牛羊布氏杆菌病血清学诊断
布病血清学诊断
虎红平板凝集试验
简便、快速易行， 具有较好的特异性， 有一定的敏感性， 检查牛的阳性率稍 高于绵山羊。 高于绵山羊。 该法可用于大面积 检疫。
弃掉0.5 弃掉0.5 0.5
菌液 1 2 3 4 5 6 7
0.5 0.5 0.5 0.5
结 果
试管凝集试验原理
布鲁氏菌试管凝集试验设计
单位：ml
比浊管的制备
管号 1 2 3 4 5 1:40稀释抗原 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 石炭酸 盐水 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 清亮度 100% 75% 50% 25% 0% 标记
布鲁氏菌的诊断
1：50—1：100++以上 50 1 100++以上 目前国内定1 100++，但国际定1 目前国内定1：100++，但国际定1：160++ 对半年内有菌苗接触史者，虽达1 100—1 对半年内有菌苗接触史者，虽达1：100 1： 160++， 160++，过2—4周应再次检查，效价升高1倍 4周应再次检查，效价升高1 以上方能确定，最好用补体结和试验检查。 以上方能确定，最好用补体结和试验检查。 补体结合试验1 10＋＋ ＋＋以上 补体结合试验1：10＋＋以上
评价：试管凝集试验是Wright Sample于1898年首 Wright和 评价：试管凝集试验是Wright和Sample于1898年首 先建立的， 先建立的，是布病诊断在国际上唯一的全标化 方法，使用广泛，经久不衰。特异性好， 方法，使用广泛，经久不衰。特异性好，也较 敏感，实用性强，诊断、流调、监测均适用。 敏感，实用性强，诊断、流调、监测均适用。 缺点： 缺点： — 有前带现象。 有前带现象。 — 不能区别人工免疫和自然感染。 不能区别人工免疫和自然感染。 — 产生一定的交叉反应。 产生一定的交叉反应。 — 慢，需要两天。 需要两天。
牛羊布氏杆菌病血清学诊断
牛羊布氏杆菌病血清学诊断【目的要求】通过布氏杆菌病血清学试管凝集反应和玻板凝集反应及变态反应的操作，掌握牛羊布氏杆菌病的检疫方法。
【设备与材料】器材恒温箱、灭菌试管、采血用注射器及针头、皮内注射器及针头、小试管及试管架、各种刻度吸管、平板凝集试验箱、酒精灯、火柴、玻璃板、蜡笔、牙签、洗耳球、工作衣帽、废弃缸。
药品来苏儿或新洁尔灭、0.5％石炭酸生理盐水或5%～10%盐水、生理盐水、布氏杆菌试管凝集抗原和玻板凝集抗原、布氏杆菌水解素、布病阳性和阴性血清、70%酒精棉球、5%碘酊棉球等。
【方法步骤】一．血清凝集反应试验采血及血清的分离：被检牛、羊颈静脉无菌操作采血10～15mL，于灭菌试管中，倾斜放置10～12h,待血清析出后,用毛细吸管吸取血清于标有畜号的灭菌试管内，封存被检。
1．试管凝集反应（1）操作方法：①取洁净小试管7支编号后于试管架上，分别按表1-1，加入0.5%石炭酸生理盐水（第1管加1.15 mL，第2～5管加入0. 5 mL,第6、7管不加）。
②吸取被检血清0.1mL加入第1管中,混匀后吸出0.25mL弃入废弃缸内,再吸入0.5mL加入第2管中,混匀,吸取0.5mL加入第3管,以此类推至第4管中,混匀后吸出0.5mL弃入废弃缸内,使1～4管均为0.5 mL,而被检血清递减稀释到1:200倍。
对照组第5管中不加血清,第6管中加入1:25稀释的布氏杆菌标准阳性血清0.5mL,第7管中加入1:25稀释的布氏杆菌标准阴性血清0.5mL。
