虎红平板凝集实验Word版
(完整版)动物免疫抗体血清学检测技术
2019.5.10
内容
一、血清学检测的意义 二、血清学检测内容和方法 三、血凝和血凝抑制实验 四、酶联免疫吸附实验 五、虎红平板凝集实验（初筛）
一、血清学检测的意义
动物免疫接种已经成为目前防御疫病传播的首选措施，只有给动 物进行有效的免疫接种后，才能产生一定的保护力，从而防止疫 病的侵入和蔓延。因此在群体接种疫苗前后对抗体水平进行检测， 准确了解动物疫病发生、传播和流行情况，掌握畜禽免疫抗体水 平和动物疫病保护情况， 从而更有效地采取综合防控措施。因此， 做好动物免疫抗体检测工作有着十分重要的临床意义和经济意义。
血凝素（HA） 柱状
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验：
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或 其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，也称血凝抑 制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验 (HI) 。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。 目的：检测有无病毒感染和免疫状态。
注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。 加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易 导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。
ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下 几点：
（1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜 在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读 结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细 阅读说明书。
血凝试验操作步骤
4个100%血凝单位（即4HA100） 抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4
布氏菌病虎红平板凝集试验抗原 新兽药证书
布氏菌病虎红平板凝集试验抗原新兽药证书一、概述布氏菌病是一种由布氏菌引起的家畜和野生动物传染病，也可传染给人类。
布氏菌病的传播对动物养殖业和食品安全造成了严重威胁，因此对布氏菌进行有效的检测和防控至关重要。
其中，虎红平板凝集试验是一种常用的血清学检测方法，对布氏菌病的诊断具有重要意义。
二、布氏菌病虎红平板凝集试验抗原1. 抗原来源布氏菌病虎红平板凝集试验抗原主要来源于已知含有布氏菌的动物血清，如牛、羊、猪等。
这些血清样本需要通过严格的筛选和处理，以确保抗原的纯度和稳定性。
2. 制备方法虎红平板凝集试验抗原的制备需要严格按照相关技术规范进行操作。
首先需要从携带布氏菌的动物中提取血清样本，然后通过离心、超滤等手段去除杂质和细菌。
经过适当的稀释和加工处理，最终得到用于虎红平板凝集试验的抗原制剂。
3. 抗原质量控制为了确保抗原的稳定性和活性，需要对抗原制剂进行严格的质量控制。
包括对抗原的存储条件、保存期限、抗原效价等指标进行监测和管理，以确保虎红平板凝集试验的准确性和可靠性。
三、新兽药证书1. 申请流程布氏菌病虎红平板凝集试验抗原作为兽药的一种，需要获得新兽药证书才能在市场上合法销售和使用。
申请新兽药证书需要遵循相关政策和法规，提交包括临床试验报告、生产工艺流程、质量控制方案等材料，并经过相关部门的审批和认证。
2. 证书标注一旦获得新兽药证书，抗原制剂需要在包装、说明书等相关资料上标注证书编号、有效期限等信息。
这些信息对药品的合法性和可追溯性具有重要意义，也为用户提供了使用保障。
3. 证书更新新兽药证书的有效期通常较短，一旦过期就需要重新申请并通过审批，获得更新证书。
抗原生产企业需要及时关注证书的有效期限，提前做好证书更新工作，以保障产品的合法生产和销售。
四、结论布氏菌病虎红平板凝集试验抗原的制备和管理对于布氏菌病的检测和防控具有重要意义。
严格控制抗原的质量和规范生产流程、及时申请和更新新兽药证书，是保障抗原生产质量和市场合法的关键步骤。
布鲁氏菌病虎红平板凝集试验的影响因素及注意事项
布鲁氏菌病虎红平板凝集试验的影响因素及注意事项作者：刘坤洋来源：《新农业》2020年第10期摘要：本文对布鲁氏菌病虎红平板凝集试验中的影响因素及应注意的事项进行了较全面的分析和总结，以提高试验的准确性，为本病的进一步确诊和疫情分析提供科学依据。
关键词：布鲁氏菌病;虎红平板凝集试验;影响因素;注意事项目前，布鲁氏菌抗体检测仍是我国布病诊断最常用、最主要的检测方法。
其中虎红平板凝集试验（RBPT）具有试验试剂成本低廉、操作简便、快速、检出率高等优势，被广泛应用于布病的大规模筛查，同时由于本方法不需要特殊的试验设备，更适于基层实验室和现场试验。
现将RBPT中的影响检测结果的因素及应注意的问题进行简要分析。
1 RBPT的影响因素1.1 RBPT抗原RBPT抗原的质量是影响布病血清学试验结果准确性的关键性因素之一，不同厂家的抗原对同一批血清样本的检测结果存在不同程度的差异，如果RBPT的假阳性率过高，不仅造成工作量加大，也会造成不必要的经济损失。
1.2 血清血清质量也是影响布病血清学试验结果准确性的重要因素之一，而采集的时间与分离方式直接影响血清的质量。
用于RBPT的血清最好是新鲜、清亮透明、无溶血、防止细菌污染，并且避免反复冻融。
纤维蛋白原能与虎红抗原产生非特异性凝集反应，而且纤维蛋白原含量越高凝集反应发生的越快、越强。
因此，如果待检血清中含有纤维蛋白原也会出现RBPT假阳性结果，严重影响检测结果的准确性。
1.3 温度试验时，RBPT抗原与被检样品的温度、环境温度对试验结果的准确性也有很大影响。
RBPT用的抗原需要恢复至室温（22±4℃），并且使用前要充分混合均匀。
血清与温度和时间成反比关系，放置血清的时间越短，温度越低，假阳性率越高。
由此可见，在一定温度范围内，温度越高，血清学反应进行的越快。
本试验要求在室温下进行，因此，在试验前要注意觀察环境温度是否适合进行本试验。
1.4 药物血清中的药物浓度也会干扰检测结果的准确性，在经过治疗后或治疗期间血清凝集不明显。
动物布鲁氏菌病诊断技术GB
动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18646—20021 范围本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。
