隐球菌实验室检测
隐球菌病的实验室检测的临床研究进展分析
隐球菌病的实验室检测的临床研究进展分析发布时间：2021-12-24T08:47:07.857Z 来源：《健康世界》2021年21期作者：龙安[导读] 隐球菌病好发于免疫力低下人群，发病缓慢，临床表现不典型，龙安柳州市中医医院检验科，广西柳州545001【摘要】隐球菌病好发于免疫力低下人群，发病缓慢，临床表现不典型，患者感染后难以察觉，容易延误最佳治疗时机。
近年来，临床检测技术发展和进步，对隐球菌认识的增加，使隐球菌病检出率显著提升，同时该疾病实验室检测手段、药敏试验、治疗手段均有较大的进展。
对此，文章总结近几年隐球菌病的实验室检测的临床研究，以提高临床和实验室检测对隐球菌的认识，加强隐球菌病诊断和治疗效果。
【关键词】隐球菌病；实验室检测；研究进展隐球菌病是因隐球菌入侵肺部而感染人体的散播性感染性疾病，大部分病菌局限于肺部，当人体免疫能力下降时，部分病原菌会随血液传播扩散至其他组织和器官，其中皮肤和中枢神经系统是继发感染的常见部位。
目前，隐球菌传播途径尚未明确，传播媒介一般为鸽子粪，人与人之间传播少见。
隐球菌病患者临床表现主要为低热、胸痛、咳嗽、恶心、呕吐等，缺乏特异性，难以根据临床症状检出该疾病[1]。
随着病原菌扩散，会对神经细胞、皮肤、脏器和脊柱造成损伤，威胁患者的生命。
隐球菌病无特效药治疗，只能通过对症治疗缓解病情，抑制病原菌的扩散。
据报道，2014年隐球菌病性脑膜炎患者约22万例，其中死亡率为81.82%左右。
可见，隐球菌病继发感染疾病会增加患者的死亡风险。
对此，临床应加强隐球菌病早期诊断，及时发现病情，阻止病情恶化。
由于隐球菌病临床症状、影像学特征与肺癌、肺结核、肺炎具有相似性，诊断具有一定的难度。
因此，文章总结该疾病的实验室检测研究进展，为临床深入认识和诊断该疾病提供参考。
1.隐球菌的分类隐球菌是一种环境腐生菌，主要从鸽子粪和土壤中分解，隐球菌至少37个种类，其中格特隐球菌、新型隐球菌是入侵感染人体的常见隐球菌。
隐球菌的实验室鉴定方法
隐球菌的实验室鉴定方法：
隐球菌的实验室鉴定方法主要包括以下几种：
1.墨汁染色法：取新鲜标本（如脑脊液）少许，置于载玻片上，滴加印度墨汁或优质
国产墨汁并覆以盖玻片，显微镜暗视野下找见圆球形菌体，菌体周围有一圈肥厚荚膜，折光性强，即为阳性。
多次查找可提高阳性率。
2.尿素酶试验：新型隐球菌可产生尿素酶，而白色念珠菌为阴性。
3.糖同化及发酵试验：新型隐球菌、浅白隐球菌等可同化纤维二糖、肌醇等，但均不
能发酵糖类。
4.酚氧化酶试验：接种左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养基，经2～5d，新型隐球菌呈
棕黑色菌落。
5.真菌培养：将新鲜标本接种于沙保弱培养基中，在适宜温度下培养3-4d可形成肉眼
可见的菌落。
可进一步挑取菌落做质谱鉴定，从而确证是否为隐球菌。
6.血清学检查：由于患者血清中可测到的抗体不多，因此检测抗体阳性率不高，特异
性不强，仅作辅导诊断。
通常检测新型隐球菌荚膜多糖体抗原，以乳胶凝集试验灵敏而特异，且有估计预后和疗效的作用。
7.病理学检查：视病期及受累器官而异。
在脑组织内可以无组织反应而仅见胶样黏液
性水肿。
脑膜呈慢性、非特异性化脓性炎症反应，伴大量淋巴细胞及浆细胞浸润。
慢性病灶中可见结核性肉芽肿样表现。
组织内可见菌体。
隐球菌的检测方案
隐球菌的检测方案引言隐球菌（Cryptococcus）是一类常见的真菌，可以在土壤、植物和鸟粪中找到。
其中一种称为隐球菌黑变种（Cryptococcus neoformans var. neoformans）是人类、动物和鸟类的常见致病菌之一。
感染隐球菌引起的疾病被称为隐球菌病，可在免疫系统受损的人群中引起严重的肺部和神经系统感染。
为了准确地检测隐球菌的存在以及了解其流行病学特征，本文将介绍一种可行的隐球菌检测方案。