③每管加入0.5mL1：20稀释抗原（用0.5%石炭酸生理盐水将布氏杆菌试管凝集抗原进行1：20的稀释）。
④加样完毕，振荡使被检血清和抗原充分混合后，置于37℃恒温箱中12～18h,取出后在室温中静置2～4h。
观察并判定结果。
（2）结果判定＋＋＋＋:细菌100%凝集，呈伞状沉淀于管底，上层液清亮透明。
＋＋＋：细菌75%凝集，凝集现象同上，上层液稍混浊。
＋＋：细菌50%凝集，管底有中等量沉淀，上层液半透明。
布病血清学检疫定稿
性
阳性
注意事项
本抗原适合于大数量田间检疫和筛选诊断试验用。
本试验出现阳性反应的动物，需经试管凝集试验 或其它辅助试验方可定性。 本抗原使用前应充分摇匀，方可使用。 凡本抗原出现污染或摇不散的凝集块者不得使用。
布鲁氏菌病试管凝集试验
原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体 产生特异性抗体，这种抗体可与相应的布 氏菌抗原发生特异性结合，在电解质的作 用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也 就是用已知抗原查未知抗体。
2.2牛、马、鹿、骆驼1：100血清稀释，猪、山羊、绵羊 和狗1：50血清稀释，出现“＋＋”以上凝集现象时，被 检血清判定为阳性。 2.3牛、马、鹿、骆驼1：50血清稀释，猪、山羊、绵羊、 狗1：25血清稀释，出现“＋＋”以上凝集现象时，被检 血清判定为可疑反应。 可疑反应家畜经3～4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊 判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜 没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。
布鲁氏菌病试管凝集反应试验（羊、猪）
1号管 0.5% 石 炭 酸 10%盐水 被检血清 或阳阴性 血清对照 试管中加 抗原以前 液体量 加抗原液 （1：10稀 释好的） 血清稀 释度 1.15
吸0.5ml
2 号管 0.5
3号管 0.5
4号管 0.5
.......... ..........
.......... ..........
三分是英制管道直径长度的叫法，换算成毫米为 9.525mm，这里指内径约为10mm试管
操作方法
1.按常规方法采血分离血清。 2.运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免 影响凝集价。若3d内不能送检，按每9ml血清加 1ml5%石碳酸生理盐水防腐，也可冷藏方法运送 血清。 3.被检血清的稀释 以羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。 3.1 第1管标记检验编码后加1.15mL稀释液。 3.2 第2～4管各加入0.5mL稀释液。 3.3 然后向第1管内加入0.1mL被检血清，并混合 均匀。充分混匀后弃去混合液0.25mL。
青海省祁连县默勒镇牛羊布鲁氏菌病的血清学调查
流产病史 ， 并对种公畜进行布氏杆菌病的抽血 检测 ， 检测 ３７ ６份 （ 中牦牛血液 样品 ５ ５份 ， 羊血液样 品 共 ０ 其 ９ 绵
３１ １ ） 其 阳性 率 为 ５ ６ 。 １份 ， ．７ 关键词 牦 牛 ； 羊 ； 鲁 氏 菌病 ； 清学 检 测 绵 布 血
