固定化多聚核苷酸磷酸化酶聚合生产poly Ⅰ和poly C的研究
双链RNA的免疫调节作用及聚肌胞抗病毒应用进展
双链RNA的免疫调节作用及聚肌胞抗病毒应用进展李毅;金一;孙伦泉;汪明【摘要】双链RNA(dsRNA)被细胞上的识别受体TLR3和胞浆内的RIG-I/MDA5等识别后,通过下游信号途径.激活NF-κB和IRF-3等转录因子,对机体的先天免疫进行调节.聚肌胞(Poly I:C)是一种人工合成的dsRNA,作为天然存在的dsRNA的拟似物,具有良好的免疫增强作用.将Poly I:C用于抗病毒的研究是目前抗病毒药物研发的热点之一.本文就dsRNA对机体非特异性免疫的调节及Poly I:C抗病毒应用的进展做一综述.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2011(032)004【总页数】4页(P335-336,后插1-后插2)【关键词】聚肌胞;免疫调节;抗病毒;TLR3;RIG-I/MAD5【作者】李毅;金一;孙伦泉;汪明【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京,100193;中国农业大学动物医学院,北京,100193;University,of,Technology,Sydney,Sydney,Australia;中国农业大学动物医学院,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】R978.7病毒，特别是RNA病毒，侵入机体细胞后形成双链RNA(dsRNA)，能够被机体内的各种dsRNA受体识别，并通过不同的信号途径诱导机体和细胞产生I型干扰素、各种炎性因子和促炎因子，激活巨噬细胞、树突状细胞(DCs)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)等多种免疫效应细胞，使机体产生抗病毒和抗肿瘤的效果。
聚肌胞(Poly I∶C)是一种人工合成的dsRNA，具有dsRNA的结构特性，目前Poly I∶C作为天然dsRNA的拟似物被广泛的用于各种研究，特别是抗病毒和抗肿瘤的研究中。
本文将就dsRNA诱导机体非特异性免疫调节及利用Poly I∶C抗病毒的最新应用做一综述。
1 dsRNA刺激机体产生非特异免疫的信号通路细胞膜表面和胞浆中有多种识别受体能够识别dsRNA，因此，dsRNA在细胞内能够通过不同细胞信号途径激活机体的非特异性免疫。
一种改进的多聚腺苷酸化位点提取方法
一种改进的多聚腺苷酸化位点提取方法作者：张洋子来源：《电脑知识与技术》2018年第19期摘要：多聚腺苷酸化是真核生物基因表达的重要步骤。
多聚腺苷酸化位点（Poly（A）位点）标识基因末端，准确识别poly（A）位點有利于确定成熟的mRNA。
如果一个基因含有多个poly（A）位点，通过不同poly（A）位点的选择可以产生不同性质的mRNA（Alternative Polyadenylation， APA）。
全基因组3’末端测序技术产生了大量包含poly（A）位点信息的序列，如何从这些序列中快速有效地获取poly（A）位点成为生物学家关注的焦点。
本文针对3’末端测序数据，通过Perl脚本和生物信息软件的综合利用，设计了poly（A）位点的全基因组提取流程，可有效提取poly（A）位点并对其进行注释，该方法优势是适用于多种物种，适用性广，且运行高效。
关键词：Poly（A）位点；3’末端测序技术；提取流程中图分类号：TP311 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2018）19-0287-011 研究背景和现状多聚腺苷酸化（Polyadenylation）是把一段多聚A尾巴加到mRNA上的机制，多聚腺苷酸化位点（Poly（A）位点）标识基因末端，mRNA分子于它们的5’末端进行加帽，3’端中断，加上一段多聚A尾巴，加尾过程由多聚腺苷酸聚合酶催化进行，进而形成成熟的mRNA。
如果一个基因含有多个poly（A）位点，通过不同poly（A）位点的选择可以产生不同性质的mRNA（Alternative Polyadenylation， APA）。
APA通过改变mRNA的3’UTR的长度及其性质进而改变位于3’末端的许多潜在顺式调控模式，从而达到调控基因表达的目的。
虽然当前已获得许多物种的poly（A）位点信息，但还有多种物种的poly（A）位点信息尚未提取，一方面Poly（A）位点提取的准确性受测序方法和测序深度影响，另一方面poly （A）位点提取过程没有流程化处理，较为烦琐。
酶固定化技术的最新研究进展
西安工程大学学报J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y第38卷第1期(总185期)2024年2月V o l .38,N o .1(S u m.N o .185)引文格式:潘虹,陆天炆,王晓军,等.酶固定化技术的最新研究进展[J ].西安工程大学学报,2024,38(1):83-91.P A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o j u n ,e t a l .R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y [J ].J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,2024,38(1):83-91. 收稿日期:2023-08-06 修回日期:2023-10-21基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2021J Q -672㊁2022J Q -117);陕西省教育厅专项科研计划项目(22J K 0399) 通信作者:潘虹(1988 ),女,讲师,博士,研究方向为固定化酶和多孔水凝胶㊂E -m a i l :441595837@q q.c o m 酶固定化技术的最新研究进展潘 虹,陆天炆,王晓军,洪一楠(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048)摘要 酶作为一种催化性能好且安全可靠的生物催化剂,在食品㊁医药及环境治理等诸多领域得到了广泛应用,但因受限于游离酶较差的环境稳定性而难以实现进一步的工业化应用㊂酶固定化技术有助于提高游离酶对敏感环境的耐受性和操作过程中的稳定性,大大缩减了应用成本㊂回顾了近五年内固定化技术的发展及现状,总结了吸附法㊁结合法等传统固定化方法,共固定化酶法等新型固定化方法,以及天然材料载体㊁复合材料载体和纳米载体等不同固定化载体在各个领域的研究进展㊂相比于游离酶,固定化酶体系在稳定性和重复使用性等方面得到了显著提升,但同时也存在一些不足,如固定后的活性回收率降低㊁载体合成途径繁琐且成本较高以及固定化酶作用机理尚不完善等㊂结合这些不足之处提出了酶固定化技术在未来的发展方向㊂关键词 酶固定化;固定化载体;固定化方法;纳米载体;共固定开放科学(资源服务)标识码(O S I D )中图分类号:Q 814.2 文献标志码:AD O I :10.13338/j .i s s n .1674-649x .2024.01.011R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yP A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o ju n ,H O N G Y i n a n (S c h o o l o f E n v i r o n m e n t a l a n d C h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,X i a n 710048,C h i n a )A b s t r a c t A s a n e f f i c i e n t a n d s a f e b i o c a t a l y s t ,e n z y m e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d i n m a n yf i e l d s s u c h a s f o o d ,m e d i c i n e a n d e n v i r o n m e n t a lg o v e r n a n c e ,b u t i t i s d i f f i c u l t t o r e a l i z e f u r th e ri n d u s t r i a l a p-p l i c a t i o n d u e t o t h e p o o r e n v i r o n m e n t a l s t a b i l i t y o f f r e e e n z y m e s .E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h -n o l o g y h e l p s t o i m p r o v e t h e t o l e r a n c e o f f r e e e n z y m e s t o s e n s i t i v e e n v i r o n m e n t s a n d t h e s t a b i l i t yd u r i n g o pe r a t i o n ,a n d g r e a t l y r e d u c e s t h e a p p l i c a t i o n c o s t .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e d e v e l o pm e n t a n d c u r r e n t s i t u a t i o n o f i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yi n t h e p a s t f i v e y e a r s ,a n d s u mm a r i z e s t h e r e -s e a r c h p r o g r e s s o f d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s(i n c l u d i n g t r a d i t i o n a l i mm o b i l i z a t i o n m e t h-o d s s u c h a s a d s o r p t i o n m e t h o d a n d b i n d i n g m e t h o d a n d n e w i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s s u c h a s c o-i mm o b i l i z a t i o n e n z y m e m e t h o d)a n d i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s(i n c l u d i n g n a t u r a l m a t e r i a l c a r r i e r s, c o m p o s i t e c a r r i e r s a n d n a n o c a r r i e r s)i n v a r i o u s f i e l d s.I n g e n e r a l,c o m p a r e d w i t h f r e e e n z y m e s, t h e i mm o b i l i z e d e n z y m e s y s t e m h a s b e e n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d i n t e r m s o f s t a b i l i t y a n d r e u s-a b i l i t y.H o w e v e r,t h e r e a r e s o m e s h o r t c o m i n g s,s u c h a s l o w e r r e c o v e r y r a t e a f t e r i mm o b i l i z a-t i o n,c u m b e r s o m e a n d c o s t l y c a r r i e r s y n t h e s i s p a t h w a y,a n d i m p e r f e c t m e c h a n i s m o f i mm o b i l i z a-t