亚硝态氮胁迫对草鱼非特异性免疫性能的影响
草鱼免疫应答对病毒病害的抵抗性研究
草鱼免疫应答对病毒病害的抵抗性研究草鱼是我国鱼类养殖业的重要品种之一，免疫应答是它们对抗病毒病害的重要手段。
研究草鱼免疫应答机理对于提高草鱼养殖的抗病性和生产水平具有重要作用。
本文将从草鱼免疫系统的基本构成、草鱼与病毒的相互作用、草鱼抗病免疫机理等方面进行探讨。
一、草鱼免疫系统的基本构成草鱼的免疫系统主要包括物理屏障、先天性免疫和适应性免疫三个部分。
物理屏障：草鱼身体表面有一层黏液膜，这种膜可以有效地阻止一些外来病原体的入侵，从而降低其感染的风险。
先天性免疫：草鱼的先天性免疫通过非特异性反应来抵御病原体，主要包括白细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、粘液和补体等。
适应性免疫：草鱼的适应性免疫包括细胞免疫和体液免疫两个方面。
细胞免疫包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，它们分别对应着细胞介导免疫和体液介导免疫。
草鱼的体液免疫主要由抗体和补体组成。
二、草鱼与病毒的相互作用病毒是草鱼养殖中最主要的病原体之一，它们通过侵入草鱼细胞来进行复制和繁殖，从而引发草鱼的感染和疾病。
草鱼与病毒的相互作用是一个复杂的过程，涉及到病毒与草鱼免疫系统之间的多个环节。
第一，病毒进入草鱼体内。
病毒进入草鱼体内的方式有多种，主要包括水生道、鳃、肠道、口、皮肤等。
其中，水生道是草鱼感染病毒的主要通道。
第二，病毒侵入草鱼细胞。
病毒侵入草鱼细胞后，病毒和草鱼的免疫系统之间就开始了激烈的相互作用。
病毒可以抑制草鱼的免疫反应，同时也可以激活草鱼的免疫反应。
第三，病毒复制和繁殖。
病毒复制和繁殖需要利用草鱼细胞内的生物机制，这也就是为什么病毒侵入草鱼细胞是非常重要的原因。
第四，病毒诱导草鱼免疫应答。
病毒诱导草鱼免疫应答的方式有多种，主要包括抗原呈递、内源性吞噬和负调节等。
三、草鱼抗病免疫机理草鱼的抗病免疫机理是一个复杂的过程，它包括多种免疫反应和免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、补体等。
B淋巴细胞：B淋巴细胞主要分泌抗体，包括IgM、IgD、IgT等。
草鱼鱼种养殖中的免疫研究进展
草鱼鱼种养殖中的免疫研究进展摘要通过对草鱼养殖研究典型试验和报道进行分析，用当代免疫理论和试验成果证明草鱼鱼种养殖中应引起重视的免疫措施和方法，分析了免疫途径、投饵、密度、拉网锻炼等措施对免疫力的影响，介绍了提高草鱼鱼种免疫力的新途径。
AbstractThrough analyzing the grass carp aquaculture research typical test and report，with contemporary immune theory and experimental results it′s proved that the measures and methods in the grass carp fish breeding should be pay attention，effects of the immunization route，bait casting，density，net exercise and other measures on immunity were analyzed，and new ways to increase the grass carp fish immunity were introduced.Key wordsgrass carp；fish breeding；immune research；breeding density；feed feeding amount；measures免疫是草鱼鱼种养殖中控制疾病的基础。
为此科研人员进行了大量的研究，得到了许多研究成果。
用现有的免疫研究成果对这些试验方法、过程和结果进行再分析，可以节省人力物力，并得到一些新的认识，可以为探索更好、更有效的鱼病防治办法提供参考。
1草鱼鱼种的免疫研究进展1.1免疫方法的研究何福林对草鱼的免疫方法进行了研究，从其得出的草鱼出血病、烂鳃病、肠炎病、赤皮病4组免疫结果来看，注射效果最好，对出血病的保护率为77.%~92.3%，烂鳃病为25.0%~90.0%，肠炎病为16.7%~63.3%，赤皮病为19.3%~57.7%。
