脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
干细胞提取与保存的技巧与方法
干细胞提取与保存的技巧与方法干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型的细胞，具有巨大的潜力在医学和生物学领域中应用。
干细胞的提取和保存是关键的步骤，本文将介绍干细胞提取和保存的技巧与方法。
一、干细胞提取的技巧与方法1. 骨髓提取法：这是一种常用的干细胞提取方法。
通过无痛穿刺骨髓髓腔，将骨髓液抽取出来。
在抽取骨髓液之前，患者通常接受麻醉以减轻不适感。
骨髓液中富含造血干细胞，是一种常见且具有较高干细胞含量的来源。
2. 脐带血提取法：脐带血也是一种常见的干细胞来源。
在新生儿出生后，由医生采集脐带血样本。
脐带血中的干细胞数量较多且易于提取，因此被广泛应用于临床治疗。
这种方法对于新生儿和脐带血样本的采集具有一定要求，需要专业的医生或护士进行操作。
3. 脂肪组织提取法：越来越多的研究表明，脂肪组织中也存在干细胞。
通过脂肪吸取手术，可以从脂肪组织中提取干细胞。
脂肪组织中的干细胞具有较高的分化潜能和自我更新能力，因此被广泛研究和应用于再生医学。
4. 神经组织提取法：对于神经组织相关的疾病研究，干细胞的提取通常需要从神经组织中进行。
这种方法通常需要进行手术操作，因此对于患者和医生来说都具有一定的风险与挑战。
但是，神经组织中的干细胞对于神经系统疾病的治疗具有重要意义。
二、干细胞保存的技巧与方法1. 冷冻保存：这是最常用的干细胞保存方法之一。
在提取干细胞后，将其以低温冷冻储存。
一般情况下，干细胞在-196℃的液氮中冷冻保存，以确保其长期保存和保持其功能。
在冷冻保存过程中，需要特殊的冷冻冻存液和冷冻设备，操作时需小心谨慎，避免细胞损伤。
2. 固体冻干法：这是一种相对较新的干细胞保存方法。
干细胞在低温下冷冻后，通过冻干设备将水分从细胞中去除，然后将细胞以固体形式保存。
这种方法可以避免细胞在冷冻和解冻过程中的冰晶损伤，并能够长期保存细胞的活性。
3. 混合保存法：有些干细胞存储公司提供混合保存的方法，即将干细胞保存在液氮中冷冻，并同时保存一小部分细胞的活体状态。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
干细胞制剂制备质量管理自律规范
干细胞制剂制备质量管理自律规范中国医药生物技术协会第一章总则第一条为加强干细胞制剂制备质量管理的行业自律，避免干细胞制剂制备过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等风险，确保持续稳定地制备出符合质量标准和预定用途的干细胞制剂，参照国内外相关规定和指南，制定本规范。
第二条干细胞制剂是指用于治疗疾病或改善健康状况的、以不同类型干细胞为主要成分、符合相应质量及安全标准，且具有明确生物学效应的细胞制剂。
第三条本规范适用于干细胞制剂制备的所有阶段。
第二章一般要求第四条干细胞制剂的制备应遵循《药品生产质量管理规范》（GMP）的基本原则及其相关规定以及其他适用的规范性文件。
第五条干细胞制剂制备机构（以下简称制备机构）应建立符合GMP要求、完整的干细胞制剂制备质量管理体系，并设立独立的质量管理部门，履行质量保证和质量控制的职责。
第六条制备机构应根据每种干细胞制剂的特性及其制备工艺进行风险评估，并建立合理的质量管理策略。
第七条制备机构的工作区域应合理设计及布局。
各功能区域应相对独立，应有满足其功能需要的空间、设施、设备和洁净度要求。
质量控制区应与制备区实施物理隔离，行政区、生活区及辅助区等应不防碍干细胞制剂的制备。
第八条干细胞制剂制备的内、外环境应满足其质量保证和预定用途的要求，应严格控制微生物、各种微粒和热原的污染风险。
第九条干细胞制剂制备管理负责人、质量管理负责人和质量受权人应具有与职责相关的专业知识（细胞生物学、微生物学、生物化学或医药等），同时应具有5年以上的相关工作经验或接受过相应的专业培训，应能够履行干细胞制剂制备或质量管理的职责。
制备管理负责人与质量管理负责人、质量受权人不得相互兼任。
第十条从事干细胞制剂制备、质量保证、质量控制及其他相关人员（包括清洁、维修人员、物料仓储管理人员等）均应根据其工作性质进行专业知识、安全防护、应急预案的培训和继续教育。
制备机构应建立人员档案，包括卫生及健康档案。
对直接进行制备和质控操作的已离职员工档案，应至少保留30年。
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。
ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。
大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。
同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。
目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。
为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。
1 脂肪组织采集1.1 脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。
采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。
采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。
脂肪干细胞培养方法 组织块培养法
脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。
脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。
一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。
2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。
脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。
二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。
2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。
三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。
2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。
通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。
在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。
脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。
希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。
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脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞（adipose tissue-derived stromal/stem cells ，ASCs）是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。
ASCs 在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。
大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60% 会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs 移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。
同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs 提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。
目前，国内外尚缺乏ASCs 提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs 在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。
为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs 的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs 制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs 在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。
1脂肪组织采集1.1脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。
采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。
采集机构应具有完整的标准化操作规程（standard operation procedure ，SOP），并备有采集过程中的应急预案。
采集过程应在层流手术室内进行无菌操作，最大限度地减少污染和交叉感染的发生。
1.2脂肪组织供者要求对供者健康状况进行全面检查（如一般信息、既往病史和家族性遗传病等）及病原微生物的感染筛查和在危险疫区停留情况的调查。
身体状态良好、有完整体检报告、无遗传性家族病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒（包括但不仅限于HIV、HBV、HCV 、HTLV、EBV、CMV 等）阴性、梅毒螺旋体阴性（提供脂肪组织的同时，另需提供不少于8ml 外周血用于复检，ABO血型、HLA- Ⅰ类和Ⅱ类分型检查，以备追溯性查询）。
若供者HBV、HCV 、HTLV、EBV、CMV 检查结果为阳性，实验室应具有处理感染性样本的独立物理空间、独立的空调系统，能做到使用后的器具和相关物品可经过灭活处理后再移出该区域。
感染性样本与非感染性样本的处理及制备不使用同一设备，方可进行脂肪组织的采集，但必须使供者知情，同时通知接收、制备、质控及医护人员等做好防护措施。
当实验室不具备上述相对应病原体阳性制备/ 培养区时，不得采集上述阳性供者的脂肪组织。
若供者HIV 、梅毒螺旋体检查结果为阳性时，不得采集供者的脂肪组织。
高度怀疑HIV感染或者考虑HIV 感染窗口期的供者不予采集。
1.3采集方式、采集部位和采集量1.3.1采集方式用肿胀液（生理盐水250ml ＋2%利多卡因10~15ml ＋肾上腺素0.25mg）局部浸润麻醉供脂肪组织区域，以20ml 注射器配备口径1.5~3.5mm 、侧孔3.0~5.0mm 的吸脂针，进入供区，形成负压，呈扇形手动均匀吸取脂肪组织，吸出3~5mm3 脂肪组织颗粒，若脂肪组织颗粒较大，则需要进行手工剪制。
1.3.2采集部位选择下腹部或者大腿内、外侧或者身体其他部位（供者要求的吸脂部位）。
接受注射溶脂、冷冻溶脂、热立塑及超声溶脂的部位不建议作为脂肪组织采集部位。
供区针眼或切口处按压排除肿胀液，进行适当的加压包扎，24~48h 后更换包扎敷料，预防感染，7d 针眼或切口愈合。
1.3.3采集量（脂肪组织，肿胀液除外）女性≤ 45 岁，男性≤ 50岁，脂肪组织采集量不少于50ml 。
女性45~55 岁、男性50~60 岁者不少于80ml 。
男性体脂＞25% 、腰围＞100cm ，女性体脂＞33%、腰围＞88cm ，不少于100ml 。
体脂率=[1.2 ×BMI+0.23 ×年龄－5.4 －10.8 ×性别系数（男=1，女=0）] 。