材料与方法样品采集采集样品的选择是隐球菌检测方案的第一步。
可以选择多种样品来源，包括环境样品、生物样本等。
常见的环境样品包括土壤、植物表面、鸟粪等，而生物样本可以包括人体组织、体液和动物组织等。
样品处理样品采集后，需要进行适当的处理以提取隐球菌的DNA或RNA。
对于环境样品，可以采用物理方法，如抖动和离心等，来分离悬浮在样品中的菌体。
对于生物样本，可以通过离心等方式分离出菌落并进行处理。
此外，还可以使用DNA/RNA提取试剂盒来提取样品中的核酸。
PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增目标DNA 片段。
在隐球菌的检测中，可以设计引物以特异性地扩增目标隐球菌的DNA。
PCR 反应体系包括隐球菌DNA样品、引物、酶和缓冲液等。
通过PCR扩增可以获得一系列扩增产物。
凝胶电泳分析凝胶电泳是一种常用的生物分析技术，可用于分离和检测DNA分子。
将PCR 扩增产物与DNA分子大小标准品一起加载到琼脂糖凝胶上，并施加电场使DNA分子迁移。
通过观察凝胶电泳图谱，可以判断样品中是否存在目标隐球菌DNA。
测序与比对如果需要进一步确认检测结果，可以对PCR扩增产物进行测序分析。
利用测序仪对PCR产物进行测序，并将测序结果与数据库中的隐球菌序列进行比对，以确定检测到的DNA是否与隐球菌匹配。
数据分析与结果解读对于得到的测序结果，可以利用生物信息学软件进行数据处理和分析。
可以比对数据库中的序列，进行物种鉴定，并分析隐球菌的遗传变异情况。
隐球菌病确诊标准
隐球菌病确诊标准
一、临床表现
隐球菌病患者通常会出现发热、咳嗽、咳痰、胸痛、恶心、呕吐、头痛、脑膜炎等症状。
此外，患者还可能出现其他系统的表现，如皮肤损害、肺部感染等。
二、实验室检查
1. 血液培养：血液中培养出隐球菌是确诊隐球菌病的主要依据。
多次血培养阳性可提高诊断的准确性。
2. 脑脊液培养：对于怀疑有中枢神经系统感染的患者，脑脊液培养出隐球菌也是确诊的依据。
3. 痰液培养：对于怀疑有肺部感染的患者，痰液培养出隐球菌也可以作为诊断的依据。
4. 其他标本培养：如尿液、粪便、组织等也可以用于隐球菌的培养，但阳性率相对较低。
三、病理学检查
病理学检查发现组织切片中存在隐球菌也是确诊隐球菌病的重要方法。
在病理切片中，可以看到隐球菌形成的荚膜和菌体周围形成的空洞。
综合以上三个方面，如果一个患者具有临床表现，且实验室检查和病理学检查均发现隐球菌的存在，即可确诊为隐球菌病。
隐球菌实验室检测
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不同菌量的隐脑病人中的G试验敏感性
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CSF中BDG水平随抗真菌治疗快速下降
抗真菌治疗
隐脑(-)
隐脑(+)
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KOH 10-20%：皮肤标本/痰 革兰染色：多染为革兰阳性 六胺银染色 墨汁染色
真菌镜检
真菌镜检
W7612 CSF 墨汁染色， 隐球菌
W7612 CSF 革兰染色， 隐球菌
真菌镜检
某些真菌病可通过显微镜直接检查确诊 如：卡氏肺孢子菌孢囊的检测
错误的阳性结果也会出现： 如：墨汁染色中溶解的淋巴细胞错误认 为新型隐球菌 脂肪滴容易与出芽酵母细胞混淆
[1]. Burgener-Kairuz P, et al. J Clin Microbiol, 1994, 32:1902–7. [2]. Kermekchiev MB, et al. Nucleic Acids Res, 2009, 37:e40. [3]. Bernal-Martinez Let al. J Clin Microbiol, 2011, 49:3596–9.