亚硝态氮慢性胁迫对斑节对虾(非洲群体)行为、消化酶活力和非特异性免疫的影响
第53卷 第6期 2023年6月中国海洋大学学报P E R I O D I C A LO FO C E A N U N I V E R S I T YO FC H I N A53(6):043~049J u n e ,2023亚硝态氮慢性胁迫对斑节对虾(非洲群体)行为㊁消化酶活力和非特异性免疫的影响❋王友红1,王晓璐1,于晓清1,许 拉1,盖春蕾1,王淑娴1,刘洪军1,刁 菁1,叶海斌1,樊 英1❋❋,付壤辉2(1.山东省海洋科学研究院山东省海水养殖病害防治重点实验室,青岛市水产生物品质与利用工程研究中心,山东青岛266104;2.山东省友发水产有限公司,山东滨州251900)摘 要: 为探讨亚硝态氮(N O 2-N )慢性胁迫对斑节对虾(P e n a e u sm o n o d o n )(非洲群体,以下称金刚虾)生理特性的影响,本实验以体质量为(6.06ʃ0.76)g 的金刚虾为研究对象,测定不同N O 2-N 浓度下金刚虾的行为㊁非特异性免疫以及消化功能㊂研究显示,N O 2-N 浓度ɤ6m g /L 时,金刚虾的活力㊁摄食不受影响;N O 2-N 浓度ȡ8m g /L 时,金刚虾摄食缓慢㊁游动异常㊁胃肠道模糊;N O 2-N 浓度为14m g /L 时,金刚虾开始死亡㊂金刚虾肝胰腺中脂肪酶(L i p a s e )㊁胰蛋白酶(T r y ps i n )活性在N O 2-N 浓度为6m g /L 时达到最大值,之后开始下降,当N O 2-N 浓度升至14m g /L 时活性最低,与对照组差异显著㊂N O 2-N 浓度由0上升至14m g /L ,血淋巴谷胱甘肽(G S H )含量㊁酸性磷酸酶(A C P )活性呈 先升高后下降 的趋势,谷草转氨酶(G O T )㊁谷丙转氨酶(G P T )的活性则呈 先升高后下降再升高 的趋势,N O 2-N 浓度为6m g /L 时,G H S ㊁A C P 活性达到最大值;N O 2-N 浓度为14m g /L 时,G O T ㊁G P T 活性达到最大值,与对照组差异显著㊂综合以上结果,工厂化养殖金刚虾时,建议将水体中N O 2-N 浓度控制在6m g/L 以下㊂关键词: 斑节对虾(非洲群体);亚硝态氮;行为;非特异性免疫;消化酶中图法分类号: S 968.22 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2023)06-043-07D O I : 10.16441/j.c n k i .h d x b .20220200引用格式: 王友红,王晓璐,于晓清,等.亚硝态氮慢性胁迫对斑节对虾(非洲群体)行为㊁消化酶活力和非特异性免疫的影响[J ].中国海洋大学学报(自然科学版),2023,53(6):43-49.W a n g Y o u h o n g ,W a n g X i a o l u ,Y uX i a o q i n g ,e t a l .E f f e c t s o f c h r o n i c n i t r i t e s t r e s s o n b e h a v i o r ,d i g e s t i v e e n z ym e a c t i v i t i e s a n d n o n -s p e c i f i c i m m u n i t y o f a nA f r i c a n p o p u l a t i o n o f P e n a e u sm o n o d o n [J ].P e r i o d i c a l o f O c e a nU n i v e r s i t y o f C h i n a ,2023,53(6):43-49.