(DNFB)水解蛋白注射液中游离氨基酸含量的测定及分析

17 种氨基酸对照品（ 批号 624 － 200104 ） 由中 国食品药品检定研究院提供； 水解蛋白注射液（ 生 产厂家 A： 样品编号 1，2，3，4； 生产厂家 B： 样品编号 5，6，7，8，9，10； 生产厂家 C： 样品编号 11，12，13） 均 由各生产厂家提供； 2，4 二硝基氟苯为分析纯，乙腈 为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2. 1 总氮量测定 精密量取样品 0. 2 mL 置自动 定氮仪消化管中，照 2005 年版中国药典二部的方法 测定。测定结果见表 1。
α － 氨基氮。测定结果见表 1。
2. 3 氨基酸含量测定 2. 3. 1 色谱条件 采用 Diamonsil C18 （ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） 色 谱 柱，柱 温 40 ℃ ，流 动 相 A 为 0. 05 mol·L － 1 醋酸钠溶液（ 含 1% N，N － 二甲基甲 酰胺，调 pH 为 6. 4） ，流动相 B 为乙腈 － 水（ 1 ∶ 1） ， 梯度洗脱 （ 表 2 ） ，流速 1. 0 mL · min － 1 ，检 测 波 长 360 nm，进样量 20 μL。
第一作者 Tel： （ 0371） 63388235； E － mail： lianying72@ 163． com
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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 1）
白注射液的质量提供依据。 1 仪器与材料
Buchi 339 型 全 自 动 定 氮 仪 （ 瑞 士 Buchi 公 司） ； Agilent 1100 型 高 效 液 相 色 谱 仪 （ 德 国 Agilent 公司） ； Mettler AG245 电子天平 （ 瑞士 Mettler 公司 ） ； Delta320 酸 度 计 （ 上 海 Mettler Toledo 公 司） 。
水解蛋白注射液系采用植物或动物蛋白为原 料，经酸、碱或酶水解，离子交换树脂纯化，再添加适 量氨基酸而制得的静脉营养用氨基酸溶液［1 ～ 3］。内 含各种 L － 氨基酸，其中包括必需氨基酸 8 种（ 异亮 氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色 氨酸、缬氨酸） 及各种非必需氨基酸，临床上用于手 术严重创伤、大面积烧伤引起的严重氨基酸缺乏，以 及各种疾病引起的低蛋白血症［1］。
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图 1 HPLC 色谱图 Fig 1 HPLC chromatograms of amino acid A． 辅料（ blank） B． 氨基酸对照品（ amino acid reference substances） C． 水解蛋白注射液（ protein hydrolysate injection）
2. 3. 5 线性关系考察 精 密 量 取 对 照 品 储 备 液 1. 0 ，3. 0 ，5. 0 ，7. 0 ，9. 0 mL，分 别 置 50 mL 量 瓶 中，加水稀 释 至 刻 度，摇 匀，按“2. 3. 3 ”项 下 方 法 衍生化，精 密 量 取 20 μL 注 入 液 相 色 谱 仪，记 录 色谱图。以 浓 度 为 横 坐 标，峰 面 积 为 纵 坐 标，进 行线性回归。各氨基酸线性方程和线性范围见 表 3。 2. 3. 6 重复性试验 取样品（ 样品编号 1） ，按照 “2. 3. 8”项下的方法，重复测定 6 次，计算 RSD，结
表 2 梯度洗脱时间表 Tab 2 Time table of gradient elution
时间（ time） / min
A－B
0
95∶ 5
15
80∶ 20
20
80∶ 20
22
60∶ 35
45
45∶ 55
60
0∶ 100
65
0∶ 100
68
95∶ 5
78
95∶ 5
2. 3. 2 溶液的制备 氨 基 酸 对 照 品 储 备 液： 取 17 种氨基酸对照品适量，精密称定，置 200 mL 量 瓶中，加水 溶 解 并 稀 释 至 刻 度，摇 匀，即 得； 氨 基 酸对照品溶液： 精密量取对照品储备液 5. 0 mL， 置 50 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻 度，摇 匀， 即得； 供试品溶液： 精密量取水解蛋白注射液 5. 0 mL，置 50 mL 量瓶 中，加 水 稀 释 至 刻 度，摇 匀，即 得。 2. 3. 3 衍生化方法 精密量取供试品溶液或对照 品溶液 1. 0 mL，置 25 mL 量瓶中，加 1% 2，4 － 二硝 基氟苯的乙腈溶液 0. 4 mL，0. 5 mol·L － 1 碳酸钠溶 液 1. 0 mL，60 ℃ 水浴，避光，衍生 60 min，取出放冷 至室温，加磷酸盐缓冲液（ pH 7. 0） 稀释至刻度，摇 匀，即得。 2. 3. 4 系统适用性试验 取水解蛋白辅料，按生 产处方配制溶液，照“2. 3. 3”项下方法衍生化，精密 量取 20 μL 注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析， 记录 色 谱 图，见 图 1。取 对 照 品 溶 液 1. 0 mL，按 “2. 3. 3”项下方法衍生化，精密量取 20 μL 注入液 相色谱仪，按上述色谱条件分析，记录色谱图，见图 1。17 种氨基酸均能得到良好分离，分离度均符合 规定。
