD83三个基因在血清中mRNA表达是否能够充分预示结肠癌不同病理侵润,恶性程度,侵袭状况,转移程度,分化等级以及是否与年龄性别等之间存在关系作了研究分析.根据表8,可以发现eIF3a与肿瘤的恶性程度与转移呈正相关,与患者的年龄,性别无关;根据表9,可以得出mcl-1与肿瘤的恶性程度与转移呈正相关,与患者的年龄,性别无关;根据表10,可以得出CD83与肿瘤恶性程度,是否转移呈正相关,与患者的年龄,性别无关.eIF3a临床特征例数高于中位值低于中位值χ2P 年龄0.2250.635 >55231112<551569性别0.1060.744男211110女1789手术病理周围组织侵润10.8640.001是28226否1028转移情况肝脏转移10.0160.002是27207否1129结肠淋巴结转移38.000<0.001是35350否303结肠旁淋巴结转移 5.3530.021是30219否826系膜根部淋巴转移 3.5270.060是22157否16610腹网膜转移12.518<0.001是34286否404分化程度8.4930.007高中分化29227低未分化927mcl-1临床特征例数高于中位值低于中位值χ2P 年龄0.7820.376 >55231211<5515105性别0.1580.691男211011女17710手术病理周围组织侵润33.312<0.001是28271否10010转移情况肝脏转移 4.9060.027是27189否1138结肠淋巴结转移10.9000.001是35332否312结肠旁淋巴结转移13.102<0.001是30282否835系膜根部淋巴转移14.903<0.001是22184否16313腹网膜转移14.963<0.001是34322否413分化程度18.083<0.001高中分化29236低未分化909CD83临床特征例数高于中位值低于中位值χ2P 年龄0.3540.552 >55231013<551587性别0.3830.536男21129女1789手术病理周围组织侵润9.9020.002是28253否1046转移情况肝脏转移8.5680.003是27216否1138结肠淋巴结转移10.9000.001是35332否312结肠旁淋巴结转移 6.3410.012是30228否826系膜根部淋巴转移15.545<0.001是22175否16214腹网膜转移 5.4640.019是34277否413分化程度8.4930.007高中分化29227低未分化927讨论结肠粘膜上皮细胞经过多次突变后即可变成恶性肿瘤细胞28,其最大特征就是细胞具有侵袭与转移的能力,而这同时也成为影响肿瘤患者治愈的最主要因素之一.结肠癌通过肿瘤细胞的表达受体与细胞外基质进行信号传递29,可激活胞内合成多种蛋白酶30,可特异性水解细胞外基质,尤其是基底膜31-34.结肠癌中具有转移特性的这一类细胞亚群临床病理表形,细胞酶学及基因表型等多方面发生变化并积累之下从而造成肿瘤细胞由原发灶脱落侵袭并建立新的转移灶.结肠癌发生,侵袭并转移的机制目前仍未阐明,涉及肿瘤细胞中基因转录翻译的调控异常,细胞周期的规律紊乱,细胞自身对宿主的免疫逃逸等多方面复杂因素.结肠癌是全世界常见的消化道恶性肿瘤.近年来我国结肠癌发病率和死亡率呈上升趋势,根据流行病学资料,1990-1992年,我国城市结肠癌死亡率较1973-1975年上升31.95%,农村上升8.51%35.2000-2005年,结肠癌的发病人数以每年12万人递增36.目前结肠癌的死亡率在恶性肿瘤排名中已由原来的第三位上升至第二位37,2000年较1991年,结肠癌病死率上升至31.18%38.结肠癌发生是遗传因素与外界环境,饮食等长期作用的结果,表现为多基因协同作用的结果.其发病率与死亡率居高不下的原因主要有三个方面:(1)早期诊断水平低.结肠癌从可辨认的腺瘤发展成侵袭性癌就需要5年时间,而早期结肠癌由于无明显症状,错过了最佳治疗时间.据调查,约有1/3的患者明确诊断时已处于进展期39.(2)预后差.由于患者被确诊时已是晚期,局部病变明显严重,常常伴有肠梗阻,肠穿孔,甚至急性大出血等并发症.因此临床分期预后较差.(3)治疗难.目前手术以及放化疗手段在治疗结肠癌中,仍然难有显著进展.目前早期诊断结肠癌的主要方法仍然是结肠镜检查,但由于电子镜检作为侵入性检查,不仅操作要求高,还存在出血及穿孔的风险,此外在大范围筛查中也有较大的局限性40.鉴于此,发展,优化,完善敏感,可靠,快速的结肠癌实验室检测指标与方案则具有重要意义,不但可以进一步揭示肿瘤发生,形成,转移等分子信号,细胞通路,网络调控等机制,同时还可以为基础研究提供实验资料与临床数据的支持,最主要的。
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CD83、CD1a标记肿瘤浸润性树突状细胞在大肠癌中的表达及其预后意义【摘要】目的探讨肿瘤浸润性树突状细胞(TIDC)在大肠癌组织中的表达及预后意义。
方法收集≥5年生存组和<3年死亡组大肠癌病例各30例，免疫组化和流式细胞术分别检测大肠癌组织内TIDC的CD83、CD1a表达状况，分析其与大肠癌临床病理特点和预后的关系。