❋ 基金项目:山东省虾蟹产业技术体系项目(S D A I T -13);国家虾蟹产业技术体系项目(C A R S -48)资助S u p p o r t e d b y t h eE a r m a r k e dF u n d f o r S h a n d o n g A g r i c u l t u r e I n n o v a t i o nT e a m (S D A I T -13);t h eE a r m a r k e dF u n d f o rC h i n aA gr i c u l -t u r eR e s e a r c hS ys t e m (C A R S -48)收稿日期:2022-04-08;修订日期:2022-08-24作者简介:王友红(1989 ),女,硕士生,研究方向:水生生物健康增养殖技术㊂E -m a i l :133********@163.c o m❋❋ 通讯作者:E -m a i l :f y _f y123@126.c o m 斑节对虾(P e n a e u sm o n o d o n )(非洲群体)又名金刚虾㊁黑虎虾,原产于莫桑比克,具有个体大㊁肉质鲜美㊁营养丰富㊁生长速度快㊁抗逆性强㊁经济价值高等优点[1-2],夏秋季节工厂化养殖金刚虾成本低㊁价格高㊁养殖周期短,能有效地利用闲置的工厂化养殖车间,因此金刚虾具有广泛的推广价值㊂夏季工厂化车间水温高㊁密度高㊁投饵料量大,高含氮排泄物和残饵在养殖环境中积累,超过水体微生态系统的自净能力,使水体中的亚硝态氮含量升高[3]㊂养殖过程中,对虾长时间受到亚硝态氮胁迫,摄食量减弱,造成空肠㊁空胃,严重时对虾停止摄食,游动活力减弱,最终导致死亡㊂有研究发现,亚硝态氮进入对虾血淋巴后,与血蓝蛋白结合,使血淋巴对氧的亲和性降低,最终造成了对虾的中毒或死亡[4-5];且长时间的胁迫会损坏对虾的组织器官[6-7],致使机体抗氧化系统和非特异性免疫系统功能下降,生理代谢紊乱,从而降低对虾的存活率和免疫功能[8-9]㊂金刚虾工厂化养殖模式发展的初步阶段,对养殖的基础理论知识研究较少,充分了解养殖水质对金刚虾生理特性的影响,是工厂化养殖发展的保障㊂本实验通过模拟实际养殖生产中水中N O 2-N 的变化,研究其对对虾行为㊁消化和非特异性免疫系统的影响,为实际养殖生产提供参考㊂1 材料与方法1.1实验材料及管理实验于2020年10月在山东省友发水产有限公司工厂化养殖车间进行㊂金刚虾体质量为(6.06ʃ0.76)g,实验桶为圆柱形(有效水体积为1m 3/桶),中心排污㊂Copyright ©博看网. All Rights Reserved.中国海洋大学学报2023年试验期间所用水为经过漂白粉消毒暴晒后的海水,盐度35,p H=8.0ʃ0.5,水温(28ʃ0.5)ħ,24h不间断曝气,溶氧量约(7.0ʃ0.5)m g/L㊂金刚虾养殖过程中每天投喂4次(6:00㊁11:00㊁16:00㊁21:00),投喂量以2h摄食完毕为标准;每天换水一次,第1~8天换水量为总养殖水量的20%,第9天后,根据养殖水质的变化每天增加5%换水量,直至60%㊂N O2-N浓度采用亚硝酸钠(分析纯)调置,购买于国药集团化学试剂有限公司㊂1.2实验设计金刚虾的放养密度为500尾/m3㊂模拟实际工厂化养殖中水体N O2-N逐渐升高的趋势,以每天0.5m g/L的浓度逐渐提高水体中的N O2-N,对照组不做N O2-N处理,其他实验条件与对照组相同㊂分别在N O2-N浓度为2m g/L(实验第4天)㊁4m g/L(实验第8天)㊁6m g/L(实验第12天)㊁8m g/L(实验第16天)㊁10m g/L(实验第20天)㊁12m g/L(实验第24天)㊁14m g/L(实验第28天)时,进行取样,并记录金刚虾的活力状态㊁摄食及死亡情况,如有死亡个体及时清理㊂实验期间,为了保证N O2-N的浓度,每天换水后0.5和12h时用盐酸萘乙二胺检测法测定养殖水体中N O2-N含量,根据测定的数值及时调整水体的N O2-N 浓度㊂1.3样品制备在N O2-N浓度为2㊁4㊁6㊁8㊁10㊁12㊁14m g/L时,每桶随机取20尾金刚虾,用1m L无菌注射器从金刚虾围心腔中抽取血液,并加入到抗凝剂中,抗凝剂(肝素钠溶液0.1%,125U/m L)与血液的体积比为1ʒ1㊂混合均匀后,立即在4ħ下8500r/m i n离心5m i n,取上清液转移至-80ħ冷冻保存㊁待测㊂另将金刚虾的肝胰腺,收集放入已灭菌50m L的无菌管内,按照样品ʒ生理盐水=1ʒ9比例,加入生理盐水,在冰水浴中进行超声波破碎(匀浆3s,间歇8s,3~4次),匀浆液4ħ, 8000r/m i n离心5m i n后,取上清液-80ħ保存,待测㊂1.4指标检测1.4.1金刚虾行为观察在投喂前和投喂2h后观察金刚虾分布状态(水底U㊁水中M㊁水面S u)及游动活力(迅速Q㊁缓慢S);投喂后,以2h为标准观察金刚虾的摄食速度,超过2h未摄食完的以每15m i