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பைடு நூலகம்— 61 —
水解蛋白注射液中游离氨基酸含量的测定及分析
连莹，仲平
（ 河南省食品药品检验所，郑州 450003）
摘要 目的：建立二硝基氟苯（ DNFB） 柱前衍生化法测定水解蛋白注射液中游离氨基酸含量，并对水解蛋白注射液质量进行
分析。方法：采用 DNFB 为衍生化试剂进行衍生，色谱柱为 Diamonsil C18 （ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） ，流动相为 0. 05 mol·L － 1 醋酸钠溶液（ 含 1% N，N － 二甲基甲酰胺，调 pH 为 6. 4） 与 50% 乙腈水溶液，梯度洗脱，流速 1. 0 mL·min －1 ，检测波长 360
α － 氨基氮
（ total nitrogen） （ α － amino nitrogen）
A
1
0. 067
0. 056
2
0. 066
0. 058
3
0. 067
0. 058
4
0. 064
0. 060
B
5
0. 070
0. 057
6
0. 069
0. 056
7
0. 069
0. 057
8
0. 072
0. 067
nm。结果：各氨基酸的线性关系良好； 平均回收率（ n = 6） 为 98. 7% ～ 100. 8% ，RSD 为 0. 46% ～ 3. 3% 。结论：本研究建立了
水解蛋白注射液游离氨基酸测定方法，为质量标准中游离氨基酸含量测定限度的制定提供了依据。
关键词：水解蛋白注射液； 营养制剂； 氨基酸； 二硝基氟苯； 衍生化； 质量分析
中图分类号：R917
文献标识码：A
文章编号：0254 － 1793（2012）01 － 0061 － 06
Determination and evaluation of amino acids in protein hydrolysate injection
LIAN Ying，ZHONG Ping
（ Henan Provincial Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China）
果见表 3。 2. 3. 7 回收率试验 精密量取“2. 3. 6”项下样品 2. 5 mL，分别加入氨基酸储备液 1. 5，2. 5，3. 5 mL， 每个浓度配制 3 份溶液，分别衍生化。精密量取 20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面 积计算 17 种氨基酸的平均回收率（ n = 9） ，测定结 果见表 3。 2. 3. 8 样品测定 取各供试品溶液与 对 照 品 溶 液，分别衍生化，记录色谱图，按上述色谱条件测定， 按外标法以峰面积计算各氨基酸含量。样品中必需 氨基酸和总游离氨基酸含量见表 4，液相色谱图见 图 1。Tyr 在体内可由 Phe 转化而来，当膳食中 Tyr 充足时，可减少 Phe 的消耗，因此 Tyr 为半必需氨基 酸，在计算必需氨基酸组成时，可将 Tyr 与 Phe 合并 计算。 3 水解蛋白注射液营养价值评价 3. 1 测定方法的选择及 测 定 结 果 水 解 蛋 白 注 射液现行质量标准的含量测定为总氮量和 α － 氨 基氮测定，不能准确 地 反 映 样 品 中 氨 基 酸 的 真 实 含量。采用二硝基氟苯柱前衍生化法准确测定 了样品中游离氨基 酸 的 含 量，为 更 好 地 评 价 水 解 蛋白的质量提供了依据。由测定结果可知，13 批 样品中总氮量和氨 基 氮 均 符 合 标 准 规 定，但 必 需 氨基酸总量相差较大，总量最高的为样品 3 （ 含量 为 14. 90 mg· mL － 1 ） ，总 量 最 低 的 为 样 品 4 （ 含 量为 11. 49 mg·mL －1 ） 。 3. 2 必需氨基酸含量的差异 静 脉 营 养 用 氨 基 酸混合液应含有必需氨基 酸 与 非 必 需 氨 基 酸［6］， 其中必需氨基 酸 占 总 氨 基 酸 的 百 分 比 和 每 克 总 氮中必需氨基酸克数对营养疗效甚为重要。一 种优良的氨基酸混合液的必需氨基酸占总氨基 酸 的 百 分 比 应 不 低 于 40 ，每 克 总 氮 中 必 需 氨 基 酸 克 数 应 在 3 左 右［7］。 对 比 各 批 测 定 结 果 ，A 生产厂家有 3 批样品的必需氨基酸占总氨基酸 的量和总氮量均较高。而 C 生产厂家必需氨基 酸占总氨基酸的百分比和每克总氮中必需氨基 酸克 数 均 较 低。 各 批 次 样 品 之 间 质 量 差 异 较 大 ，同 一 生 产 厂 家 不 同 批 次 之 间 质 量 也 有 差 异 。 对 比 各 批 次 水 解 蛋 白 注 射 液 、复 方 氨 基 酸 注 射 液（ 18 AA、18 AA － Ⅰ ） ［8］ 以 及 人 乳 、鸡 蛋 蛋 白 、 国 外 各 种 氨 基 酸 注 射 液［9，10］，水 解 蛋 白 注 射 液 的必需氨基酸占总氨基酸的百分比和每克总氮 中必 需 氨 基 酸 克 数 均 相 对 较 低。 计 算 结 果 见 表 5。