结果CD83、CD1a的表达与大肠癌的分化程度、淋巴结转移无关，与Dukes分期和预后相关。
免疫组化检测显示，60例大肠癌组织中19例检测到CD83阳性表达，24例检测到CD1a阳性表达。
CD83、CD1a的表达随着Dukes分期的升高而降低、≥5年生存组表达高于<3年死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)。
流式细胞术检测到低水平CD83(60/60)、CD1a(60/60)和Ki-67(60/60)表达。
在大肠癌组织的不同Dukes分期间，CD83、CD1a在A期+B期大肠癌组织中的表达高于C期+D期大肠癌组织，差异有统计学意义(P<0.05);CD1a在≥5年生存组表达高于<3年死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)。
结论大肠癌组织中TIDC的特征性标记物CD83、CD1a的表达与预后相关，可以作为检测大肠癌预后的参考指标。
【关键词】大肠癌;肿瘤浸润性树突状细胞;CD83;CD1aABSTRACT: ObjectiveTo explore the expression of tumor-infiltrating dendritic cells (TIDC) in colorectal carcinoma and its prognostic significance. MethodsThirty cases of colorectal cancer patients were selected from ≥5-year survival group and <3-year death group，respectively. Immunohistochemical staining and flow cytometry were used to detect the expression of CD83 and CD1a of TIDC in colorectal cancer tissues; the relationship of the expression with clinico- pathological features and prognosis of colorectal cancer were analyzed.ResultsThe expression of CD83 and CD1a had no correlation with differentiation degree of colorectal cancer， lymph node metastasis， Dukes staging or prognosis. Immunohistochemistry showed that 19 patients with CD83positive expression and 24 with CD1a positive expression were detectedin 60 cases of colorectal cancer， The expression of CD83 and CD1a decreased with Dukes staging increase; the expression was significantly higher in ≥5-year survival group than in <3-year death group (P<0.05). Flow cytometry detected low level of CD83 (60/60)， CD1a (60/60)， andKi-67 (60/60) expressions. During different Dukes staging of colorectal carcinoma tissues， CD83 and CD1a had a significantly higher expression in A + B phase of colorectal cancer tissues than in C + D phase (P<0.05). CD1a had a significantly higher expression in ≥5-year survival group than in <3-year death group (P<0.05 ).ConclusionThe expression of CD83and CD1a， TIDC characteristic markers in colorectal carcinoma， is related with and the prognosis; therefore， it can be used as a reference indicator to detect the prognosis of colorectal carcinoma.KEY WORDS: colorectal carcinoma; tumor-infiltrating dendritic cell; CD83; CD1a树突状细胞(dendritic cell， DC)是目前所知机体内功能最强的抗原提呈细胞，是机体免疫应答的始动者.肿瘤组织内浸润性树突状细胞(tumor infiltrating dendritic cell， TIDC)的数量与功能对机体免疫有重要提示意义，与肿瘤的临床分期和预后相关[1]。
