抗氧化实验方法
体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂(完整资料).doc
【最新整理，下载后即可编辑】3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。
取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。
以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
抗氧化实验方法
1还原力的测定之羊若含玉创作样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混杂液中.混杂物在50℃保温20min，然后在反响混杂物中参加2ml 10%的TCA，混杂后以3000rpm离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反响试管中反响，10min后测定其在700nm处的吸光值.吸光值越大标明还原力越强.注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变更，例如2.5，5之类变更.但具体情况应依据吸光值大小而定.0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表.铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中.比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）.2 DPPH自由基清除活性的测定将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混杂，振荡，在室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）.清除率盘算公式为：空白为1.5 ml 95%的乙醇参加1.5 ml蒸馏水调零.式中：Ac——对比为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变更，如0.5,1,2,2.5之类变更，但是具体情况应视清除率而定，最终成果应有清除率大于50%和小于50%的情况.DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操纵.并且DPPH试剂很昂贵，用时注意勤俭.0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml.3 在卵黄磷脂体系中抗氧化才能的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模子反响体系包含:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS 配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL.对比管除不加样液外其他试剂同前.将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温造就1h.取出后，参加20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对比管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分离参加质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却.空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率暗示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一参加样品的吸光度注意：卵黄溶液不必时应放置冰箱保管.酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调剂，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度进行调剂.硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保管.并以50m mol/L NaOH溶液配制.再在50℃水浴溶解.FeSO4溶液应以棕色瓶盛装.4 过氧化值的测定参照本食品学院林华娟等先生主编的食品剖析实验课本一书.5 超氧阴离子自由基清除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对比）：对比组和空白对比组参加4ml 蒸馏水（去离子水）和，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组参加0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替.震匀后立时在320nm处测定吸光值.迅速混匀并开端计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后停止，以空白对比管调零.作吸光度随时间变更的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对比.（V对比在0.05A/min~0.065A/min之间，不然应调剂邻苯三酚参加量）样品自氧化速率（V样品）：样品组和空白组均参加一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组参加0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替.震匀后立时在320nm处测定吸光值.迅速混匀并开端计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后停止，以空白管调零.作吸光度随时间变更的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式盘算样品对超氧阴离子的抑制率：式中：抑制率(%)=(V对比-V样品)/V对比×100V对比－对比组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物实验资料：摘自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效果受到多种因素的影响，只有在生物体内具有抗氧化作用的物质才干有效的清除体内产生的自由基，才干表示出一定的生物活性.由于体外抗氧化测定办法容易操纵，周期短，因此评价一种物质的抗氧化效果往往首先采取体外抗氧化体系.但体外抗氧化体系往往与人体内的生理情况相差太大，许多研究成果标明采取体外办法评价有效的抗氧化剂进入人体后却表示不出应有的抗氧化效果，因此抗氧化剂的抗氧化效果在采取体外办法进行初步评价后应采取动物实验进行体内评价.人体在正常生理代谢进程中会产生少量的含氧自由基，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等，这些自由基通过自然存在于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维生素E组成的抗氧化系统来消除.