n为间隔观察金刚虾是否摄食完毕;摄食后金刚虾肠道呈清晰饱满状态(清晰C㊁饱满F,模糊V㊁不饱满N,空肠J㊁空胃E);记录实验过程中死亡个数㊂1.4.2消化酶活性测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定金刚虾肝胰腺组织样品中脂肪酶(L i-p a s e)㊁胰蛋白酶(T r y p s i n)活性㊂脂肪酶活力定义为37ħ条件下每毫克组织蛋白每分钟水解生成1μm o l 脂肪酸为一个活力单位㊂胰蛋白酶活力定义为37ħ条件下每毫克组织蛋白每分钟水解生成1μg氨基酸为一个酶活力单位㊂1.4.3非特异性免疫酶活性测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定金刚虾血淋巴样品中谷胱甘肽(G S H)含量,谷草转氨酶(G O T)㊁谷丙转氨酶(G P T)㊁酸性磷酸酶(A C P)等非特异性免疫酶活性㊂G S H含量定义为测定组织液或体液中总谷胱甘肽减去2倍的氧化性G S S G的量;G O T酶活力定为在25ħ条件下1m L体液,1m i n内所生成的丙酮酸,使N A D H氧化成N A D+而引起吸光度每下降0.001为一个单位;G P T酶活力定为在25ħ条件下1m L体液,1m i n内所生成的丙酮酸,使N A D H氧化成N A D+而引起吸光度每下降0.001为一个单位;A C P酶活力定义为100m L血清中在37ħ与基质作用30m i n产生1m g 酚为1个金氏单位㊂1.5数据处理实验数据利用S P S S16.0进行单因素方差分析(o n e-w a y A N O V A,E x c e l2010软件作图,结果均表示为平均值ʃ标准差(M e a nʃS D),P<0.05为差异显著㊂2结果与分析2.1N O2-N慢性胁迫对金刚虾行为的影响如表1所示,实验开始后,在N O2-Nɤ6m g/L(第12天)时实验组与对照组(N O2-Nɤ(0.020ʃ0.008) m g/L)金刚虾的生活状态无明显差异,金刚虾栖于养殖桶中㊁底部,除喂料时很难看到其游到水面,摄食正常,摄食后胃肠清晰饱满㊂在6m g/L(第12天)ɤN O2-Nɤ8m g/L(第16天)时,实验组金刚虾摄食能力逐渐减缓,需要2h5m i n才能将饵料摄食完,在水中的分布状态㊁游动活力及胃肠饱满清晰与对照组((0.020ʃ0.008)m g/LɤN O2-Nɤ(0.03ʃ0.01) m g/L)未见明显差异;8m g/L(第16天)ɤN O2-Nɤ10m g/L(第20天)时,金刚虾需要2h30m i n才能将饵料摄食完,相较于对照组((0.03ʃ0.01)m g/LɤN O2-Nɤ(0.10ʃ0.03)m g/L),摄食速度下降明显,胃肠道稍有模糊,不饱满,实验组水面会偶见上游的金刚虾;N O2-Nȡ10m g/L(第20天)时,金刚虾需要3h才能将食物摄食完,有的金刚虾胃肠道模糊,有的出现空肠现象,粪便空絮状;N O2-N达到14m g/L(第28天)时,金刚虾停止摄食,水面㊁桶壁可见金刚虾缓慢游动并碰触桶壁,并出现死亡个体(见表1)㊂2.2N O2-N慢性胁迫对金刚虾肝胰腺消化酶活性的影响如图1A所示,当N O2-N升高至2m g/L(第4天)时,T r y p s i n活性值高于对照组(N O2-N=0.0m g/L),44Copyright©博看网. All Rights Reserved.6期王友红,等:亚硝态氮慢性胁迫对斑节对虾(非洲群体)行为㊁消化酶活力和非特异性免疫的影响但无显著差异(P >0.05);当N O 2-N 升高至6m g /L (第12天)时,实验组活性升高至最大值,显著高于对照组;之后逐渐下降,当10m g /L (第20天)ɤN O 2-N ɤ14m g /L (第28天)时,T r y ps i n 活性均显著低于对照组((0.1ʃ0.03)m g /LɤN O 2-Nɤ(0.18ʃ0.08)m g /L )(P <0.05)㊂表1 N O 2-N 慢性胁迫对金刚虾行为的影响T a b l e 1 E f f e c t s o f c h r o n i c n i t r i t e s t r e s s o n b e h a v i o r o f a nA f r i c a n p o p u l a t i o n o f P e n a e u sm o n o d o n 行为特征B e h a