TIDC被认为是机体对肿瘤的一种局部免疫反应。
CD83和CD1a是鉴定人外周血中DC的最好标志。
本研究采用免疫组化和流式细胞术分别检测大肠癌组织中CD83和CD1a的表达情况，分析二者与大肠癌临床病理特点和预后的关系，进而了解肿瘤组织局部免疫状况对预后的影响。
1材料与方法1.1标本来源收集遵义医学院附属医院普外科自1990年6月至2006年6月经病理确诊的60例大肠癌石蜡标本，均为原发病灶(临床资料完整)，男41例，女29例，年龄26～78(中位数52)岁;高分化30例，中分化9例，低分化21例;Dukes分期：A期6例，B期25例，C期21例，D期8例;伴有淋巴结转移14例，无淋巴结转移46例;≥5年生存者30例，<3年死亡者30例。
所有患者均为第一次手术，术前未经任何放化疗，随访至术后5年以上(随访资料完整)。
1.2主要试剂CD83单克隆抗体(HB15a：sc-19677)、CD1a单克隆抗体(GM357101/02/04)、Envision试剂盒(二抗、三抗试剂)均购于上海基因科技有限公司。
流式细胞仪(FACS Calibur，Becton Dickinson， USA)，PE标记的抗CD83抗体、APC标记的抗CD1a抗体，均为美国BD公司产品。
1.3免疫组化染色采用SABC法检测操作流程，具体操作步骤按照说明书进行。
以试剂公司提供的阳性切片为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
判定结果：CD83、CD1a均定位于胞膜或胞浆。
以细胞膜、细胞浆或细胞核呈棕黄色颗粒为阳性。
光镜下切片按统一放大倍数(×400)，选肿瘤区阳性表达最强的5个高倍视野，数码拍照，输入图像分析软件Image-Pro Plus 6.0中，准确分割出阳性区域，测量单位光学密度值(Mean Density)。
相同条件下，每个图片测量3次，以所得3个光密度值的均数作为该图片视野中CD83、CD1a的表达强度。
以同一切片的5个视野各自测得的平均光密度值的均数作为该切片所代表的单样本的CD83、CD1a的表达强度。
1.4流式细胞术测定取10g标本，经脱蜡、水化、胰蛋白酶37℃恒温水浴震动消化30min，300目尼龙网过滤，生理盐水10min离心2次(500～800r/min)，去除细胞碎片。
沉淀细胞PBS重悬并计数，取106个细胞，加入流式细胞检测管，离心弃上清，分别加入抗CD83-PE抗体、抗CD1a-APC抗体，混匀后室温避光孵育30min，1mL PBS稀释，离心弃上清，加固定液150μL上机检测。
1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
计量资料的均数比较采用独立样本的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1大肠癌组织中TIDC的CD83和CD1a表达60例大肠癌组织进行免疫组化检测，CD83阳性表达19例。
各标本间阳性细胞分布不一，肿瘤细胞间(图1A)或肿瘤边缘正常组织(图1B)中均有散在分布，胞体较大，圆形。
CD1a阳性表达24例。
胞体较大，圆形，阳性细胞散在分布于癌巢内(图1C)、肿瘤周边及正常组织之间(图1D)，以癌巢组织区域分布较多。
60例大肠癌组织经流式细胞仪均检测到CD83和CD1a表达(图2A、图2B)。
CD83表达范围在0.06%～3.98%。
CD1a表达范围在0.33%～9.45%。
图1CD83及CD1a在大肠癌组织及边缘组织中的表达Fig.1 CD83 and CD1a expressed in colorectal cancer tissues and the edge(DAB，×200)A：大肠癌组织CD83表达;B：大肠癌组织边缘CD83表达：C大肠癌组织CD1a表达：D大肠癌组织边缘CD1a表达。
图2CD83及CD1a在≥5年生存组及<3年死亡组大肠癌组织中的表达Fig.2 CD83 and CD1a expressed in colorectal cancer tissues of ≥5-year survival group and<3-year death groupA：≥5年生存组大肠癌组织CD83、CD1a表达;B：<3年死亡组大肠癌组织CD83、CD1a表达。
2.2大肠癌组织中TIDC的CD83和CD1a表达与临床的关系CD83和CD1a 的表达与大肠癌患者分化程度、淋巴结转移无明显关系，与Dukes分期、预后相关。
免疫组化检测显示(表1)，CD83和CD1a在A期+B期大肠癌中表达均高于C期+D期组，差异有统计学意义(P<0.05);≥5年生存组表达高于≤3年死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)。