i o n e n z y m e.F i n a l l y,t h e d e v e l o p m e n t d i r e c t i o n o f t h e t e c h n o l o g y i n t h e f u t u r e w a s p u t f o r w a r d b a s e d o n t h e s e s h o r t c o m i n g s.K e y w o r d s e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n;i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s;i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d;n a n o c a r r i-e r s;c o-i mm o b i l i z a t i o n0引言生物酶是一类具有催化效率高㊁专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质㊂因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]㊂活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]㊂由此,固定化酶的思想被首次提出㊂随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点㊂酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]㊂经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对p H㊁温度㊁重金属离子等影响因素的耐受性㊂同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]㊂目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]㊁生物传感器[8]㊁纺织印染废水处理[9-10]㊁生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展㊂本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用㊂1酶固定化方法酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法㊂表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法㊂表1固定化酶所用固定化方法T a b.1I mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s u s e d i n d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s固定化方法固定化对象载体材料参考文献传统固定化方法吸附法漆酶/α-淀粉酶生物炭/复合晶凝胶[12-13]共价结合法脂肪酶M I L-53(F e)/球形S i O2[14-15]化学交联法漆酶/葡萄糖淀粉酶磁性纳米粒/纳米S i O2[16-19]包埋法漆酶海藻酸铜微球[20]新型固定化方法吸附-交联法脂肪酶/β-葡糖糖苷酶大孔树脂/纳米S i O2[21-22]吸附-包埋法多种酶/纤维素酶多孔淀粉-阿拉伯胶微囊体/仿生S i O2[23-24]交联-包埋法漆酶聚集体介孔S i O2[25]脂肪酶/磷脂酶聚乙烯亚胺[26]共固定法葡萄糖淀粉酶/葡萄糖氧化酶S i O2[27]葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶磁性聚乙二醇微凝胶颗粒[28]1.1传统固定化方法1.1.1吸附法吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键㊁疏水作用和范德华力等相互作用48西安工程大学学报第38卷使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]㊂WA N G等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-M B)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-M B对MG 表现出最大吸附量757.58m g/g,固定化漆酶A/l a c @A-M B对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]㊂A C E T等以沸石颗粒(P P A)为原料,通过简单方法制备了C u2+-A P P a C包埋型复合晶凝胶(C u2+-A P P a C)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7m g/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]㊂1.1.2结合法结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]㊂G H A S E M I等将M I L-53(F e)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和p H值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]㊂此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]㊂F A N等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(C R L),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]㊂但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力㊂1.1.3化学交联法交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(E D C)㊁二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等㊂C H E N等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶F e3O4@S i O2-N H2-L a c,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂㊁金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]㊂Q I U等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]㊂然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响㊂例如,O U Y A N G等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法 京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]㊂与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色㊁安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业㊂D A N I E L L I等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃(D F F)将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]㊂使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,D F F表现出更低的生物毒性㊂1.1.4包埋法包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]㊂这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散㊂但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降㊂例如,L A T I F等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]㊂相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的p H㊁温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%㊂1.2新型固定化方法1.2.1传统固定化方法的改进传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法㊂常见的包括吸附-交联法[21-22]㊁吸附-包埋法[23-24]㊁交联-包埋法[25]等㊂例如,F A T H A L I等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-C L E A)[25]㊂相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和p H稳定性㊂此外E-C L E A存储21d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%㊂对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]㊂1.2.2共固定化酶法共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法㊂A R A N A-P EÑA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]㊂与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势㊂在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于58第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤㊂G A O等制备了一种化学酶级联反应体系(G A&G O x@A u-S i O2),实现葡萄糖淀粉酶(G A)和葡萄糖氧化酶(G O x)共固定化[27]㊂借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸㊂在保证了固定化双酶稳定性的同时,A u的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率㊂类似地,L I U等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定G O x和辣根过氧化物酶(H R P),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]㊂此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用㊂但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]㊂L O U等基于MO F s膜实现了漆酶和介体A B T S的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]㊂2酶固定化载体用于酶固定化的载体主要包括天然载体㊁人工合成载体和纳米载体,见表2㊂在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等㊂表2固定化酶所用载体材料T a b.2 C a r r i e r s f o r i mm o b i l i z e d e n z y m e材料类别载体材料固定化对象固定化方法参考文献天然材料羧甲基纤维素漆酶包埋法[38]琼脂糖脂肪酶吸附法[39]磁性壳聚糖葡萄糖氧化酶共价结合法[40]藻酸盐脱氢酶/蛋白酶吸附法/包埋法[41-42]壳聚糖-黏土复合微球漆酶+介体包埋法[43]海藻酸钠-壳聚糖中性蛋白酶包埋法[44]人工合成材料改性二氧化硅乳酸脱氢酶/碳酸酐酶/甲酸脱氢酶化学交联法/共价结合法[45-47]二氧化钛漆酶吸附法[48]硅酸盐漆酶/葡萄糖氧化酶吸附-共价结合法/吸附法[49-50]氧化铝漆酶共价结合法[51]聚酰胺-胺树枝状大分子脂肪酶化学交联法[52]聚乙烯醇水凝胶-硅胶烯还原酶包埋法[53]二氧化硅-壳聚糖漆酶共价结合法[54]纳米材料磁性纳米粒子漆酶共价结合法[55]金属有机框架MO