默勒镇是祁 连县 最 大 的畜 牧业 乡镇 ， 于祁 连 处 县东南部 ， 有牲畜 ３ ． ６万头 （ ， ３０ 只） 占全县 牲畜 总数 白藏羊种羊 、 肉 、 白毛而 闻 名 。布 鲁 氏 菌病 （ 羊 大 简
２ ０ 年 ３月 ３ 至 ４月 中旬 ， 默 勒镇 地 区 ６个 加 液器 。 ０９ ０Ｉ １ ＝ 对
将 被啄部位用 紫药水 涂抹 ， 这样可 以覆盖血 色 ， 同时 采取 措施 。方法是用 晶体 敌百 虫按 ０ ２ 的 比例对 ．
可起 到收敛 和抑菌 的作用 。 饲料 营养 全 面 ： 料 的 营养成 分 要全 面 、 足 。 饲 充 水在熄 灯前 向鸡 的腹 部喷雾 ， 一次 即可 。
饲料 ： 季节饲料 和饲 料原料 易霉变 ， 慎喂给鸡 同时保证鸡 只能 喝到充足 清洁 的饮 水 。切忌不 可将 梅雨 不
只后 果会很严 重 。改 变饲 料 粒型 ： 粒料 比粉 料更 食盐加 在饮水 中， 颗 以免鸡 只中毒死亡 。 易引起 啄癖 。产蛋期 饲料宜做 成粉料 。 及 时驱虫 ： 鸡群换 上体表寄 生虫羽 虱时 ， 立 即 应 （ 责任 编辑 ： 魏利平）
试 管凝集 反应 按 照相关 规程 ， 进行 操作 及判 断 。 有 可能感 染本 病 的人 员 均 应进 行 预 防接 种 ， 据本 根
２ 判 定 标 准 与结 果
２ １ 判 定标 准 ．
在 阴 阳 性 对 照 成 立 的 前 提 下 ， 检 血 清 在 菌全 乳环 状试 验 以及 酶 联 免疫 吸 附 试 验方 法 等 ， 补 这
布氏杆菌病的血清学试验诊断方法
加 在第 ２管 内 ， 混匀， 再吸 Ｏ ． ５ ｍＬ加 入 第 ３支 试 管 内， 依次类 推 至第 ４管 ， 混匀 后 ， 吸取 ０ ． ５ ｍｌ 弃之， 如 此进 行 倍 比稀 释 ， 其 被 检血 清 稀 释 度 分别 为 １： ２ ５ 、 １： ５ ０ 、 １： １ Ｏ ０和 １：２ ０ ０ 。第 ５管 不 加 血 清 ， 第 ６管 加 １： ２ ５ 稀 释 的布 氏杆菌 阳性血 清 ０ ． ５ ｍｌ ， 第 ７管 加 １： ２ ５ 稀 释 的阴性 血清 ０ ． ５ ｍＥ。 用 ０ ． ５ 石炭酸生理盐水 ， 将 布 氏 杆 菌 试 管 凝 集 抗原进 行 １： ２ ０倍 稀 释 ， 每管加入 ０ ． ５ ｍＬ， 振 摇 均匀 ， 置于 ３ ７℃恒 温箱 中 １ ８ ～２ ４ ｈ ， 取 出后 进 行 结 果 判定 。 确 定血 清凝集 价 时 ， 以出 现 ＋ ＋ 以 上凝 集 现 象 的最高 稀释 度为 准 。 ＋＋ ＋ ＋ ： 试 管 底 部 有 极 明显 的伞 状 凝 集 物 ， 上 层液 体完 全清 亮透 明 ， 即ｉ ０ ０ 凝集 。 十＋ ＋ ： 试 管 底部 有 明 显 凝 集 物 ， 上 层 液 体 稍 有 混浊 ， 即７ ５ 凝集 。 ＋＋： 试 管底部有明显凝集物 ， 上 层 液 体 不 甚 透 明， 即 ５ Ｏ 凝集。 ＋： 试 管 底部 有 少 量凝 集 物 ， 上 层 液体 混 浊 ， 不
在阳、 阴性 血 清 对 照 成 立 的条 件 下 ， 方 可 对 被
：
２ ． ３ 判 定 标 准 牛、 马 和骆 驼凝 集 价 １：１ ０ ０以上 ； 猪、 山羊 、 绵
羊 和 狗 １： ５ Ｏ以 上 为 阳性 。
牛、 马 和骆驼 １： ５ ０ ； 猪、 羊等 １： ２ ５ 为 可疑 。 可疑反 应 的家畜 ， 经 ３ ～４周 ， 须 重新 采血 检验 ， 牛 和羊 ， 如果 重检 时仍 为可 疑， 即可判 定为 阳性。