女性＞55岁，男性＞60岁，或者近期服用减肥药者不建议采集脂肪组织提取ASCs 。
1.4 脂肪组织运输和接收吸取的脂肪组织应保存于标准配置的无菌容器内，贴条码标签，应遵从安全与准确的原则，做到样本与供者一一对应，记录启运时间和到达时间，低温冷链运输，建议时间控制在48h 内，送达制备机构。
制备机构应设置脂肪组织的接收取样工作区，执行登记、初检、核对、暂存、交接等；目检脂肪组织有无污染或变质，应建立脂肪组织异常情况处置标准操作规程。
2ASCs 的制备与储存制备机构或研究应用机构应建立相应完善的SOP ，所有试剂和原材料应明确其来源、批号、质量检定合格报告，应尽可能采用GMP 临床应用级别的原料或国家已批准的可临床应用的产品，相关制备、生产记录及留样应至少保存至使用结束后3个月。
制备人员应该经过专门的技术培训，ASCs的制备建议在B级背景下A 级洁净度级别的环境中进行。
2.1脂肪干细胞的分离采集的脂肪组织用无菌生理盐水冲洗，按照脂肪组织体积加入相应浓度Ⅰ型胶原酶（建议GMP 级）或胰蛋白酶混合液，37℃水浴或气浴振荡，离心，吸弃上层脂肪和液体层，加入生理盐水重悬细胞沉淀，用细胞滤器过滤，去除未消化完全的组织团块，滤液离心，弃上清，获得基质血管成分（stromal vascular fraction ，SVF）。
SVF是围绕在脂肪细胞周围，含有内皮细胞、非特征性基质细胞、血液细胞、巨噬细胞、造血祖细胞、脂肪来源的基质/ 干细胞等细胞的异质性细胞群，台盼蓝染色进行细胞计数。
填写细胞操作记录，包括组织酶解分离时间、细胞数量和活性等。
2.2脂肪干细胞的培养与传代接种SVF至培养瓶中，培养条件为5% CO 2、37 ℃常规培养，保持湿度。
细胞融合度达到70%~80% 时可以传代，收集消化的细胞悬液，接种至培养瓶中，传代培养，培养基应使用无血清培养基或不含血清添加物的细胞培养基。
填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量等。
2.3建立脂肪干细胞种子细胞库收集P2或P3代细胞，做质量检测和性能指标检测（包括细菌、支原体、内外源病毒、细胞活力、细胞鉴别、生长特性、细胞纯度、均一性及内毒素等），调整细胞浓度至（2~3）× 106 个/ml ，分装至细胞冻存管中，贴标签，标注细胞数量、冻存日期及代次等。
将冻存管程序降温后，转入–196 ℃液氮保存，即为种子细胞库，供建立工作细胞库用。
填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。
2.4建立脂肪干细胞工作细胞库经脂肪干细胞种子细胞库传代增殖，将传至P5 代的细胞制成均ASCs的基本性能指标包括细胞形态、周期倍增时间、细胞活性、增殖、细胞表型、集落形成、端粒酶活性等。
质细胞悬液，取样进行临床使用前的质量控制和安全鉴定。
分装于一定数量的冻存管，贴好对应批次细胞标签，保存于–196 ℃液氮中，即为工作细胞库。
填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。
工作细胞库的质量控制和安全鉴定＞种子细胞库质量控制和安全鉴定。
2.5脂肪干细胞冻存数量脂肪干细胞冻存的数量是根据实际需求来计算的，应考虑后续检定需要、保藏年限、检测用数量及复检频率等，根据个体的需要确定，遵循“够用原则”。
ASCs 细胞制剂建议设1 ×10 7 8 * 9个ASCs 为1个单位。
填写细胞操作记录，包括时间、批次、细胞数量、冻存数量等。
3ASCs 的运输3.1参照中国医药生物技术协会《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，ASCs 制剂采取冷链运输，建议运输时间控制在48h 内。
3.2应建立ASCs制剂运输的标准操作规程，运输方式等应经过验证。
防止发生损害、变质、污染或其他不良影响。
每批次ASCs 制剂的整个运输过程应有发运记录，并能够追踪。
3.3若存在安全隐患，应立即召回ASCs制剂，由制备机构进行合法和符合伦理要求的处置并记录存档。
3.4制备机构如委托第三方机构运输ASCs制剂，应评估其承运机构的资质。
承运人应接受制备机构相应的培训，确保其可按照脂肪干细胞制剂运输要求完成运输过程。
应由设有资质的第三方机构复核ASCs 制剂运输。
猪细小病毒检测，必要时包括病毒核酸检测，确保ASCs 制剂临床应用的安全性。
7 ASCs 的质量安全性制备机构根据ASCs 自身特性、临床研究情况，配备相关专业技术人员和设备，确立制剂质量检验操作规程，所有检测方法应经过验证，可以委托有资质的第三方开展相关质量检测。
检验应满足安全性、质量可控性和（或）有效性的基本要求，检测结果应有质量负责人或质量受权人签字审核。
4.1基本性能4.2安全性能ASCs的安全性能指标包括微生物、内毒素、核型、致瘤性、毒性、残留物及人畜共患5ASCs 的分化功能测定5.1向成骨细胞分化能力取对数生长的ASCs，加入成骨诱导液进行培养，第19 天行茜素红染色，镜下观察。
脂肪干细胞被茜素红染成红色，染色面积占总面积的比例≥50%。
5.2向成软骨细胞分化能力取对数生长的ASCs，加入成软骨诱导液进行培养，第14天行甲苯胺蓝或Ⅱ型胶原蛋白抗体进行染色分析，染色面积占总面积比例≥ 80% 。
5.3向成脂肪细胞分化能力取对数生长的ASCs，加入成脂肪分化条件培养基，第12 天行油红O 染色，脂肪干细胞被油红O 染成红色，染色面积占总面积的比例≥ 50%。
6ASCs 的组织再生功能检测6.1促血管形成功能用含100ml/L FBS 的DMEM/F12 培养体系将ASCs 以1×105个/ml 密度与脐静脉内皮细_ 胞共培养，4h后，镜下统计形成的血管环数≥ 37/10 000 个细胞。
6.2巨噬细胞极化用含100ml/L FBS 的DMEM/F12 培养体系将ASCs以1×105个/ml 密度与巨噬细胞共培养，24h 后，与巨噬细胞对照组相比，用ELISA试剂盒检测上清中TNF-α、IL-1 β、TGF-β及IL-10 的表达水平，其中TNF-α、IL-1β水平应下降，TGF-β、IL-10水平应上升，差异有统计学意义（P< 0.05）。