F s漆酶化学交联法[56]介孔Z I F-8过氧化物酶化学交联法[57]中空微球漆酶吸附法[58]共价有机框架C O F葡萄糖氧化酶+F e3O4吸附法[59]金属酚醛网络M P N酒精脱氢酶吸附法[60]磁性纳米颗粒漆酶+介体A B T S吸附法[61]2.1天然载体材料天然载体最大的优点就是来源广泛㊁低成本和低生物毒性㊂常用的天然载体有纤维素[38]㊁琼脂糖[39]㊁壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等㊂同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力㊂M E H A N D I A[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(C C B-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定㊂微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏㊂同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(P B R S),对纺织废水的脱色率可达78%,C O D㊁B O D以及毒性水平均下降㊂类似地, B A I等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]㊂固定化酶在较宽的p H(5~8)和温度(30~80ħ)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平㊂68西安工程大学学报第38卷2.2人工合成载体材料2.2.1无机材料无机材料来源广泛㊁合成简单㊁机械强度高,可以直接用于酶的固定㊂常见的无机材料有二氧化硅[45]㊁二氧化钛[48]㊁硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等㊂为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化㊂Z H A I等使用聚乙烯亚胺(P E I)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于C O2酶促转化甲酸盐㊂优化后P D A/P E I-S i O2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍㊂再通过固定化碳酸酐酶(C A)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]㊂随后,L I U等同样对S i O2微球进行P E I的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了C O2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]㊂2.2.2高分子材料人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能㊂如聚酰胺㊁聚乙烯醇等具有良好的固定化能力㊂Z H A O等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(P AMAM)接枝到F e3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的F e3O4@S i O2/P AMAM磁性纳米载体[52]㊂固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的p H和温度范围内的耐受性㊂A L A GÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(E R),再固定到氨基官能化的硅胶上㊂包埋后的E R比游离E R的热稳定性高34.4倍㊂在重复使用10次后,固定后的E R仍保持其初始活性的85%[53]㊂2.2.3复合材料针对有机㊁无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体㊂例如,G I R E L L I等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度㊁热稳定性及生物相容性㊂存储30d后仍具有大于70%的相对活性㊂对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和p H范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]㊂2.3纳米材料载体纳米材料凭借其小尺寸㊁高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点㊂各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展㊂2.3.1磁性纳米载体磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料㊂凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出㊂F e3O4是被广泛使用的一种磁性材料㊂但由于纯F e3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化㊂R A N等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体F e3O4@M o S2@P E I 用于漆酶固定㊂在二硫化钼(M o S2)和聚乙烯亚胺(P E I)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120m g/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]㊂2.3.2介孔纳米载体介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体㊂金属有机框架(MO F s)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用㊂L I等采用水热法合成氨基官能化的MO F材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]㊂L U等以酵母为生物模板,将Z I F-8自组装到酵母上得到杂合Y@ Z I F-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@Z I F-8 @t-C A T㊂固定化酶的温度㊁p H耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45d后活性仍保持在99%以上[57]㊂除此以外,T A N G等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-C O F-OM e)[58]㊂这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果㊂2.3.3金属纳米载体金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用㊂F U等将F e3+/F e2+固定到纳米花形的共价有机框架(C O F)中实现了固定化酶的磁分离[59]㊂L I 等研究了以磁性F e3O4为核,将单宁酸(T A)与不同类型金属离子(C u㊁F e㊁Z n㊁M n㊁A u)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(M P N)涂层[60]㊂不同金属离子的不同极化能力对M P N涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率㊁催化活性78第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展和稳定性带来影响㊂对于漆酶而言,引入C u2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]㊂3结论与展望生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解㊁食品加工㊁生物传感器等诸多领域得到了广泛应用㊂酶固定化技术促使酶在较宽的p H值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性㊂但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足㊂1)酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低㊂可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活㊂同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究㊂2)目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面㊂在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术㊂3)酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战㊂同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费㊂如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战㊂因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s)[1]刘茹,焦成瑾,杨玲娟,等.酶固定化研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(5):1861-1869.L I U R,J I A O C J,Y A N G L J,e t a l.A d v a n c e s o f e n-z y m e i mm o b i l i z a t i o n[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t y&Q u a l i t y,2021,12(5):1861-1869.(i n C h i n e s e)[2] L I U D M,D O N G C.R e c e n t a d v a n c e s i n n a n o-c a r r i e ri mm o b i l i z e d e n z y m e s a n d t h e i r a p p l i c a t i o n s[J].P r o c e s sB i o c h e m i s t r y,2020,92:464-475.[3] MA G H R A B Y Y R,E L-S HA B A S Y R M,I B R A H I M AH,e t a l.E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g i e s a n d i n-d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s[J].A C S O me g a,2023,8(6):5184-5196.[4]贾峰,郑连炳,王志强.生物酶固定化技术研究现状[J].资源节约与环保,2020(4):116.J I A F,Z H E N G L B,WA N G Z Q.R e s e a r c h s t a t u s o fb i o l o g ic a l e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y[J].R e-s o u r c e s E c o n o m i z a t i o n&E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n, 2020(4):116.