v i o r c h a r a c t e r i s t i c s亚硝酸盐浓度N i t r i t e c o n c e n t r a t i o n /(m g/L )2468101214分布状态S t a t e o f d i s t r i b u t i o nM /U M /U M /U M /U S u /M /US u /M /US u /M /U游动活力V i t a l i t y o f s w i m m i n g Q Q Q Q Q S S 肠道状态S t a t e o f t h e g u t C /F C /F C /F C /FV /NV /J J /E 摄食速度R a t e o f f e e d i n g 2h 2h 2h 2h 15m i n 2h 30m i n3h 不摄食死亡数量N u m b e r o f d e a t h s2注:M :水中M i d d l ew a t e r ;U :水底U n d e rw a t e r ;S u :水面S u r f a c e ;Q :迅速Q u i c k l y ;S :缓慢S l o w l y ;C :清晰C l e a r l y;F :饱满F u l l ;V :模糊V a g u e l y ;N :不饱满N o t f u l l ;J :空肠J e j u n u m ;E :空胃E m p t y st o m a c h ㊂ 如图1B 所示,L i p a s e 活性变化趋势与T r y ps i n 相似㊂当2m g /L (第4天)ɤN O 2-N ɤ6m g /L (第12天)时,L i p a s e 活性显著升高,当N O 2-N 升高至6m g /L (第12天)时,L i p a s e 活性达到最大值,当8m g/L (第16天)ɤN O 2-Nɤ10m g /L (第20天)时,L i p a s e 活性下降,但均显著高于对照组(P <0.05);当N O 2-Nȡ12m g /L (第24天)时,L i p a s e 活力下降且显著低于对照组(P <0.05)㊂(图中不同小写字母表示同一时间各组之间存在显著性差异(P <0.05)㊂D i f f e r e n t s m a l l l e t t e r s u p e r s c r i p t s i n t h e f i g u r e s a r e s i g n i f i c a n t l yd i f fe r e n t (P <0.05).)图1 N O 2-N 慢性胁迫对金刚虾消化酶活性的影响F i g .1 E f f e c t s o f c h r o n i c n i t r i t e s t r e s s o n t h e a c t i v i t i e s o f d i g e s t i v e e n z y m e s o f a nA f r i c a n p o pu l a t i o n o f P e n a e u sm o n o d o n 2.3N O 2-N 慢性胁迫对金刚虾血淋巴中非特异性免疫酶活性的影响如图2A 所示,当N O 2-N 升高至4m g /L (第8天)时,A C P 活性显著升高,当N O 2-N 升高至6m g /L (第12天)时,酶活性达到最高峰值,显著高于对照组(P <0.05),之后随着N O 2-N 缓慢升高,A C P 活性逐渐下降,当8m g /L (第16天)ɤN O 2-Nɤ10m g /L (第20天)时,实验组活性仍明显高于对照组,当12m g/L (第24天)ɤN O 2-N ɤ14m g /L (第28天)时,A C P 活性值均显著低于对照组(P <0.05)㊂54Copyright ©博看网. All Rights Reserved.