EORTC/MSG 2008
GM试验阳性—Probable invasive fungal disease 血清、血浆、BAL、CSF
De Pauw B., et al., CID, 2008, 46:1813-21
GM试验假阳性
新型隐球菌墨汁染色步骤-概述说明以及解释
新型隐球菌墨汁染色步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述隐球菌是一种普遍存在于自然环境中的真菌，它们可以引起隐球菌病，这是一种严重的感染性疾病。
隐球菌墨汁染色是一种常用的实验方法，用于快速检测和鉴定隐球菌的存在。
通过染色，可以使隐球菌在显微镜下更加清晰可见，从而提高诊断效果。
隐球菌墨汁染色步骤主要包括样本制备、染色操作和显微镜观察。
首先，需要采集合适的样本，比如体液或组织切片，然后进行固定和固化处理，以保持细胞的形态和结构。
接下来，将样本进行染色，常用的染色剂是隐球菌墨汁，它可以特异性地染色隐球菌。
在染色过程中，需注意控制染料浓度和染色时间，以确保染色效果的准确性和稳定性。
最后，利用显微镜观察染色后的样本，观察到隐球菌的形态特征，如菌落颜色和形状等，从而判断样本中是否存在隐球菌。
隐球菌墨汁染色的优点是操作简单、成本低廉且结果可靠。
然而，也有一些限制，比如可能存在假阳性结果和染色结果的主观性等。
因此，在进行隐球菌墨汁染色时，应注意控制实验条件，确保染色结果的可靠性和准确性。
总而言之，隐球菌墨汁染色是一种常用的实验方法，用于快速检测和鉴定隐球菌的存在。
在实际应用中，我们需要掌握正确的操作步骤和注意事项，以提高染色效果和准确性。
未来，随着科技的不断进步，相信隐球菌检测方法会变得更加快速、准确和可靠。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：文章结构部分是对整篇长文的组织和布局进行介绍。
它描述了该文本的主要节（章节）的结构和内容，以帮助读者了解文章的框架和逻辑顺序。
本文将按照以下结构来组织内容：第一节引言部分概述了本文的主要内容和目的。
将介绍什么是隐球菌墨汁染色以及其在实验或临床应用中的重要性和作用。
同时，还会对文章的整体结构和框架进行简单介绍，为读者提供整个阅读过程的指南。
第二节正文部分将详细介绍新型隐球菌墨汁染色步骤的要点。
其中，2.1节将重点介绍染色步骤的要点1，可能包括准备实验材料、处理样本、选择合适的染色方法等内容。
隐球菌的实验室鉴定方法
隐球菌的实验室鉴定方法摘要：一、引言二、隐球菌的实验室鉴定方法1.涂片镜检2.生化试验3.血清学试验4.分子生物学方法三、各种方法的优缺点及适用范围四、我国隐球菌实验室鉴定现状及展望五、结论正文：一、引言隐球菌（Cryptococcus）是一类广泛存在于自然环境中的酵母型真菌，可以在人体内引起隐球菌病。
随着近年来免疫抑制剂的应用和器官移植等医疗技术的不断发展，隐球菌病的发病率逐渐上升。
早期诊断和准确鉴定隐球菌对临床治疗和预后具有重要意义。
本文将对隐球菌的实验室鉴定方法进行综述，以期为临床实验室提供参考。
二、隐球菌的实验室鉴定方法1.涂片镜检涂片镜检是隐球菌实验室鉴定的常用方法。
通过将患者标本涂抹在载玻片上，用瑞氏染色或墨汁染色后镜检，观察菌落的形态、颜色和结构。
此方法操作简便，但准确性受染色效果和检验人员经验影响，容易出现误诊。
2.生化试验生化试验是通过对隐球菌的代谢产物进行鉴定，从而判断其种属。
常见的生化试验包括糖酵解、产氨、氧化酶试验等。
生化试验可以快速初步鉴定隐球菌，但特异性较低，难以区分同属不同种的隐球菌。
3.血清学试验血清学试验是通过检测患者血清中抗隐球菌抗体，从而判断患者是否感染隐球菌。
常用的血清学方法有免疫荧光法、酶联免疫吸附法等。
血清学试验具有较高的敏感性和特异性，但需患者血清样本，且存在假阳性或假阴性的情况。
4.分子生物学方法分子生物学方法通过对隐球菌的基因进行检测，从而实现对其种属和基因型的鉴定。
常用的分子生物学方法有PCR、实时荧光定量PCR、DNA测序等。
分子生物学方法具有较高的准确性，但操作复杂，对实验室设备要求较高。
三、各种方法的优缺点及适用范围涂片镜检适用于快速初步鉴定，但准确性较低；生化试验快速初步鉴定，但特异性较低；血清学试验具有较高的敏感性和特异性，但需患者血清样本；分子生物学方法具有较高的准确性，但操作复杂。
在实际应用中，可根据实验室条件和个人需求，选择合适的鉴定方法。
隐球菌脑膜炎的实验室检测
隐球菌脑膜炎的实验室检测首都医科大学附属北京地坛医院王慧珠一、新型隐球菌的特点新型隐球菌广泛分布于自然界中，鸽子粪是主要传染源。