(i n C h i n e s e)[5] L U J W,N I E M F,L I Y R,e t a l.D e s i g n o f c o m p o s i t en a n o s u p p o r t s a n d a p p l i c a t i o n s t h e r e o f i n e n z y m e i m-m o b i l i z a t i o n:A r e v i e w[J].C o l l o i d s a n d S u r f a c e s B:B i o i n t e r f a c e s,2022,217:112602.[6] Z HA N G W,Z HA N G Z,J I L R,e t a l.L a c c a s e i mm o b i-l i z e d o n n a n o c o m p o s i t e s f o r w a s t e w a t e r p o l l u t a n t s d e g-r a d a t i o n:C u r r e n t s t a t u s a n d f u t u r e p r o s p e c t s[J].B i o-p r o c e s s a n d B i o s y s t e m s E n g i n e e r i n g,2023,46(11): 1513-1531.[7] B A C K E S E,K A T O C G,C O R RÊA R C G,e t a l.L a c-c a s e s i n f o od p r o ce s s i n g:C u r r e n t s t a t u s,b o t t l e n e c k sa n d p e r s p e c t i v e s[J].T r e n d s i n F o o d S c i e n c e&T e c h-n o l o g y,2021,115:445-460.[8] K A D A M A A,S A R A T A L E G D,G H O D A K E G S,e t a l.R e c e n t a d v a n c e s i n t h e d e v e l o p m e n t o f l a c c a s e-b a s e d b i o-s e n s o r s v i a n a n o-i m m o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s[J].C h e m o s e n-s o r s,2022,10(2):58.[9] Y A V A S E R R,K A R A GÖZ L E R A A.L a c c a s e i mm o b i-l i z e d p o l y a c r y l a m i d e-a l g i n a t e c r y o g e l:A c a n d i d a t e f o r t r e a t m e n t o f e f f l u e n t s[J].P r o c e s s B i o c h e m i s t r y,2021, 101:137-146.[10]MA O G T,WA N G K,WA N G F Y,e t a l.A n e n g i-n e e r e d t h e r m o s t a b l e l a c c a s e w i t h g r e a t a b i l i t y t o d e-c o l o r i z e a nd de t o x if y m a l a c h i t eg r e e n[J].I n t e r n a t i o n-a l J o u r n a l o f M o l e c u l a r S c i e n c e s,2021,22(21):11755.[11] S HA R MA A,J A I N K K,S R I V A S T A V A A,e t a l.P o t e n t i a l o f i n s i t u S S F l a c c a s e p r o d u c e d f r o m G a n o-d e r m a l u c i d u m R C K2011i n b i o b l e a c h i n g o f p a p e rp u l p[J].B i o p r o c e s s a n d B i o s y s t e m s E n g i n e e r i n g,2019,42(3):367-377.[12]WA N G Z B,R E N D J,Z HA N G X Q,e t a l.A d s o r p-t i o n-d e g r a d a t i o n o f m a l a c h i t e g r e e n u s i n g a l k a l i-m o d-i f i e d b i o c h a r i mm o b i l i z e d l a c c a s e u n d e r m u l t i-m e t h-o d s[J].A d v a n c e d P o w d e r T e c h n o l o g y,2022,33(11):103821.88西安工程大学学报第38卷[13] A C E TÖ,I N A N A N T,A C E T BÖ,e t a l.α-a m y l a s ei mm o b i l i z e d c o m p o s i t e c r y o g e l s:S o m e s t u d i e s o n k i-n e t i c a n d a d s o r p t i o n f a c t o r s[J].A p p l i e d B i o c h e m i s t r ya n d B i o t e c h n o l o g y,2021,193(8):2483-2496.[14] G HA S E M I S,Y O U S E F I M,N I K S E R E S H T A,e t a l.C o v a l e n t b i n d i n g a n d i n s i t u i mm o b i l i z a t i o n o f l i p a s e so n a f l e x i b l e n a n o p o r o u s m a t e r i a l[J].P r o c e s s B i o-c h e m i s t r y,2021,102:92-101.[15] F A N X L,Z HA N G P B,F A N M M,e t a l.E f f e c t o fg l u t a r a l d e h y d e m u l t i p o i n t c o v a l e n t t r e a t m e n t s o n i m-m o b i l i z e d l i p a s e f o r h y d r o l y s i s o f a c i d i f i e d o i l[J].A p-p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y,2023,195(11):6942-6958.[16] C H E N Z H,Y A O J,M A B,e t a l.A r o b u s t b i o c a t a l y s tb a s e d o n l ac c a s e i m m o b i l i z ed s u pe r p a r a m a g n e t i c F e3O4@S i O2-N H2n a n o p a r t i c l e s a n d i t s a p p l i c a t i o n f o r d e g r a-d a t i o n o f c h l o r o p he n o l s[J].C h e m o s p h e r e,2022,291:132727.[17] Q I U X,WA N G Y,X U E Y,e t a l.L a c c a s e i mm o b i l i z e do n m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s m o d i f i e d b y a m i n o-f u n c-t i o n a l i z e d i o n i c l i q u i d v i a d i a l d e h y d e s t a r c h f o r p h e-n o l i c c o m p o u n d s b i o d e g r a d a t i o n[J].C h e m i c a l E n g i-n e e r i n g J o u r n a l,2020,391:123564.[18] O U Y A N G J,P U S J,WA N G J Z,e t a l.E n z y m a t i c h y-d r o l y s a te ofg e n i p o s i d e d i r e c t l y a c t s a s c r o s s-l i n k i n ga g e n t f o r e n z y m e i mm ob i l i z a t i o n[J].P r oc e s s B i o-c h e m i s t r y,2020,99:187-195.[19] D A N I E L L I C,V A N L A N G E N L,B O E S D,e t a l.2,5-F u r a n d i c a r b o x a l d e h y d e a s a b i o-b a s e d c r o s s l i n k i n g a-g e n t r e p l a c i n g g l u t a r a l d e h y d e f o r c o v a l e n t e n z y m ei mm o b i l i z a t i o n[J].R S C A d v a n c e s,2022,12(55):35676-35684.[20] L A T I F A,MA Q B O O L A,S U N K,e t a l.I mm o b i l i z a-t i o n o f t r a m e t e s v e r s i c o l o r l a c c a s e o n C u-a l g i n a t eb e a d s f o r b i oc a t a l y t i cde g r a d a t i o n of b i s p h e n o l A i nw a t e r:O p t i m i z e d i mm o b i l i z a t i o n,d e g r a d a t i o n a n dt o x i c i t y a s s e s s m e n t[J].J o u r n a l o f E n v i r o n m e n t a lC h e m i c a l E n g i n e e r i n g,2022,10(1):107089.[21] N U R A L I Y A H A,P E R D A N I M S,P U T R I D N,e t a l.E f f e c t o f a d d i t i o n a l a m i n o g r o u p t o i m p r o v e t h e p e r f o r m-a n c e o f i m m ob i l i z e d l i p a s e f r o m a s p e r g i l l u s N i g e r b y a d-s o r p t i o n-c r o s s l i n k i n g m e t h o d[J].F r o n t i e r s i n E n e r g yR e s e a r c h,2021,9:616945.[22] N A S E E R S,O U Y A N G J,C H E N X,e t a l.I mm o b i-l i z a t i o n o fβ-g l u c o s i d a s e b y s e l f-c a t a l y s i s a n d c o m-p a r e d t o c r o s s l i n k i n g w i t h g l u t a r a l d e h y d e[J].I n t e r-n a t i o n a l J o u r n a l o f B i o l o g i c a l M a c r o m o l e c u l e s,2020,154:1490-1495.