本标准规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。
本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。
2 虎红平板凝集试验2.1 材料准备2.1.1 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。
2.1.2 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。
2.1.3 洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。
2.1.4 吸管或分装器，适于滴加0.03mL。
2.1.5 牙签或火柴杆，供搅拌用。
2.2 操作方法2.2.1 将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03mL。
2.2.2 在受检血清旁滴加抗原0.03mL。
2.2.3 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。
2.2.4 每次试验应设阴、阳性血清对照。
2.3 判定2.3.1 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。
2.3.2 受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(—)。
3 乳牛布病全乳环状试验3.1 材料准备3.1.1 布病全乳环状抗原由制标单位提供，按说明书使用。
3.1.2 乳样3.1.2.1 受检乳样须为新鲜的全乳。
3.1.2.2 采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。
3.1.2.3 采集的乳样夏季时应于当日内检查；保存于2℃时，7d内仍可使用。
3.2 操作方法3.2.1 取乳样lml，加于灭菌凝集试验管内。
3.2.2 取充分振荡混合均匀的全乳环状抗原1滴(约50ul)加人乳样中充分混匀。
3.2.3 置37℃一38℃水浴中60min。
3.2.4 加温后取出试管勿使振荡，立即进行判定。
布鲁氏菌抗体检测原始记录
嘉祥县疾病预防控制中心
布鲁氏菌抗体检测原始记录
编号：JXCDC /JL-146 共页第页
样品编号样品种类血清
检测项目布鲁氏菌抗体检测检测依据布病诊断标准附录WS 269-2007 试剂厂家试剂批号
设备名称生物安全柜、电热恒温培养箱试剂效期
一、虎红平板凝集试验（RBPT）：
取0.03ml被检血清，滴于洁净玻片上，然后加入虎红平板抗原0.03ml，混匀，在5分钟内判断结果。
二、试管凝集试验（SAT）：
1、取被检血清0.08ml加入第一管0.92ml的生理盐水内，混匀后，取0.5ml加入第二管中（含0.5ml生理盐水）作1:1稀释，以后各管以此类推，后一管弃去0.5ml。
血清稀释度依次为1:12.5，1:25，1:50，1:100，1:200，1:400，1:800。
2将稀释10倍的布氏菌菌液分别加入各血清管管内，每管加入0.5ml，混匀。
放37℃温箱中22小时观察结果。
最后血清的稀释度为1:25，1:50，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600。
3.菌液凝集程度的判断与同时配制的比浊管透明程度为参照，比浊管的配制方法见表1。
三、布鲁氏菌抗体检测结果：
样品编号姓名RBPT SAT滴度：1:25 1:50 1:100 1:200
检测起至时间年月日时至月日时
检测人：复核人：。
布鲁氏菌虎红平板凝集试验
布鲁氏菌虎红平板凝集试验
检验方法：依据GB/T18646-2002
1、材料准备
1.1 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。
1.2受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。
1.3洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。
1.4吸管或分装器，适于滴加0.03 ml。
1.5牙签或火柴杆，供搅拌用。
1.6观察结果照明用光源
2、操作方法
2.1 将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03ml。
2.2 在受检血清旁滴加抗原0.03ml。
2.3 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。
2.4 每次试验应设阴、阳性血清对照。
3、判定
3.1 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。
3.2 受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（-）。
附：
阴性对照：
阳性对照：
品控中心
2013-4-22
操作流程图
为了便于观
察结果，辅
以光源照明。
32.14.1-布病检测原始记录
成都市新都区疾病预防控制中心布病检测原始记录一、初筛方法：虎红平板凝集试验(RBPT)1.1操作：在玻片上加0.03mL被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03mL，摇匀或用牙签混匀，在5min内判定结果。
1.2结果判定：判定凝集程度(－至＋＋＋＋)同平板凝集反应亦可只分为(＋)阳性，(－)阴性两类。
二、确证实验：试管凝集试验(SAT)2.1操作方法：被检血清的稀释：在一般情况下，每份血清用5支小试管(口径8～10mm)，第一管加入2.3mL 石碳酸生理盐水，第二试管不加，第三、四、五管各加0.5mL，用1mL吸管吸取被检血清0.2mL，加入第一管中，混匀。
混匀后，以该吸管吸取第一管中血清加入第二管和第三管各0.5mL，再从第一管吸出0.5mL 丢弃，剩1mL。
以该吸管将第三管混匀，并吸取0.5mL加入第四管，混匀。
再从第四管吸取0.5mL，加入第五管，混匀，吸取0.5mL，弃去。
如此稀释后，从第二管到第五管血清稀释度分别为1∶12.5，1∶25，1∶50和1∶100。
加入抗原：先以0.5％石碳酸生理盐水将抗原原液作适当稀释(一般是作1∶10稀释)。
稀释后的抗原加入各稀释的血清管(第一管不加，作为血清对照)，每管加0.5mL，混匀。
加入抗原后，每管总量1mL，血清稀释度从第二管至第五管分别为1∶25，1∶50，1∶100和1∶200。
对照：阴性血清对照，血清稀释后加抗原(与被检血清对照相似)。