牛羊布氏杆菌病诊断技术要点及防控措施
502023.10牛羊布氏杆菌病诊断技术要点及防控措施刘先萍（青海省甘德县青珍乡畜牧兽医站，青海 甘德 814100）牛羊布氏杆菌病是牛羊常见疾病，其能直接影响母畜繁育，降低幼畜存活率，带来严重的经济损失。
因此充分掌握相关的知识内容，了解该病的诊断技术要点，并在日常工作中做好防护措施，实现对该病的有效预防和治疗，对牛羊养殖业的健康发展具有重要意义。
1 牛羊布氏杆菌病常见症状牛羊布氏杆菌病属于隐性感染疾病，其主要表现症状为流产。
怀孕三个月左右的牛羊若患有布氏杆菌病，则极有可能出现流产现象。
在患病母畜流产前期，会精神萎靡、食欲减退或者是坐立不安，情况严重时，还可能患子宫内膜炎，阴道还会排出污秽物。
此外，通过调研可以发现，部分牛羊在患有布氏杆菌病后会患上乳腺炎、关节炎等多种并发症，部分公畜在患病后还会患上严重的附睾炎与睾丸炎，导致其无法正常繁育。
因此必须要认识到该种疾病的严重性，并全面加大研究投入，以降低该疾病的发生率，在疾病发生时要及时进行诊断与治疗，有效保障牛羊健康。
2 牛羊布氏杆菌病的诊断技术要点在发现牛羊出现上述症状时，养殖户可初步判断牛羊患有布氏杆菌病。
如要确诊，则必须在实验室实施检查，进而精准判断牛羊所患疾病，以免对后续治疗造成不良影响。
检查时，应重点检查以下内容。
2.1 细菌学检查细菌学检查是牛羊布氏杆菌病的常见诊断技术之一。
在实际工作中，需先在无菌状态下对流产牛羊胎儿的胎衣、胃内容物、淋巴结、患病母牛羊的脓肿脓汁及阴道分泌物等进行采集，并结合规范要求将采集的样本制作为涂片。
然后，对涂片进行干燥处理。
利用火焰对其固定，用2%的沙黄进行加温染色。
在完成水洗操作后，用1%的孔雀绿水溶液进行复染。
在确认上述各项操作均符合要求后，应及时开展涂片的清洗与镜检工作。
在检查过程中若发现涂片呈蓝色，即代表牛羊患有其他疾病；若发现呈红色，即代表牛羊患有布鲁氏杆菌病。
2.2 血清学诊断血清学诊断技术的主要原理是对已有的布鲁氏杆菌抗原检测被检牛羊血清中存在的抗体进行利用，以此判断牛羊是否患有布氏杆菌病。
羊布病血清学诊断方法
羊布病血清学诊断方法羊布病（scrapie）是一种神经变性疾病，主要影响绵羊和山羊。
目前，病症的确诊主要依靠羊布病血清学诊断方法。
下面将对羊布病血清学诊断方法进行详细介绍。
一、病理学观察病理学观察是羊布病诊断的关键。
在动物死亡或者丧失活力的状况下，进行组织病理学检查，特别是对中枢神经系统组织的检查。
主要包括病理切片、免疫组化染色和电子显微镜检查。
1. 病理切片：将组织标本进行固定、切片和染色，观察细胞异常变化。
羊布病的典型病理改变是神经元丢失、星形胶质细胞变性和淀粉样斑块（amyloid plaques）的形成。
2. 免疫组化染色：采用抗体与相关蛋白质反应，通过组织染色来检测相关蛋白质的表达情况。
比如通过对PrPSc（Prion Protein Scrapie）的免疫组化染色来观察羊布病相关蛋白质的沉积情况。
3.电子显微镜检查：使用电子显微镜观察样本中存在的羊布病相关蛋白质结构，进一步确认诊断。
二、免疫学检测免疫学检测主要利用血清中特异性抗体与病原体相关抗原发生反应，来确定感染羊布病的存在。
目前常用的免疫学检测方法主要有免疫荧光（Immunofluorescence）、酶联免疫吸附检测（ELISA）和免疫印迹（Western Blot）。