因此，在正常状态下，体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡中，正常量的自由基对细胞的生长、决裂、解毒等具有有益的作用，在杀菌、免疫调节等方面具有积极而重要的意义.然而，随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下降，从而导致机体代谢异常而骤然产生大量活性氧自由基；或由于机体抗氧化物质缺乏，使促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡失常，致使自由基与机的一些生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等产生反响，生成大量氧化物或过氧化物，并进一步引起细胞死亡和组织损伤.业已证明，氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化、神经退行性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)沾染等均有亲密关系.D-半乳糖诱导的亚急性衰老模子是依照衰老的代谢学说树立的，其机制与糖代谢紊乱[6]、D-半乳糖醇中毒[7]和活性氧自由基多余有关；众多研究标明是生物体内含有半乳糖氧化酶，在催化D-半乳糖时可产生超氧阴离子自由基(O2·-)和H2O2；如果长期人为地赐与过量D-半乳糖，使机体和细胞内自由基产生过量，除了造成组织细胞直接损伤外，还导致抗氧化酶活气下降和过氧化产品积聚，从而表示出与人类自然衰老相似的生化变更、免疫功效低下、基因表达与调控异常细胞滋生力下降及细胞退化性衰变等.有研究标明，D-半乳糖可下降人胚肺二倍体成纤维细胞(HBS)，从而使该细胞SOD活气下降和过氧化产品MDA增多，从而起到加快细胞老化的作用.本文在前述章节已经标明，鹰嘴豆蛋白酶解物具有体外抗氧化活性，但其在生物体内的作用效果尚不清楚.为此本章采取D-半乳糖诱导致衰老少鼠作为模子，分离以小鼠的血清、肝脏和心脏组织中的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性作为评价指标，探讨鹰嘴豆蛋白酶解物在生物体内的作用，为揭示鹰嘴豆蛋白酶解物对体内过氧化状态的影响，明确其物质基本和相关机制提供证据.。
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl 缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
抗氧化实验方法
1还本力的测定之阳早格格创做样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐慢冲液（pH6.6）战2ml 1%的铁氰化钾溶液的混同液中.混同物正在50℃保温20min，而后正在反应混同物中加进2ml 10%的TCA，混同后以3000rpm离心10min，与上浑液2ml与2ml蒸馏火以及0.4ml 0.1%氯化铁正在反招考管中反应，10min后测定其正在700nm处的吸光值.吸光值越大标明还本力越强.注意：修议蛋黑浓度以5mg/ml安排变更，比圆2.5，5之类变更.然而简曲情况应根据吸光值大小而定.0.2mol/L pH6.6的磷酸盐慢冲液的配制睹附表.铁氰化钾溶液应衰拆正在棕色瓶中.比色皿的用法：可睹光(>400nm)用玻璃比色皿（即不标字母大概者标G的比色皿），紫中光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）.2 DPPH自由基扫除活性的测定将1.5ml样品液增加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混同，振荡，正在室温下搁置30min，而后正在波少517nm处检测（Ai）.扫除率估计公式为：空黑为1.5 ml 95%的乙醇加进1.5 ml蒸馏火调整.式中：Ac——对于照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏火正在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇正在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液正在517nm处的吸光值；注意：修议酶解液蛋黑浓度以2mg/ml 安排变更，如0.5,1,2,2.5之类变更，然而是简曲情况应视扫除率而定，最后截止应有扫除率大于50%战小于50%的情况.DPPH样品有毒，需戴心罩战脚套举止支配.而且DPPH试剂很高贵，用时注意俭朴.0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称与0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml.3 正在卵黄磷脂体系中抗氧化本领的测定以卵黄脂蛋黑为底物的LPO模型反应体系包罗:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS慢冲液补脚至2.0mL.对于照管除不加样液中其余试剂共前.将上述2种试管共时置37℃恒温火浴锅中保温培植1h.与出后，加进20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对于照管于3500r/min离心10min，与2.0mL上浑液，分别加进品量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液 1.0mL，加塞于100℃火浴15min，与出热却.空黑管以 2.0mLPBS溶液代替，正在532nm下测定吸光度，样品对于卵黄脂蛋黑LPO 的压制率表示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一加进样品的吸光度注意：卵黄溶液不必时应搁置冰箱保存.酶解液蛋黑浓度以5mg/ml安排安排，然而简曲应视扫除率大小而定，对于酶解液蛋黑浓度举止安排.硫代巴比妥酸溶液需搁置于棕色瓶内保存.并以50m mol/L NaOH溶液配制.再正在50℃火浴溶解.FeSO4溶液应以棕色瓶衰拆.4 过氧化值的测定参照本食品教院林华娟等教授主编的食品分解真验道义一书籍.5 超氧阳离子自由基扫除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对于照）：对于照组战空黑对于照组加进4ml 蒸馏火（去离子火）战，0.1 mol/LTris-HCl 慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm 处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑对于照管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对于照.（V对于照正在0.05A/min~0.065A/min之间，可则应安排邻苯三酚加进量）样品自氧化速率（V样品）：样品组战空黑组均加进一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式估计样品对于超氧阳离子的压制率：式中：压制率(%)=(V对于照-V样品)/V对于照×100V对于照－对于照组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物真验资料：戴自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效验受到多种果素的效率，惟有正在死物体内具备抗氧化做用的物量才搞灵验的扫除体内爆收的自由基，才搞表示出一定的死物活性.