阳性血清对照，其血清稀释到原有滴度，再加抗原，抗原对照，适当稀释的抗原加石碳酸盐水。
判定比浊管制备：每次试验须配制比浊管作为判定的依据。
配制方法是：取本次试验用的抗原稀释液5～10mL，加入等量的0.5％碳酸盐水作倍比稀释。
全部试验管，对照管及比浊管充分振荡后置37℃温箱中20～22h，取出后放室温2h，然后以比浊管为标准判定结果。
2.2记录结果：根据各管中上层液体的清亮度记录结果。
特别是50％清亮度(＋＋)对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。
虎红平板凝集实验
虎红平板凝集试验（RBPT）检测布鲁氏菌病的原理和方法由于培养的营养条件苛刻而且时间长，所以病的诊断以血清学诊断为主。
其原理主要是根据相应抗原抗体可以在体外发生特异性结合并呈现可见反应，用已知抗原(或抗体)检测体液中未知的抗体(或抗原)。
虎红平板（RBPT）灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于群体布鲁氏菌病的普查。
在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。
检测布鲁氏菌病所用的虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体用虎红染料染色后，悬浮于乳酸缓冲液中制备而成。
试验原理：虎红平板凝集试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。
由于所用的抗原是酸性（）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性、检查的抗体是IgG类，因此提高了反应的特异性。
虎红平板凝集试验具体方法如下：一、材料准备1、虎红平板凝集抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。
2、被检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。
3、洁净的玻片或玻璃板，其上划分成4cm2的方格。
4、吸管或移液器，适于滴加液体。
5、牙签、混合棒或火柴杆，供搅拌用。
二、操作方法1、实验前，应将血清和抗原在室温放置30-60min。
2、将玻璃板上各格标记被检血清号，然后加相应被检血清。
3、在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原。
4、用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在5分钟内观察结果。
5、每次试验应设阴性血清、阳性血清对照。
三、结果判定1、在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。
2、受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(-)。
四、方法评价1、虎红平板凝集试验检测布鲁氏菌病，方法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检疫；2、该方法敏感性较好，检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。
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虎红平板凝集试验（RBPT）检测布鲁氏菌病的原理和方法由于布鲁氏菌培养的营养条件苛刻而且时间长，所以布鲁氏菌病的诊断以血清学诊断为主。
其原理主要是根据相应抗原抗体可以在体外发生特异性结合并呈现可见反应，用已知抗原(或抗体)检测体液中未知的抗体(或抗原)。
虎红平板凝集试验（RBPT）灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于群体布鲁氏菌病的普查。
在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。
检测布鲁氏菌病所用的虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体用虎红染料染色后，悬浮于乳酸缓冲液中制备而成。
试验原理：虎红平板凝集试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。
由于所用的抗原是酸性（PH3.6-3.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性、检查的抗体是IgG类，因此提高了反应的特异性。
虎红平板凝集试验具体方法如下：
一、材料准备
1、虎红平板凝集抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。
2、被检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。
3、洁净的玻片或玻璃板，其上划分成4cm2的方格。
4、吸管或移液器，适于滴加0.03mL液体。
5、牙签、混合棒或火柴杆，供搅拌用。
二、操作方法
1、实验前，应将血清和抗原在室温放置30-60min。
2、将玻璃板上各格标记被检血清号，然后加相应被检血清0.03mL。
3、在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原0.03mL。
4、用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在5分钟内观察结果。
5、每次试验应设阴性血清、阳性血清对照。
三、结果判定
1、在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。
2、受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(-)。
四、方法评价
1、虎红平板凝集试验检测布鲁氏菌病，方法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检疫；
2、该方法敏感性较好，检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。
3、因为在酸性环境下IgM活性受抑，该法主要是检查IgG类凝集抗体，所以特异性较好，与补体结合试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白试验有较高的吻合率。
4、该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备抗原应予以检查、标化方可应用。