[23] Z HA N G Z W,Z HA O F,M E N G Y L,e t a l.M i c r o e n-c a p s u l a t i o n o f t h e e n z y m e b r e a k e r b yd o u b l e-l a ye re m b e d d i n g m e t h o d[J].S P E J o u r n a l,2023,28(2):908-916.[24] L OM B A R D I V,T R A N D E M,B A C K M,e t a l.F a c i l ec e l l u l a s e i mm o b i l i s a t i o n o n b i o i n s p i r ed s i l i c a[J].N a n o m a t e r i a l s,2022,12(4):626.[25] F A T H A L I Z,R E Z A E I S,A L I F A R A M A R Z I M,e t a l.C a t a l y t i c p h e n o l r e m o v a l u s i n g e n t r a p p e d c r o s s-l i n k e dl a c c a s e a g g r e g a t e s[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f B i o l o g i c a lM a c r o m o l e c u l e s,2019,122:359-366.[26] A R A N A-P E N A S,R I O S N S,M E N D E Z-S A N C H E ZC,e t a l.C o i mm o b i l i z a t i o n o f d i f f e r e n t l i p a s e s:S i m p l el a y e r b y l a y e r e n z y m e s p a t i a l o r d e r i n g[J].I n t e r n a-t i o n a l J o u r n a l o f B i o l o g i c a l M a c r o m o l e c u l e s,2020,145:856-864.[27] G A O J,WA N G Z F,G U O R R,e t a l.E f f i c i e n t c a s-c ade c o n v e r s i o n of s t a r c h t og l u c o n i c a c i d b y a ch e-m o e n z y m a t i c s y s t e m w i t h c o-i mm o b i l i z e d A u n a n o p-a r t i c l e s a n d e n z y m e s[J].C a t a l y s i s S c i e n c e&T e c h-n o l o g y,2023,13(4):991-999.[28] L I U Z Y,Z HA N G Z,HU A N G C Q,e t a l.I R780-d o pe d c o b a l tf e r r i t e n a n o p a r t i c l e s@p o l y(e t h y l e n eg l y c o l)m i c r o g e l s a s d u a l-e n z y m e i mm o b i l i z e d m i c r o-s y s t e m s:P r e p a r a t i o n s,p h o t o t h e r m a l-r e s p o n s i v e d u a l-e n z y m e r e l e a s e,a n d h i g h l y ef f i c i e n t r e c y c l i n g[J].J o u r n a l o f C o l l o i d a n d I n t e r f a c e S c i e n c e,2023,644:81-94.[29] L I A N G S,WU X L,X I O N G J,e t a l.M e t a l-o r g a n i cf r a m e w o r k s a s n o v e l m a t r i c e s f o r e f f i c i e n t e n z y m ei mm o b i l i z a t i o n:A n u p d a t e r e v i e w[J].C o o r d i n a t i o nC h e m i s t r y R e v i e w s,2020,406:213149.[30]杨月珠,李章良,吕源财,等.漆酶的固定化技术及固定化漆酶载体材料研究进展[J].净水技术,2022,41(9):8-17.Y A N G Y Z,L I Z L,LÜY C,e t a l.R e s e a r c h p r o g r e s s o f l a c c a s e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y a n d i mm o b i l i z e dl a c c a s e c a r r i e r m a t e r i a l s[J].W a t e r P u r i f i c a t i o n T e c h-n o l o g y,2022,41(9):8-17.(i n C h i n e s e) [31]张璟譞,高兵兵,何冰芳.生物催化中的酶固定化研究进展[J].生物加工过程,2022,20(1):9-19.Z HA N G J X,G A O B B,H E B F.R e s e a r c h p r o g r e s s o f e n z y m e i mm o b i l i z e d i n b i o c a t a l y s i s[J].C h i n e s eJ o u r n a l o f B i o p r o c e s s E n g i n e e r i n g,2022,20(1):9-19.98第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展(i n C h i n e s e)[32] Q I A O W C,Z HA N G Z Y,Q I A N Y,e t a l.B a c t e r i a ll a c c a s e i mm o b i l i z e d o n a m a g n e t i c d i a l d e h y d e c e l l u-l o s e w i t h o u t c r o s s-l i n k i n g a g e n t s f o r d e c o l o r i z a t i o n[J].C o l l o i d s a n d S u r f a c e s A:P h y s i c o c h e m i c a l a n dE n g i n e e r i n g A s p e c t s,2022,632:127818.[33] Y A N G X Y,C H E N Y F,Y A O S,e t a l.P r e p a r a t i o n o fi mm o b i l i z e d l i p a s e o n m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s d i a l d e-h y d e s t a r c h[J].C a r b o h y d r a t e P o l y m e r s,2019,218:324-332.[34] MO S T A R A D D I S,P A Z HA N G M,E B A D I-N A HA R IM,e t a l.T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e c r o s s-l i n k e r o nc h i t o s a n-c o a t ed m a g ne t i c n a n o p a r t i c l e s a n d t h e p r o p-e r t i e s of i mm o b i l i z e d p a p a i n[J].M o l e c u l a r B i o t e c h-n o l o g y,2023,65(11):1809-1823.[35]冉帆凡,李露.S B A-15固定化酶的研究进展[J].食品研究与开发,2022,43(20):206-212.R A N F F,L I L.I mm o b i l i z e d e n z y m e o n S B A-15[J].F o o d R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t,2022,43(20):206-212.(i n C h i n e s e)[36] L I U R T,WA N G S L,HA N M Y,e t a l.C o-i mm o b i-l i z a t i o n o f e l e c t r o n m e d i a t o r a n d l a c c a s e o n t o d i a l d e-h y d e s t a r c h c r o s s-l i n k e d m a g n e t i c c h i t o s a n n a n o m a-t e r i a l s f o r o r g a n i c p o l l u t a n t s'r e m o v a l[J].B i o p r o c e s sa n d B i o s y s t e m s E n g i n e e r i n g,2022,45(12):1955-1966.[37] L O U X X,Z H I F K,S U N X Y,e t a l.C o n s t r u c t i o n o fc o-i mm o b i l i z ed l a c c a se a n d m e d i a t o r b a s e d o n MO F sm e m b r a n e f o r e n h a n c i n g o r g a n i c p o l l u t a n t s r e m o v a l[J].C h e m i c a l E n g i n e e r i n g J o u r n a l,2023,451:138080.[38] Z HA O Z,R E N D J,Z HU A N G M J,e t a l.D e g r a d a t i o no f2,4-D C P b y t h e i mm o b i l i z e d l a c c a s e o n t h e c a r r i e ro f s o d i u m a l g i n a t e-s o d i u m c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e[J].B i o p r o c e s s a n d B i o s y s t e m s E n g i n e e r i n g,2022,45(10):1739-1751.