由于体中抗氧化测定要领简单支配，周期短，果此评介一种物量的抗氧化效验往往最先采与体中抗氧化体系.然而体中抗氧化体系往往与人体内的死理环境出进太大，许多钻研截止标明采与体中要领评介灵验的抗氧化剂加进人体后却表示不出应有的抗氧化效验，果此抗氧化剂的抗氧化效验正在采与体中要领举止收端评介后应采与动物真验举止体内评介.人体正在仄常死理代开历程中会爆收少量的含氧自由基，如超氧阳离子、羟自由基、过氧化氢等，那些自由基通过自然存留于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维死素E组成的抗氧化系统去与消.果此，正在仄常状态下，体内自由基保护正在一定火仄并处于动向仄稳中，仄常量的自由基对于细胞的死少、团结、解毒等具备有益的效率，正在杀菌、免疫安排等圆里具备主动而要害的意思.然而，随着删龄大概正在某些病理状态下以及肌体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下落，进而引导肌体代开非常十分而骤然爆收洪量活性氧自由基；大概由于肌体抗氧化物量缺乏，使促氧化剂与抗氧化剂之间的仄稳得常，以致自由基与机的一些死物大分子，如蛋黑量、核酸、脂量等爆收反应，死成洪量氧化物大概过氧化物，并进一步引起细胞牺牲战构制益伤.业已道明，氧化益伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉软化、神经退止性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)熏染等均有稀切闭系.D-半乳糖诱导的亚慢性衰老模型是依照衰老的代开教道修坐的，其体制与糖代开混治[6]、D-半乳糖醇中毒[7]战活性氧自由基过剩有闭；稠稀钻研标明是死物体内含有半乳糖氧化酶，正在催化D-半乳糖时可爆收超氧阳离子自由基(O2·-)战H2O2；如果少久人为天赋予过量D-半乳糖，使肌体战细胞内自由基爆收过量，除了制成构制细胞曲交益伤中，还引导抗氧化酶活力下落战过氧化产品聚集，进而表示出与人类自然衰老相似的死化变更、免疫功能矮下、基果表黑与调控非常十分细胞繁殖力下落及细胞退化性衰变等.有钻研标明，D-半乳糖可落矮人胚肺两倍体成纤维细胞(HBS)，进而使该细胞SOD活力落矮战过氧化产品MDA删加，进而起到加速细胞老化的效率.本文正在前述章节已经标明，鹰嘴豆蛋黑酶解物具备体中抗氧化活性，然而其正在死物体内的效率效验尚不领会.为此本章采与D-半乳糖诱引导衰老小鼠动做模型，分别以小鼠的血浑、肝净战心净构制中的丙两醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苦肽过氧化物酶(GSH-Px)活性动做评介指标，探讨鹰嘴豆蛋黑酶解物正在死物体内的效率，为掀穿鹰嘴豆蛋黑酶解物对于体内过氧化状态的效率，明确其物量前提战相闭体制提供凭证.。
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一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。
1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。
当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。
1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。
1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。
按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。
2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。
2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。
抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。
此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。
体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂
3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。
取50 mmol·L -1的Tris -HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。
以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
抗氧化 方法
DPPH法是测定物质抗氧化性能的一种快速简便的方法。
DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基, 在特定波长(515nm下有最大吸收)下测定DPPH与抗氧化物质反应前后吸收值的变化可定量测定被测物质的抗氧化能力，若受试物能清除它,则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。
一、实验方法用微量移液器按表1的体积准确吸取C1、C2、S1、S2四组样液加入96孔板中，室温避光孵育30min后，用酶标仪测定在492nm（我们实验条件下）处的吸光度。
为消除无水乙醇与样品溶液引起的吸光度，分别设定对照空白与样品空白。
所用试剂与DPPH清除率计算公式如下：DPPH：0.25mM 无水乙醇配制，现配现用；DPPH清除率(%)={1 - (S1– S2) / (C1– C2)} × 100(S1、S2、C1、C2分别为样品、样品空白、对照、对照空白的OD492nm)。
表1 样品试剂用量表C1C2S1S2无水乙醇(μL) 样品(μL) DPPH(μL)合计(μL) 100100200200200100100200100100200即2,2‘-azino-di(3-ethylbenzthiazoline6-sulfonic acid，该方法是以这种水溶性的自由基引发剂为显色剂。
ABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS·+这种自由基的最大吸光波长下(一般选择734nm) 检测吸光度的变化来反映物质的抗氧化能力。
1、ABTS工作液的配制准确称量ABTS粉末溶于过硫酸钾(终浓度为2.45mM)配制为7mMABTS溶液，室温放置12-16h以备用。
实验前用无水乙醇稀释至其OD630nm=0.70(±0.02),标准曲线如下:表2不同浓度的ABTS自由基在630nm处光吸收值(OD)由表2知，实验应选择0.3mM的ABTS。
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2.2.3 香青兰挥发油抗氧化活性的检测
2.2.