圆形、卵圆形，菌体为宽厚的荚膜包裹；不形成菌丝和孢子；出芽生殖。
分 A 、 B 、 C 、 D 四个血清型。
A型最多见。
致病菌属包括 17 个种和 8 个变种，主要是新型隐球菌新生变种和格特变种，已报道引起人类疾病的还有浅黄隐球菌、浅白隐球菌和罗伦隐球菌，但是很少见。
二、致病性新型隐球菌为条件致病菌，免疫功能低下者为高发人群，但也可发生在免疫功能正常人。
白血病、恶性肿瘤、艾滋病、 SLE 、尿毒症患者。
长期广谱抗生素、激素、免疫抑制剂使用者更易感染。
隐球菌侵入肺部后，局部病变进展缓慢，病变轻微，常无临床症状，但有 20% 以上的病例可由此经血进入中枢神经系统，导致隐球菌性脑膜炎的发生。
三、临床表现（一）起病缓慢、可呈亚急性，潜伏期 2-4 周。
（二）脑膜炎的表现：意识障碍，头痛、发热（以不规则热多见）。
（三）颅内压的表现，可有颅神经损害。
（四）未经治疗病情逐渐恶化（五）血常规正常（六）腰穿：压力增高明显，脑脊液外观透明或微混，白细胞轻中度增多（ 40-400/ul) ，以淋巴细胞为主。
蛋白轻度升高，糖减低，氯化物轻中度减低。
四、其他部位隐球菌病（一）肺隐球菌病（二）皮肤隐球菌病（三）骨隐球菌病五、新型隐球菌对 CNS（中枢神经系统）具有亲和力？机理可能和脑脊液中有隐球菌所需要的天门冬酰胺、肌酸内酰胺等刺激真菌生长的营养因子有关。
六、特殊宿主的隐球菌病隐球菌病是 AIDS 病人最重要的也是致命的真菌感染并发症，在 AIDS 人群中，发病率可达 6% ～ 10% ，而在中部非洲地区可高达 15% ～ 30% ，这可能与发达国家对于AIDS 合并机会感染控制水平有关，即早发现、早治疗。
AIDS 病人患隐球菌病的临床表现与其他免疫受损的病人相似，然而，感染部位常含有更多的菌体， 80% 以上的病人在做出诊断时已有脑膜炎或脑膜脑炎，且病变更广泛。
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微生物学证据-确诊
镜检： 无菌病灶处、病理切片
培养： 以下任一无菌病灶处培养阳性：CSF、组织、无菌病 灶引流液、血 （BALF、颅窦标本、尿中培养出真菌不能确诊）
抗原检测： 隐球菌抗原
4
实验室诊断方法
直接镜检+组织病理 真菌培养+鉴定 血清学 分子生物学
涂片染为革兰阳性 六胺银染色 墨汁染色
G试验：小结
泛真菌marker，无法获知是哪种真菌 高NPV，连续≥2次G试验阳性可提高特异性和
PPV，2次/周进行监测 IFI早期诊断 假阳性高 念珠菌定植不引起G试验升高 动态反应感染程度和抗真菌治疗疗效 抗真菌药物治疗不影响其敏感性
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GM试验
诊断：侵袭性曲霉感染（IA） 检测底物：半乳甘露聚糖
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真菌培养-不同接种方法
隐球菌培养
培养基：SDA、脑心浸液琼脂 （血平皿、巧克力平皿也生长）
孵育温度：25-30度 鉴定方法：生化鉴定，质谱鉴定，基因测序
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抗真菌药物抗菌谱
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抗原检测
IFIs血清学检测方法
真菌
真菌（除外接合 菌和新型隐球菌）
曲霉
抗原、抗体、酶、代谢产物 (1,3)-β-D-葡聚糖
(Exophiala) dermatitisdis
EORTC/MSG 2008
GM试验阳性—Probable invasive fungal disease 血清、血浆、BAL、CSF
De Pauw B., et al., CID, 2008, 46:1813-21
GM试验假阳性
β-内酰胺类抗菌药物：哌拉西林-三唑巴坦 免疫球蛋白、血液制品 高剂量使用激素 透析：不能清除大分子GM 化疗的严重黏膜炎的患者
真菌镜检
真菌镜检
W7612 CSF 墨汁染色， 隐球菌
W7612 CSF 革兰染色， 隐球菌
真菌镜检
某些真菌病可通过显微镜直接检查确诊 如：卡氏肺孢子菌孢囊的检测
错误的阳性结果也会出现： 如：墨汁染色中溶解的淋巴细胞错误认 为新型隐球菌 脂肪滴容易与出芽酵母细胞混淆
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真菌培养