中 国 海 洋 大 学 学 报2023年如图2B 所示,当N O 2-Nɤ8m g /L (第16天)时,实验组的G O T 酶活性一直是上升的状态,且明显高于对照组(P <0.05);当N O 2-N 升高至10m g /L 时(第20天),G O T 活性开始下降,略低于对照组(P >0.05);当N O 2-N 升高至12m g /L (第24天)时,G O T 活性开始升高,至实验结束时,持续升高,明显高于对照组(P <0.05)㊂如图2C 所示,当N O 2-N 升高至2m g /L (第4天)时,G P T 活性略高于对照组(P >0.05),当N O 2-N 升高至4m g/L (第8天)时,实验组G P T 活性略有升高,但低于对照组(P >0.05),当N O 2-N 升高至6m g /L (第12天)时,G P T 酶活性上升,显著高于对照组(P <0.05);当8m g /L (第16天)ɤN O 2-N ɤ10m g /L (第20天)时,G P T 酶活性下降,但均高于对照组(P >0.05);当N O 2-N ȡ12m g /L (第24天)时,G P T 酶活性不断升高,显著高于对照组(P <0.05)㊂如图2D 所示,当N O 2-N 升高至6m g /L (第12天)时,实验组G S H 含量达到最大值,显著高于对照组(P <0.05);当N O 2-N 升高至8m g /L (第16天)时,G S H 含量开始下降,显著高于对照组(P <0.05),当N O 2-Nȡ10m g /L (第20天)时,G S H 含量下降,当N O 2-N 升高至14m g /L (第28天)时,G S H 含量最低,显著低于对照组(P <0.05)㊂(图中不同小写字母表示同一时间各组之间存在显著性差异(P <0.05)㊂D i f f e r e n t s m a l l l e t t e r s u p e r s c r i p t s i n t h e f i g u r e s a r e s i g n i f i c a n t l yd i f fe r e n t (P <0.05).)图2 N O 2-N 慢性胁迫对金刚虾血淋巴中非特异性免疫性酶活性的影响F i g .2 E f f e c t s o f c h r o n i c n i t r i t e s t r e s s o n t h e a c t i v i t y o f n o n s p e c i f i c i m m u n e e n z y m e s i n s e r u mo f a nA f r i c a n p o pu l a t i o n o f P e n a e u sm o n o d o n 3 讨论3.1N O 2-N 慢性胁迫对金刚虾活力和摄食行为的影响N O 2-N 是对虾工厂化养殖的主要胁迫因子之一,对对虾的生长㊁繁殖㊁行为㊁代谢和免疫等有重要影响,严重制约了对虾高密度养殖产业的发展㊂行为是动物适应内外环境变化所产生的反应[10],研究表明,养殖水体中N O 2-N 浓度的升高会影响对虾血蓝蛋白的形成,引起组织缺氧,严重影响对虾的呼吸代谢,对养殖生物的行为产生影响,如摄食频率下降㊁游泳异常缓慢,严重的可直接造成对虾死亡[11-12]㊂本实验中,金刚虾在N O 2-N 慢性胁迫中也表现出相似的行为㊂在低浓度时(ɤ6m g /L ),金刚虾摄食频率㊁活力和游动并无异常;随着N O 2-N 浓度升高(ȡ8m g /L ),金刚虾摄食速度明64Copyright ©博看网. All Rights Reserved.6期王友红,等:亚硝态氮慢性胁迫对斑节对虾(非洲群体)行为㊁消化酶活力和非特异性免疫的影响显下降,胃肠道模糊㊁不饱满;金刚虾分布于中上层,游动异常,根据日本对虾(P e n a e u s j a p o n i c u s)[13]㊁日本沼虾(M a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s i s)[14]为躲避低氧区域,趋向于浅水区或碰触水槽来接触空气,以增加自身的摄氧量,推测N O2-N慢性胁迫引起金刚虾组织缺氧,致使金刚虾异常游动到水上层甚至水面㊂因此,在实际工厂化养殖过程中,将养殖水体中N O2-N浓度控制在6m g/L以下,将不会影响金刚虾的活力及摄食㊂3.2N O2-N慢性胁迫对金刚虾肝胰腺消化酶活性的影响肝胰腺是对虾合成和分泌消化酶㊁消化吸收并贮存营养物质的器官,通过组织切片和超微观察发现, N O2-N能够破坏器官组织,影响对虾的消化吸收[12,15]㊂消化酶活性是反应个体摄食活性的最直接的证据[16-18]㊂N O2-N胁迫会导致水生生物的食欲下降,降低对虾的摄食率和饲料转化率,从而引起水生生物生长速率下降㊂实验中的脂肪酶和胰蛋白酶均在N O2-N浓度为6m g/L时上升至最大值,随着N