1.免疫荧光：采用荧光标记的抗体与待检测的样本进行反应，通过荧光显微镜观察是否发出荧光信号。
该方法可用于检测待测样本中的PrPSc 蛋白。
2.ELISA：通过固相酶联免疫吸附法，将待测样本中的PrPSc蛋白与特异性抗体结合，然后加入酶标记的二抗，测定其颜色变化来判断是否阳性。
该方法操作简单、高效。
3.免疫印迹：将待测样本中的PrPSc蛋白通过电泳分离，然后转移到膜上，再用特异性抗体与其结合，通过相关酶的作用而显示出条带。
该方法可以进一步确认PrPSc蛋白的存在。
以上免疫学检测方法都有其优点和局限性，需要结合实际情况选择合适的方法。
总结起来，羊布病的血清学诊断方法主要包括病理学观察和免疫学检测两大方面。
牛羊布氏杆菌病的血清学检测调查
应 当全面体 现 “ 防为 主 、 预 防重 于治 ” 的原 则 。 坚
持 自繁 自养 自育 ， 需 引种或 需补 充畜群 时 ， 严格 确 要
４ 讨 论
４１ 结果讨 养 ５ ｄ以上 ， ０ 同时进 行布 病 的检 查 、 ， 全群两 次 免疫生 物学 检查 阴性 者 ， 可 以与 才
２１３ 平 板凝 集 抗 原 ：系 黑 龙 江 省 生 物 制 品 厂生 ．．
产， 批号 为 ２ ｏ ． 。 ｏ ９０ ３ ２２ 试 验方法 ．
２３５ 一 液 体均匀 浑浊 ， ．． ： 无凝 集 现象 。 出现 ５ ％以上 凝 集 的最 高 稀 释 倍 数 就 是 这 份 ０
血 清 的凝集 价 ，牛血 清凝 集 价为 １１０以 上判 为 阳 ： ０ 性， 羊血 清凝集 价 为 １１０以上判 为 阳性 。 ： ０ ３ 结 果 平板凝集 反应试验 简单 、 实用 。通过对 ３ ０份牛 ５
板 均匀 加温 至 ３ ℃左 右 ，－ ｒ ｎ后 按照 判定 标准 记 ０ ５８ｉ ａ 录反应 结果 。
２３ 结 果 判 定 ．
牛 、 存栏 数将 采样 任务分 解 到各乡 镇 ， 定采 样人 羊 确
员 并 限 定 时 间 和采 血 量 及 时送 检 。共 采 集 牛 血 清 ３ ０份 、 ５ 羊血 清 ７ ０份 ， ０ 及时 监测 。 ２ 材 料 和 方 法
年 １ ） 一经 发现 有布 病 阳性畜 ， 即淘汰 处理 。 次 ， 立
４３ 消 灭措施 ．
畜 群 中如 果发 现有 流产 畜 ， 除隔离 流产 畜 、 消毒
环 境及 妥善处 理 流产胎 儿 、胎衣外 ，应尽快 做 出诊
重 视重 大动 物疫病 （ 国家规 定 的一 类 动物疫 病 ） 检疫 而忽视 了其 他动 物疫病 检疫 ，应 加强 免疫 和严 把检
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牛羊布氏杆菌病血清学诊断
【目的要求】
通过布氏杆菌病血清学试管凝集反应和玻板凝集反应及变态反应的操作，掌握牛羊布氏杆菌病的检疫方法。
【设备与材料】
器材恒温箱、灭菌试管、采血用注射器及针头、皮内注射器及针头、小试管及试管架、各种刻度吸管、平板凝集试验箱、酒精灯、火柴、玻璃板、蜡笔、牙签、洗耳球、工作衣帽、废弃缸。
药品来苏儿或新洁尔灭、0.5％石炭酸生理盐水或5%～10%盐水、生理盐水、布氏杆菌试管凝集抗原和玻板凝集抗原、布氏杆菌水解素、布病阳性和阴性血清、70%酒精棉球、5%碘酊棉球等。
【方法步骤】
一．血清凝集反应试验
采血及血清的分离：被检牛、羊颈静脉无菌操作采血10～15mL，于灭菌试管中，倾斜放置10～12h,待血清析出后,用毛细吸管吸取血清于标有畜号的灭菌试管内，封存被检。
1．试管凝集反应
（1）操作方法：