[39] S IÓD M I A K T,D U L E B A J,H A R A L D S S O N G G,e t a l.T h e s t u d i e s o f s e p h a r o s e-i m m o b i l i z e d l i p a s e s:C o m b i n i n gt e c h n i q u e s f o r t h e e n h a n c e m e n t o f a c t i v i t y a n d t h e r m a ls t a b i l i t y[J].C a t a l y s t s,2023,13(5):887. [40]Y E O N K M,Y O U J,A D H I K A R I M D,e t a l.E n-z y m e-i mm o b i l i z e d c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e s a s e n v i r o n-m e n t a l l y f r i e n d l y a n d h i g h l y e f f e c t i v e a n t i m i c r o b i a l a-g e n t s[J].B i o m a c r o m o l e c u l e s,2019,20(7):2477-2485.[41] K U R A Y A M A F,M O H A MM E D B A H A D U R N,F U-R U S A W A T,e t a l.F a c i l e p r e p a r a t i o n o f a m i n o s i l a n e-a l-g i n a t e h y b r i d b e a d s f o r e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n:K i n e t i c sa n d e q u i l ib r i u m s t u d i e s[J].I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f B i o-l o g i c a l M a c r o m o l e c u l e s,2020,150:1203-1212. [42] N I N A V A N E S S A W D,L A U R E T T E B L A N D I N E MK,J O N G N E.I n c l u s i o n o f p a r t l y p u r i f i e d p r o t e a s ef r o m A b r u s p r e c a t o r i u s L i n n i n C a-a lg i n a t e g e l b e a d s[J].H e l i y o n,2022,8(11):e11791.[43]M E HA N D I A S,A HMA D S,S HA R MA S C,e t a l.D e c o l o r i z a t i o n a n d d e t o x i f i c a t i o n o f t e x t i l e e f f l u e n t b yi mm o b i l i z e d l a c c a s e-A C S i n t o c h i t o s a n-c l a y c o m p o s-i t e b e a d s u s i n g a p a c k e d b e d r e a c t o r s y s t e m:A n e c o-f r i e n d l y a p p r o a c h[J].J o u r n a l o f W a t e r P r o c e s s E ng i-n e e r i n g,2022,47:102662.[44] B A I Y,WU W.T h e n e u t r a l p r o t e a s e i mm o b i l i z a t i o n:P h y s i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f s o d i u m a l g i n a t e-c h i t o s a ng e l b e a d s[J].A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o-g y,2022,194(5):2269-2283.[45] A L A GÖZ D,T O P R A K A,V A R A N N E,e t a l.E f f e c-t i v e i mm o b i l i z a t i o n o f l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e o n t om e s o p o r o u s s i l i c a[J].B i o t e c h n o l o g y a n d A p p l i e d B i o-c h e m i s t r y,2022,69(6):2550-2560.[46] Z HA I T T,WA N G C H,G U F J,e t a l.D o p a m i n e/p o l y e t h y l e n i m i n e-m o d i f i e d s i l i c a f o r e n z y m e i mm o b i-l i z a t i o n a n d s t r e n g t h e n i n g o f e n z y m a t i cC O2c o n v e r s i o n[J].A C S S u s t a i n a b l e C h e m i s t r y&E n g i n e e r i n g,2020,8(40):15250-15257.[47] L I U G H,C H E N H X,Z HA O H,e t a l.A c c e l e r a t i n ge l e c t r o e n z y m a t i c C O2r e d u c t i o n b y i mm o b i l i z i n gf o r-m a t e d e h y d r o g e n a s e o n p o l y e t h y l e n i m i n e-m o d i f i e dm e s o p o r o u s s i l i c a[J].A C S S u s t a i n a b l e C h e m i s t r y&E n g i n e e r i n g,2022,10(1):633-644.[48] I S A N A P O N G J,L OHAW E T K,K UMN O R K A E WP.O p t i m i z a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f i mm o b i l i z e dl a c c a s e o n t i t a n i u m d i o x i d e n a n o s t r u c t u r e a n d i t s a p-p l i c a t i o n i n r e m o v a l o f R e m a z o l B r i l l i a n t B l u e R[J].B i o c a t a l y s i s a n d A g r i c u l t u r a l B i o t e c h n o l o g y,2021,37:102186.[49] WA N G Z B,R E N D J,C H E N G Y H,e t a l.I mm o b i-l i z a t i o n o f l a c c a s e o n c h i t o s a n f u n c t i o n a l i z e d h a l l o y s-i t e n a n o t u b e s f o r d e g r a d a t i o n o f B i s p h e n o l A i n a q u e-o u s s o l u t i o n:D e g r a d a t i o n m e c h a n i s m a n d m i n e r a l i z a-t i o n p a t h w a y[J].H e l i y o n,2022,8(7):e09919.[50]Y A O H Q,X I A O R Q,T I A N Y,e t a l.S w i t c h a b l eb i o e l ec t r o c a t a l y s i s o f g l u c o s e o x id a se i mm o b i l i z e d i n-t o m u l t i l a y e r s w i t h l a m e l l a r n a n o p a r t i c l e s o f a m i n o-09西安工程大学学报第38卷。
多核苷酸磷酸化酶 大肠杆菌表达
多核苷酸磷酸化酶大肠杆菌表达多核苷酸磷酸化酶（Polymerase chain reaction，PCR）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因工程、医学诊断、法医学等领域。
大肠杆菌是一种常用的表达宿主，其表达系统能够高效地表达多核苷酸磷酸化酶。
多核苷酸磷酸化酶是一种酶类蛋白，具有在体外合成DNA的能力。
它能够通过扩增DNA的特定片段，使其从原始的微生物DNA样本中增加到足够多的数量，以便于后续分析。
PCR技术的核心原理是通过反复进行DNA的复制，将目标DNA片段扩增成数百万个拷贝。
PCR技术的关键在于多核苷酸磷酸化酶的作用。
大肠杆菌是一种常见的细菌，其表达系统能够高效地表达多核苷酸磷酸化酶。
在PCR 反应中，首先需要将待扩增的DNA样本与特定的引物混合，引物是一种能够特异性结合目标DNA序列的短小DNA片段。
然后将混合物加入PCR反应体系中，其中包含多核苷酸磷酸化酶、DNA核苷酸和缓冲液等成分。
通过一系列的温度循环，PCR反应可以迅速扩增出目标DNA片段。
PCR反应的温度循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR反应体系加热至94-98摄氏度，使DNA双链解开成两条单链。
在退火步骤中，将反应体系降温至适宜的温度，使引物与目标DNA序列特异性结合。
在延伸步骤中，将反应体系加热至72摄氏度，使多核苷酸磷酸化酶在引物的指导下合成新的DNA链。
这个温度循环会反复进行数十次，每一轮循环都会使目标DNA序列的数量成倍增加。
大肠杆菌表达系统是一种常用的蛋白表达系统，其优点是易于操作、表达效率高、成本低廉。
多核苷酸磷酸化酶在大肠杆菌中的表达通常采用外源基因的方式，即将多核苷酸磷酸化酶基因导入大肠杆菌中，并在适当的表达载体上进行构建。
构建好的表达载体经过转化、筛选和培养等步骤，最终可得到高效表达的多核苷酸磷酸化酶。
多核苷酸磷酸化酶的表达量和纯度对PCR反应的结果有着重要影响。
因此，在大肠杆菌表达系统中，通常需要对表达条件进行优化，以获得高产量和高纯度的多核苷酸磷酸化酶。
(最新整理)PolyA(多聚腺苷酸)
(完整)PolyA(多聚腺苷酸)编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)PolyA(多聚腺苷酸)）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)PolyA(多聚腺苷酸)的全部内容。
PolyA（多聚腺苷酸）解释通常位于mRNA上的150-200个腺苷酸残基(又称为特殊的尾巴结构）。
多聚腺苷酸化是指多聚腺苷酸与信使RNA(mRNA）分子的共价链结。
在蛋白质生物合成的过程中，这是产生准备作翻译的成熟mRNA的方式的一部份。
在真核生物中,多聚腺苷酸化是一种机制，令mRNA分子于它们的3'端中断。
多聚腺苷酸尾（或聚A尾）保护mRNA，免受核酸外切酶攻击,并且对转录终结、将mRNA从细胞核输出及进行翻译都十分重要。
一些原核生物的mRNA都会被多聚腺苷酸化，但多聚腺苷酸尾的功能则与真核生物有所不同.当去氧核糖核酸（DNA）在细胞核内转录成核糖核酸(RNA）的过程中及完成后，多聚腺苷酸化就会出现.当转录停止后，mRNA链会由核酸外切酶及RNA聚合酶切开。
切开位点的附近有着AAUAAA序列。
当mRNA被切开后，会加入50-250个腺苷到切开位点的3’端上.这个反应是由多聚腺苷酸聚合酶。
多聚腺苷酸化过程1，切割及多聚腺苷酸化特异因子（CPSF)及切割活化因子（CstF)两个蛋白质复合物会开始与末端的RNA聚合酶Ⅱ结合。
2，当RNA聚合酶Ⅱ前进时经过多聚腺苷酸化信号序列的CPSF,及CstF转移至新的mRNA 前体，CPSF会与AAUAAA序列结合,而CstF会与其后3的GU序列或充满U的序列结合。
4，CPSF及CstF会在约AAUAAA序列后35个核苷启动切割.多聚腺苷酸聚合酶（PAP）会立即展开编写多聚腺苷酸尾.细胞核内的多聚腺苷酸结合蛋白（PABPN1)会立即与新的多聚腺苷酸序列结合。