真菌培养
不同菌量的隐脑病人中的G试验敏感性
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CSF中BDG水平随抗真菌治疗快速下降
抗真菌治疗
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隐脑(-) 隐脑(+)
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脑脊液BDG水平与病死率相关
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G试验：至少连续2次检测
283名血液病患者，30名AML、MDS念珠菌血症患者，30名健康志 愿者
sensitivity 97%，specificity 93% 连续≥2次G阳性，可提高特异性、PPV 确诊或拟诊IFI，平均比出现临床症状和体征早10d；阳性患者中
70%比临床表现早3天
Odabasi Z , et a2l.1Clin Infect Dis, 2004, 39: 199-205
半乳甘露聚糖（GM）
新型隐球菌 念珠菌 念珠菌 念珠菌
念珠菌 曲霉、隐球菌 组织胞浆菌
荚膜多糖抗原 甘露聚糖、甘露聚糖抗体
烯醇酶 烯醇酶抗体、其它胞浆内抗原的
抗体 D-阿拉伯糖醇
甘露醇 抗原
标本类型 血清、血浆
血清、BAL （CSF?） 血清、CSF 血清、CSF
血清 血清
血清 血清 血清、尿
b1,3 b1,6 glucans
隐球菌的实验室检测
杨启文 北京协和医院
IFD的诊断和治疗
2
微生物学证据-临床诊断
镜检： 以下任一病灶处查见丝状菌：痰、肺泡灌洗液、支气 管毛刷、窦道析出物
培养： 以下任一病灶处查见丝状菌：肺泡灌洗液、支气管毛 刷、窦道析出物
抗原检测： G试验（血浆、血清） GM试验（血浆、血清、BALF、CSF）
PPL bilayer
b1,3 glucan synthase
G试验
mannoproteins (1,3)-β-D-葡聚糖 (BG)
真菌细胞壁成分 >50%
chitin ergosterol
广泛存在于各种 真菌，除外接合 菌
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G试验检测范围
检测底物： (1,3)-β-D –葡聚糖（BDG） 诊断：侵袭性真菌感染（IFI） 检测频率：2次/周 真菌细胞壁成分：念珠菌，曲霉，镰刀
谷类食物中的GM抗原通过肠道入血
儿童和新生儿：假阳性83%
母乳或配方食品中双歧杆菌与GM有交叉反应
G试验在隐球菌脑膜炎中有无诊断价值？
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G试验诊断隐脑的性能评价
隐脑病人中脑脊液BDG浓度为343（200-597） pg/ml，非隐脑病人中 为37（23-46）pg/ml。
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G试验假阳性影响因素—方法学缺陷
血液透析患者（纤维素膜） 细菌血症、肝硬化、小肠结肠炎 患者使用凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白 IV抗生素（β-内酰胺类：AMC/SAM…） • 抗肿瘤准备：蘑菇多糖、裂褶菌多糖 • 手术中使用棉纱垫、棉拭子等 标本溶血、脂血、黄疸 标本污染（床边消毒纱布，实验室环境粉尘） 实验耗材：所有枪头、试管、玻璃管均应无热原
菌，毛孢子菌，卡氏肺孢子菌，支顶孢 属，酵母菌属 不能检测：接合菌（毛霉、根霉）
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EORTC/MSG 2008
G试验阳性—Probable invasive fungal disease 除外隐球菌病和接合菌病（毛霉、根霉
、犁头霉）
De Pauw B., et al., CID, 2008, 46:1813-21
曲霉细胞壁成分 菌丝在组织中生长时释放 热稳定 可溶性： serum, BAL, CSF 检测频率：2次/周 交叉反应：马内菲青霉（多种青霉、拟青霉）、深红酵母 、新型隐球菌 、头地霉 、顶孢霉、链格孢 、郁金香葡萄孢 、枝状枝孢霉 、多主枝孢霉 、尖镰孢 、宛氏拟青霉、产黄
青霉、指状青霉、红色发癣菌 、Wallemia sebi、Wangiella