①取洁净小试管7支编号后于试管架上，分别按表1-1，加入0.5%石炭酸生理盐水（第1管加1.15 mL，第2～5管加入0. 5 mL,第6、7管不加）。
②吸取被检血清0.1mL加入第1管中,混匀后吸出0.25mL弃入废弃缸内,再吸入
0.5mL加入第2管中,混匀,吸取0.5mL加入第3管,以此类推至第4管中,混匀后吸出0.5mL弃入废弃缸内,使1～4管均为0.5 mL,而被检血清递减稀释到1:200倍。
对照组第5管中不加血清,第6管中加入1:25稀释的布氏杆菌标准阳性血清
0.5mL,第7管中加入1:25稀释的布氏杆菌标准阴性血清0.5mL。
③每管加入0.5mL1：20稀释抗原（用0.5%石炭酸生理盐水将布氏杆菌试管凝集抗原进行1：20的稀释）。
④加样完毕，振荡使被检血清和抗原充分混合后，置于37℃恒温箱中12～18h,取出后在室温中静置2～4h。
观察并判定结果。
（2）结果判定
＋＋＋＋:细菌100%凝集，呈伞状沉淀于管底，上层液清亮透明。
＋＋＋：细菌75%凝集，凝集现象同上，上层液稍混浊。
＋＋：细菌50%凝集，管底有中等量沉淀，上层液半透明。
＋：细菌25%凝集，管底有少量沉淀，上层液混浊，不透明。
－：无凝集现象，液体完全混浊。
但细菌呈圆点状沉于管底，振荡时均匀混浊。
表1～1 试管凝集反应表
单位:mL
1．15
＋”判定为疑似。
羊1：50 “＋＋”或以上判定为阳性，1：25 “＋＋”判定
为疑似。
疑似反应家畜，再过半个月重检。
仍可疑，则依畜群中有阳性畜定性。
2．玻板凝集试验
（1）操作方法：取洁净玻板一块，用蜡笔划成4个约3cm2方格，用0.2 ml
吸管吸取被检血清分别滴加0.08ml，0.04ml，0.02ml，0.01m于1～4个方格内，
然后在每个方格中加入布氏杆菌玻板凝集抗原0.03ml。
每格用1根牙签分别从
0.01至0.08血清量依次搅拌混匀。
如表1～2。
表1～2 平板凝集反应表单位:ml 方格号 1 2 3 4 阳性血清对照阴性血清对照抗原对照
被检血清（ml） 0.08 0.04 0.02 0.01 阳性血清0.03 阴性血清0.03 生理盐水0.03 平板抗原（ml） 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03
相当于试管凝集价 1：25 1：50 1：100 1：200
判定结果
（2）结果判定
＋＋＋＋:细菌100%凝集，出现大凝集片或小的颗粒，液体完全清亮透明。
＋＋＋：细菌75%凝集，有明显的凝集片，液体基本透明。
＋＋：细菌50%凝集，有可见的凝集片，液体不太透明。
＋：细菌25%凝集，仅有可见的颗粒物，液体混浊。
－：无凝集现象，液体均匀混浊。
（3）判定标准
玻板凝集试验0.08ml，0.04ml，0.02ml，0.01m血清量相当于试管凝集试验
1：25，1：50，1：100，1：200，的凝集价，判定标准参照试管凝集试验。
二．变态反应布氏杆菌水解素皮内注射变态反应，用于绵羊和山羊布氏杆菌
病的检疫。
1．试验方法在羊尾根皱褶或肘关节后方无毛处，用酒精棉球消毒后，皮内注
射0.2 ml布氏杆菌水解素，注射后24h、48h各检查一次。
以反应最强的一次作
为判定依据。
2．判定标准
阳性反应(＋)：注射部位明显水肿，肉眼可见者。
可疑反应（±）：肿胀不明显，通过触诊和与对侧比较来判断。
阴性反应（－）：注射部位无反应或仅有个小的硬结者。
【实训报告】将操作情况和观察结果写一份实训报告。
牛羊布氏杆菌病血清学诊断考核方案。