3.1 有机自由基DPPH ·清除能力的测定
（1）实验试剂的配制
DPPH ·无水乙醇溶液：称取19.72mg DPPH ，用无水乙醇定容至500ml ，得到浓度为0.1mmol/L 的DPPH 溶液。
样品：吸取30μl 的挥发油，加入3.56ml 无水乙醇溶解挥发油；再将此溶液按照2倍梯度稀释至28倍。
（2）有机自由基DPPH ·清除能力的测定
向100μl DPPH ·乙醇溶液中加入不同浓度的香青兰挥发油及无水乙醇使总体积达到200μl 。
振荡器混匀后，室温，避光放置30min 后，在518nm 处测定吸光度，平行测定3次，计算清除率。
%100)(0
210⨯--=A A A A 清除率 式中：A 0--DPPH ·溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度
A 1--DPPH ·溶液100μl +样品溶液100μl 的吸光度
A 2--样品溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度
公式中引入A 2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。
2.2.
3.2 超氧阴离子O 2-·清除能力测定
（1）实验试剂的配制
Tris-HCl 缓冲液：量取2.1ml 浓HCl ，加蒸馏水定容到250ml ，得到0.1mol/LHCl 溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3.0285g ，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml 0.1mol/LHCl 溶液，用蒸馏水定容至500ml 得pH=8.2浓度为50mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液液。
邻苯三酚溶液：称取37.833mg 邻苯三酚，用0.01mol/LHCl 溶液溶解定容至500ml ，得浓度为0.3mmol/L 的邻苯三酚溶液。
样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。
（2）清除超氧阴离子O 2-·能力测定
邻苯三酚自氧化速率V 0的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入2ml 蒸馏水，于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。
将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V 0。
挥发油清除超氧阴离子速率V 1的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入1.8ml 蒸馏水，0.2ml 不同浓度的挥发油于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。
将记录的数据以
时间为横坐标，吸光值为纵坐标，做直线回归得到的斜率表示挥发油清除速率超氧阴离子的速率V 1。
清除率计算公式为：
清除率=%1000
01⨯-V V V 2.2.2.3 羟自由基·OH 清除能力测定
（1）实验试剂的配制
pH=7.4的磷酸盐缓冲液：称取13.609g KH 2PO 4，加蒸馏水溶解定容至250ml ，为A 液；称取45.644gK 2HPO 4，加水定容至500ml ，为B 液。
以体积比A 液：B 液=19：81的比例配置，得到pH=7.4，0.2mol/L 的磷酸缓冲溶液。
5mmol/L 邻菲罗啉水溶液：称取邻菲罗啉0.2478g ，用蒸馏水溶解定容至250ml ，得到浓度为2.5mmol/L 的溶液。
7.5mmol/L FeSO 4溶液：称取1.0428g FeSO 4·7H 2O ，用蒸馏水溶解定容至500ml ，得到浓度为7.5mmol/L 的溶液。
1%H 2O 2溶液：用30%的过氧化氢溶液稀释30倍即得1%过氧化氢溶液。
样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。
（2）清除羟自由基·OH 能力测定
在试管中分别加入2ml pH=7.4的磷酸盐缓冲液，0.3ml 5mmol/L 邻菲罗啉溶液，充分混匀后，加入0.2ml 7.5mmol/L FeS04溶液，每加一管后立即混匀。
然后向其中加入提取溶液，混匀，再加入1%的H 2O 2 1ml ，最后补充体积至8ml 。
另再做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入1%的H 2O 2 1ml ，未损伤管不加H 2O 2，最后补充各管体积至8ml 。
于37℃下保温1h ，测在536nm 下的吸光值，计算清除率，其计算公式为：
%1000
102⨯--=A A A A 清除率 A 0--未损伤管的吸光值；
A 1--损伤管的吸光值；
A 2--加样品液的吸光值。