薄层色谱法鉴定丹皮酚

来自中国药典2005一部牡丹皮拼音名：Mudanpi英文名：CORTEX MOUTAN书页号：2005年版一部-119本品为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。

秋季采挖根部，除去细根和泥沙，剥取根皮，晒干。

【性状】本品呈筒状或半筒状，有纵剖开的裂缝，略向内卷曲或张开，长5～20cm，直径0.5～1.2cm，厚0.1～0.4cm。

外表面灰褐色或黄褐色，有多数横长皮孔样突起及细根痕，栓皮脱落处粉红色；内表面淡灰黄色或浅棕色，有明显的细纵纹，常见发亮的结晶。

质硬而脆，易折断，断面较平坦，淡粉红色，粉性。

气芳香，味微苦而涩。

【鉴别】(1) 本品粉末淡红棕色。

淀粉粒甚多，单粒类圆形或多角形，直径3～16μm，脐点点状、裂缝状或飞鸟状；复粒由2～6 分粒组成。

草酸钙簇晶直径9～45μm，有时含晶细胞连接，簇晶排列成行，或一个细胞含数个簇晶。

木栓细胞长方形，壁稍厚，浅红色。

(2) 取本品粉末1g，加乙醚10ml，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙铜2ml使溶解，作为供试品溶液。

另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1ml 含5mg 的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(3:1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点。

【检查】水分照水分测定法（附录ⅨH第二法）测定，不得过13.0％。

总灰分不得过5.0％（附录ⅨK）。

酸不溶性灰分不得过1.0％（附录IX K）。

【浸出物】照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法（附录X A）测定，用乙醇作溶剂，不得少于15.0％。

【含量测定】照高效液相色谱法（附录VI D）测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（45：55）为流动相；检测波长为274nm。

理论板数按丹皮酚峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备精密称取丹皮酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含20μg 的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理（功率300W，频率50kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。

精密量取续滤液1ml，量10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含丹皮酚（C9H10O3）不得少于1.2%。

【炮制】迅速洗净，润后切薄片，晒干。

【性味与归经】苦、辛，微寒。

归心、肝、肾经。

【功能与主治】清热凉血，活血化瘀。

用于温毒发斑，吐血衄血，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，痈肿疮毒，跌扑伤痛。

【用法与用量】 6 ～12g 。

【贮藏】置阴凉干燥处。

附录Ⅵ B.薄层色谱法附录Ⅵ B. 薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。

1.仪器与材料（1）薄层板市售薄层板市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF<[254]>薄层板、聚酰胺薄膜等。

自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。

最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小一般要求直径为10～40μm，加水或用梭甲基纤维素钠水溶液（0.2%~0.5%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。

使用涂布应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。

（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。

（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或有双槽展开缸，展开时须能密闭，水平展开用专用的水平展开缸。

（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出，浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。

（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。

（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。

2.操作方法(1) 薄层板制备市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。

聚酰胺薄膜不需活化。

铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。

如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。

自制薄层板除另有规定外，将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2~0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。

使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。

(2) 点样除另有规定外,在洁净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10~15mm，高效板一般基线离底边8~10mm。

圆点状直径一般不大于3mm，高效板一般大于3mm；接触点样时注意勿损伤薄层表面。

条带状宽度一般为5~10mm。

高效板条带宽度一般为4~8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。

点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。

(3) 展开将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。

除另有规定外，一般上行展开8～15cm,高效薄层板上展开5~8cm。

溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。

展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15~30分钟。

溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。

如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。

必要时，可进行二次展开或双向展开。

(4)显色与检视供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在日光下检视。

有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱。

对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。

（5）记录薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。

也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。

3.系统适用性试验按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整，应达到规定的检测灵敏度、分离度和重复性要求。

（1）检测灵敏度用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。

（2）分离度用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。

用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离（R）的计算公式为：R=2（d2-d1）/(W1+W2)式中d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。

除另有规定外，分离度应大于1.0。

（3）重复性同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；需显色后测定的相对标准偏差应不大于5.0%。

4.测定法（1）鉴别取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。

（2）限度检查采用定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。

供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，峰面积不得大于对照品的峰面积值。

必要时应规定检查的斑点数和限量值。

（3）含量测定照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。

3.薄层色谱扫描法系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查或含量测定。

测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。

除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板。

扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。

如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。

薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的最在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样，展开，扫描，测定和计算。

薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正多项式回归计算。

供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。

扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。