一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法[发明专利]
![一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3556bdfd0408763231126edb6f1aff00bfd57045.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510465185.8(22)申请日 2015.07.31201510386673.X 2015.07.03 CNC12N 11/18(2006.01)C12N 11/08(2006.01)C12N 9/04(2006.01)C12N 9/02(2006.01)(71)申请人厦门大学地址361000 福建省厦门市思明南路４２２号(72)发明人王世珍 方柏山 张永辉 林鹏(74)专利代理机构厦门市首创君合专利事务所有限公司 35204代理人张松亭(54)发明名称一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法(57)摘要一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法，属于固定化酶技术领域，利用聚乙烯亚胺与金属离子配位固定甘油脱氢酶、辅酶氧化酶，以及甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶，在固定化过程中聚乙烯亚胺分子通过亚胺与金属离子的配位作用，形成网状的聚乙烯亚胺骨架，配位在聚乙烯亚胺上的金属离子与甘油脱氢酶、辅酶氧化酶的C 端组氨酸标签，以及甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的C 端组氨酸标签形成配位键，获得固定化多酶体系。
金属离子在固定化过程中起配位交联作用，并可提高多酶体系的催化效率。
本发明的优点在于多酶耦联效率高、制备条件温和、工艺简单易行。
所得固定化酶具有固定化率高，活性回收率高，能够明显提高温度稳定性、重复使用稳定性好等优点。
(66)本国优先权数据(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书10页序列表5页 附图5页CN 105063010 A 2015.11.18C N 105063010A1.一种聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)工程菌的构建：构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因、带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因，并利用上述两基因构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶基因，用BamHⅠ和xholⅠ分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌(DH5α)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达甘油脱氢酶、可表达辅酶氧化酶、可表达甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的工程菌；2)粗酶液制备：将步骤1)得到的工程菌接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，培养一段时间后加入诱导剂IPTG；培养所得发酵液离心获得细胞，配制成细胞液；超声破碎，将破碎液离心，收集上清液即为粗酶液；3)纯酶的制备：采用镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化并利用pH6.5～8.0的Tris-HCl缓冲液超滤除盐，得到甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶；4)聚乙烯亚胺-金属溶液制备：配置浓度为5～200mg/ml的聚乙烯亚胺溶液，向该溶液中加入金属盐溶液并使其终浓度为0.05～50mmol/L，配成混合溶液，4℃保温0.5～4h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/ L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的酶浓度为0.05mg/ml～10mg/ml的酶溶液以1～4:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，形成固定化颗粒，离心分离，冲洗，重悬于0.05M 的pH7.0的Tris-HCl缓冲液或0.05～0.1M的pH8.0～10.0的氨水-氯化铵缓冲液中，即得聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。
以级联反应为基础的多酶共固定载体研究进展
2023年6月张耀丹等：以级联反应为基础的多酶共固定载体研究进展苷酸如GMP 、胞嘧啶核苷酸（CMP ）和腺嘌呤核苷酸（AMP ）与金属离子共同构建了MOF 结构。
MOF 中的ZIF 可以作为固定酶的载体，Munirah 等[41]利用带有微通道的PDMS 模具，将聚多巴胺（PDA)/PEI 涂覆于聚丙烯膜上，随后ZIF-8与GOD 和HRP 共沉淀在PDA/PEI 涂层上进行固定。
Li 等[42]利用三磷酸腺苷（ATP ）与Zn 2+和咪唑-2-甲醛（2-ICA ）的竞争性反应，在温和条件下打开ZIF-90结构，将GOD 和HRP 包埋其中，同时也可以利用该竞争性反应分解ZIF-90结构，释放包埋在其中的GOD/HRP ，以此构建了“信号开启”模式的电化学免疫传感器，酶在该体系中对外部环境的耐受性增强，用作传感器时能够在4℃条件下储存4周，仍保留其原始电流响应值的78%。
为了有效抑制MOF 骨架中酶的损失，Song 等[43]设计DNA 支架，将GOD/HRP 与该支架共价结合，构成GOD/HRP-DNA ，再将其与咪唑分子筛骨架（ZIF-8）的前体混合，最终成功固定在ZIF-8中，固定过程见图3，DNA 支架遵循碱基配对原则，其特殊定位使酶催化效率得到较高提升，K cat /K m 测定结果为3.47L/(mol∙s)为游离酶的9.9倍。
此外，Liang 等[44]将GOD 、HRP 和乙酰胆碱酯酶（AChE ）包埋在ZIF-8中，使用共价有机框架材料（COF ）作为外壳，随后通过蚀刻将模板ZIF-8脱除，此时酶释放并与外壳形成空腔的多酶微胶囊。
COF 具有良好的稳定性，能够一定程度避免酶的损失，同时可调节的孔径能够对酶进行有效筛选，形成的微胶囊生物传感器测定葡萄糖浓度的下限为0.85 μmol/L 。
随机固定进行多酶共固定，常利用载体本身的性质如比表面积大小、功能团修饰等进行非共价结合，同时，也常将整体共价结合在不溶于水的载体材料上，该过程往往能同时固定多酶，减少了材料的消耗，减轻了微环境的改变对酶的影响，但随着酶数量的增多，随机固定需要考虑的因素也会随之增加以满足体系内所需固定的酶的性能需求，由此增加了材料构建的难度。
多酶共固定化技术在糖类催化中的研究进展
化工进展Chemical Industry and Engineering Progress2022年第41卷第5期多酶共固定化技术在糖类催化中的研究进展唐婷1，周文凤2，王志1，朱晨杰2，许敬亮1，庄伟2，应汉杰2，欧阳平凯2（1郑州大学化工学院，生物+联合研究中心，河南郑州450002；2南京工业大学生物与制药工程学院，国家生化工程技术研究中心，江苏南京211816）摘要：糖类的催化反应对人体生命活动和工业生产具有重要意义。
近年来，多酶共固定化技术迅速发展，为糖类的催化反应提供了一个绿色高效的研究工具。
本文结合糖类催化中的多酶级联反应，系统阐述了多酶共固定化的方法，包括传统方法和新型方法，并指出了其各自的原理和优缺点。
在此基础上，详细介绍了多酶共固定化技术在糖类催化中的应用，如淀粉的水解、纤维素的利用以及功能性糖的合成等，结果表明多酶共固定化技术不仅具有高效催化、稳定性强、易于分离等特性，而且能够充分发挥多酶之间协同催化的优势，极大地促进了糖类催化反应的进行。
最后分析了多酶共固定化技术目前存在的问题与挑战，提出了一些解决问题的研究思路和方法，并展望了其发展前景。
关键词：多酶共固定化；糖类催化；级联反应；协同效应中图分类号：Q814.2文献标志码：A文章编号：1000-6613（2022）05-2636-13Advances of multienzymes co -immobilization technology for sugarcatalysisTANG Ting 1，ZHOU Wenfeng 2，WANG Zhi 1，ZHU Chenjie 2，XU Jingliang 1，ZHUANG Wei 2，YING Hanjie 2，OUYANG Pingkai 2(1Biology+Joint Research Centre,Department of Chemical Technology,Zhengzhou University,Zhengzhou 450002,Henan,China;2National Engineering Research Center for Biotechnology,College of Biotechnology and PharmaceuticalEngineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,Jiangsu,China)Abstract:Apparently,the catalytic reaction of sugar is of great significance to human life activities andindustrial production.In recent years,the rapid development of the multienzymes co -immobilization technology provides a green and efficient research tool for the catalytic reaction of sugar.Under this background,combined with the multienzymes cascade reaction in sugar catalysis,this paper systematicallyexpounds the traditional and new methods of multienzymes co -immobilization,and illustrates its respective principles and advantages as well as disadvantages.On this basis,this paper further introduces the wide applications of multienzymes co -immobilization technology in sugar catalysis in detail,such asstarch hydrolysis,cellulose utilization and functional sugar synthesis.In accordance with the related research results,it is indicated that the multienzymes co -immobilization technology not only has a series综述与专论DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2021-0983收稿日期：2021-05-10；修改稿日期：2021-06-22。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
。
尝 畴 % 联 如 半
P NP
添加 少量 C
u “
可大大
,
提高 M 计是 t C 果
[
,
’。
n 什
的 激 活效 果
n 杆
,
使 转 化率 提 高
,
估
0 2 4 石 8
,
`十
与 M
共 同作 用 抑 制 杂酶 的结
小
( 见图
2 )
时
。
/
一
`
。
图1
聚 合反 应时 间 曲 线
联 如 念 牢 狄 铸
一 一
n 2z甘 o
舟 ǎ 月 卜 U 了
由图 可 见 化 率有 所 下 降
2
.