O2-N 浓度升高表现出了 诱导-抑制 的变化趋势㊂研究表明,随着养殖水体N O2-N浓度逐渐升高,导致血液携氧量下降,组织缺氧[19],打破了机体的代谢平衡,为了维持机体代谢平衡,需要消耗大量的糖类㊁脂肪㊁蛋白质来提供能量[12,20-21],从而在短时间内提高了消化酶活力[18]㊂本实验证明,在N O2-N浓度升高过程中,通过脂肪和蛋白质的大量消耗来为机体提供能量,当N O2-N浓度继续升高后,降低了脂肪酶和胰蛋白酶的活性,导致金刚虾摄食减少,机体供能减少,其表现为游动缓慢㊁摄食速度下降,这一情形与上述3.1结果相呼应㊂3.3N O2-N慢性胁迫对金刚虾血淋巴中免疫酶活性的影响A C P是溶酶体酶的一种,其活性的高低直接反映生物体的生长状况㊁免疫功能及应对外界环境变化的能力[22]㊂在本实验中,A C P随着N O2-N浓度表现出 先升高后下降 的趋势,说明N O2-N慢性胁迫对金刚虾血淋巴中A C P产生了诱导,活性值升高,机体的生长及反应能力不受影响;之后A C P活性下降,推测N O2-N浓度抑制A C P产生,使机体免疫及反应能力下降㊂G O T㊁G P T是肝脏重要的转氨酶,在正常状态下,活性稳定;当肝细胞受到外界刺激导致损伤或者病变时,细胞膜通透性增强,将肝细胞中的这两种酶释放到血液中,致使血淋巴中两种酶活性升高[23],因此G O T㊁G P T是反应肝细胞是否受损的重要指标,可以评价N O2-N胁迫对养殖生物的毒副作用[24]㊂本实验研究中,金刚虾血淋巴中G O T㊁G P T活性随着N O2-N浓度的升高,表现出 先升高后下降再升高 的趋势㊂说明N O2-N慢性胁迫对金刚虾肝胰腺产生了一定的损伤;之后G O T㊁G P T活性下降,推测金刚虾开始出现一定自身修复功能,随着N O2-N浓度的持续升高,超越了自身修复能力,从而对肝胰腺产生了负担甚至损伤㊂这与已有的研究 毒性兴奋效应 现象相似,在一定的浓度范围内,经过外界物质的刺激,促使机体为快速清除胁迫而产生活性氧,以增强抵抗力;超越浓度范围则会对机体产生严重损伤[25]㊂氧化应激反应是对虾体内一种危害机制,会导致对虾体内产生大量自由基(R O S),从而对重要器官造成损伤[26],使对虾组织产生病理变化,其中对肝胰腺的影响最为严重[27]㊂G H S是体内重要的抗氧化剂,它可通过参与非酶类抗氧化反应和作为G S H-P x的底物来清除R O S[28]㊂本实验结果显示,随着N O2-N浓度的升高G S H活性逐渐升高,在N O2-N浓度小于等于6m g/L时达到峰值,表明G H S受到N O2-N胁迫后迅速清除金刚虾体内的R O S,提高其免疫能力,以应对外界环境的变化㊂随着N O2-N浓度升高,酶活力转而下降,直至显著低于对照组,推测可能由于金刚虾体内的自由基增多超出了清除能力,致使金刚虾重要器官受到损伤,甚至出现死亡㊂4结语当养殖水体中N O2-N浓度小于6m g/L时,N O2-N 对金刚虾的摄食㊁活力行为影响不显著,对相关消化酶和免疫酶产生了诱导作用㊂当N O2-N浓度大于10m g/L时,N O2-N对金刚虾的摄食及活力影响显著,且显著影响着相关消化酶和免疫酶的活性㊂因此,水体中N O2-N浓度控制在6m g/L以下不会影响金刚虾的生长㊂参考文献:[1]陈书畅,徐晔,吴龙华,等.南非斑节对虾和中国明对虾肌肉营养成分分析比较[J].水产科技情报,2019,46(5):283-286.C h e n S C,X uY,W u LH,e t a l.C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f m u s c l e n u t r i-e n t s b e t w e e n P e n a e u sm o n o d o m a n d P e n a e u s c h i n e n s i s[J].A q u a t i c S c i-e n c e a n dT e c h n o l o g y I nf o r m a t i o n,2019,46(5):283-286.[2]王晓璐,李乐,王友红,等.南非斑节对虾肠道组织结构及菌群特征㊁代谢活性研究[J].