聚 合 反 应 控制 在 6 ~
8 小时 为好
,
超 过 8 小时
,
因该 酶 催化可 逆反 应而 使转
。
3
二 价金 属 离子 的 影 响
P N Pa
s e
在 催 化 过 程 中需 金 属 离子
M g“ 离 子 激 活 于 反应 中
,
Mg
杆
: i 什 激 活 M 可替 . t f a s e
邱树 毅等
」
:
固定化 多聚核普酸 碑酸化 晦聚合生产 p o !
L
和P o
C 的研 究
7
.
2 2 p
o
分子 里 测定
和
.
1
.
.
产 品 紫 外吸 收 值 的 测 定
p
o
:
将
L一
’
C
产 品 溶 解 在含 0
,
.
1 m
o
一 ’
a
LC I
,
0
.
o o 5M
Mg C I 的 0
,
:
.
006m
o
l
P (
。
H7
) 0
,
所得
产 品 达 到 或超 过 标 准 样 品
2 .
4 .
1
产 品 的 分子 最 测 定
, 。 ,
多 聚 核 昔 酸 分 子 量 越 大 则 诱 导 产 生 干 扰素 的效 果 越好 按 前述方 法 对 产 品 的分 子量 进行 测 定
可见
所 得 结 果见 表二
,
。
用 固定化
PN P
。
s a
e
制 备的
1 On
E
.
.
Co l i
的酶液
.
,
经 硫酸 按 沉 淀
15%
,
DE A E
一
纤 维素 层 析 精制。: Nhomakorabea含量
ID P
:
’
叼
I D P 含量 7 8
:
、
标 准样 品
江 门 日化 厂 提 供 的 工 厂 合格 产 品
,’
。
1 1 1 1
.
2
.
方法
1
.
.
2 2
.
酶 的 固定 化 方 法 酶 活 力测 定方 法
.
.
2
,’
.
2
3
0
聚 合 物 转 化率 测定 方法
5 m l反应液 2
,
:
取
加入 l ml l o % 的高 氯 酸 沉 淀 1 0 分钟
.
,
在3o 00
r
p m
5 分钟 下 离心 1
,
取
0
.
1 ml
上 清 液加 入 4
9 m l
蒸馏 水
,
测
As Z o
值
,
计算 求 出转 化率
。
黔
,
:
转化 率一互 应立
T Q 464
.
6
前
,
言
po l y l
和
po l y C
是 诱 导 产 生 干 扰 素 的 高 效 诱 导 剂 具 有 广 谱 的抗 病 毒 抑 制 肿瘤 细 胞
。 , 。 ,
。
、
生 长 增 强 机 体 免 疫 能 力 等 多 种 功 能 临 床 试 用 对 某 些 疾 病有 一 定 疗效 需 要 量 日益 增 加
用 粗 酶 液进 行 聚 合反 应 时
,
加 入 尿素 可 以 提 高多 核 昔 酸的 产 率
,
,
本研 究观 察 了尿 素
对 固 定化
P NP
a s e
聚 合反 应 的 影 响
其结 果 见 表 一
。
表1 序号
1 2
尿素 与 ℃ D P 聚 合 转化 率 的 关 系
C D P 聚 合转 化 率
4 9 53
第2 3 卷
1994
第 期
12
贵
J
R NO AL
州
F G OIZ
工
学
院
T E
学
报
N
Vo l 23 L GO Y O U
e
-
N 1994
O
年
月
INO ST IT
F T O E
U
固 定 化 多 聚 核 昔 酸 磷 酸 化 酶 聚 合 生 产
p
o
ly l 和 p
邱树毅
o
ly
`
的 研 究
郭 勇
,
彭志 英
贵( 州 工 学院 轻 工 来
淦 僵 箭悲墙 弃鲤
全
又 ` 0 0%
p
o
ly l 聚 肌芬
e
.
p o ly
C 聚 胞芬 l
PN P a s CDP
.
多聚 核 替 酸 碑 酸 化 晦
ID P 分 别 为胞 替 二 磷 酸 和 次 黄 苍 二 碑 酸
1 99 4一 0 7一 25收
稿
;
1 99 4一 0 9一 26审改 回
第6 期
磷 酸 缓 冲液 中
稀 释 至 适 当浓 度
,
测 定 不 同 波 长 下的 吸 收值
作 出吸 收
曲线
2
2 . 1
结果与讨论
聚合 反应 的 时间 曲 线
以
3 0拌 m o l 1
。
:
/ m l 的 c D D 为底 物
,
,
酶用 量
0
.
5克 ( 湿 重 )
/ml
,
观 察 聚 合 反 应 的过 程
,
所
得结 果 见 图
( 南 理 工 大 学食 品 表 华
摘
要
对 固定 化
N
,
s a
e
聚 合 生 产 多核 普 酸 的 工 艺 条 件 了探 讨
。
并 对所 得 产
品 的 性 质进 行 了 . l 定 m
所得 产品 符合 要 求
;
关键 词
固定化
;
多 聚 核 普 酸磷 酸 化 晦
.
聚合反 应
中 图法分 类 号
T Q 4 60 34
`
~ 、
z
。
一一 口 一口
△一△
o
: :
3 0拜m
o
o
le Mn
什
+
4拜m
o
e 一 e
u +
7 0 拼m
o
le M g +
,
卜
爵
6
8
一
.
o
:
3 0拼m
:
l M 一, 什
:
反 应 来统
2
CDP
1 5 0拼 m
o
le
,
固 定化 酶
图2
二价 金属 离子 的 影响
59
(湿 重 )
2~
s e
3
、
尿 素 对聚 合 反应 的 影 响
po l y l
和
p o l y C
,
分 子 量 均 达 到 或 超 过 标 准 样 所得
,
聚 合物 分 子均 符 合标 准
表
2
p
o
ly l
和
p o ly C
的分 子 里 测定
(c m )
八 ù 哎 曰 d t ù ) 9 C
.
序号
样品 标 准样 品
p o ly
嗅 酚 蓝 移 动距
(e m )
样 品 移 动距离 首端
,
.
尿 素 印 m o l/ m l)
0
(% )
7
.
280
,
1
可见
加 入 尿 素 可 提高 聚 合 反 应 的转化 率
但效 果不 很 明 显
。
贵
. 4
州
工
学
院
学
才 反
99 4 1 年
产 品 的性 质
p o l y l
。
对 所 聚 合 的产 品
和 P y C 的性 质进 行 了 测 定 o l
,
并 与标 准样 品 进行 比 较
前文
`二 「
报 导 了 用 聚 丙 烯 酞 胺 成 功 地 固定 化 多 核 昔 酸磷 酸 化酶
ly l 和
本 文 主 要 介 绍 用 固 定化 多
核 昔酸 磷 酸 化 酶 聚 合 生 产 o P 1
1
.
o P
ly C 产 品
。
材 料 与 方法
1
材料
P N Pa s CD P CDP
’
:
e
’
:
来 源于