广西科学院学报,2019,35(4):325-331.W a n g X L,L iL,W a n g Y H,e ta l.R e s e a r c ho no r g a n i z a t i o n s t r u c t u r e,m i r o-f l o r a c h a r a c t e r i s t i c s a n d m e t a b o l i c a c t i v i t y o f P e n a e u sm o n o d o m[J].J o u r n a l o fG u a n g x iA c a d e m y o fS c i e n c e s, 2019,35(4):325-331.[3]高明辉,马立保,葛立安,等.亚硝酸盐在水生动物体内的吸收机制及蓄积的影响因素[J].南方水产,2008,4(4):73-79.G a oM H,M a LB,G e,LA,e t a l.N i t r i t e u p t a k em e c h a n i s ma n dt h e i n f l u e n c i n g f a c t o r s o f a c c u m u l a t i o n i n a q u a t i c a n i m a l s[J].S o u t hC h i n aF i s h e r i e s S c i e n c e,2008,4(4):73-79.[4]C h e n g SY,C h e n JC.H a e m o c y a n i no x y g e n a f f i n i t y a n d t h e f r a c-t i o n a t i o no fo x y h e m o c y a n i n a n d d e o x y h e m o c y a n i nf o r P e n a e u s74Copyright©博看网. 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氨氮胁迫对水产动物生长、消化酶及免疫影响的研究进展
《河北渔业》2021年第5期(总第329期)DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2021.05.012氨氮胁迫对水产动物生长、消化酶及免疫影响的研究进展韩朝婕，陈屹洋，贺振楠，张严匀，周文礼，高金伟，贾旭颖(天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384)摘要：为深入了解水体中过量的氨氮对水产动物带来的问题，综述了氨氮胁迫对水产动物的生长、消化酶、抗氧化酶活及免疫机制的影响。
关键词：氨氮胁迫；生长；消化酶；免疫中国是全球水产养殖第一大国，然而，在集约化高密度养殖的迅猛发展形式下，养殖过程中受到各种环境因子的应激影响，尤其是在水产养殖过程中，随着养殖时间的变长，水体中的氨氮浓度会不断富集，当氨氮含量达到或者超过水产动物本身耐受限值时，会使得其生长缓慢，代谢能力下降，长期以往会导致其免疫力下降,最终感染多种病菌造成大面积死亡E1_2]o在目前的养殖水体环境中，大部分氨氮来自于养殖动物的残饵分解与代谢物，无机氮主要以钱态氮、非离子氨和亚硝酸氮的形式存在于水体中，氨氮里最有害的毒性物质是非离子氨(NH3),过量的非离子氨会造成水产动物代谢紊乱,影响其离子调节能力，是目前水产养殖中所急需解决的问题之一37〕。
因此，本文综述了氨氮胁迫对水产动物生长、消化酶及免疫的不同影响，以期为后期解决集约化养殖中的问题提供参考。
1氨氮胁迫对水产动物生长的影响水体中的氨氮主要由水产动物未消耗的饲料、排泄等其它有机物的分解产生,是存在于养殖水体中重要的污染物曲。
Zhang等旳通过试验发现,氨氮胁迫的时间越长，浓度越高，会导致团头鲂(Megalobrama amblycephala)的存活率显著降低,抑制其生长。
已有研究表明，在对“新吉富”罗非鱼(Oreochroms niloticus)进行30d的慢性氨氮胁迫试验中发现幼鱼具有一定的耐受性，但当氨氮浓度超出耐受阈值后，会抑制其生长发育，影响幼鱼摄食⑷。
氨氮胁迫对鲫免疫系统及肠道菌群结构的影响
氨氮胁迫对鲫免疫系统及肠道菌群结构的影响摘 要集约化生产养殖、高密度养殖以及蛋白饲料的过度使用，容易造成水体中氨氮含量升高，引起水华、赤潮等水体富营养化，既破坏生态环境又给水产养殖业带来巨大的经济损失。
氨氮胁迫会危害鱼体免疫系统，损伤肠道粘膜，提高鱼体对病原菌的易感性。
本研究利用静水试验法测定氨氮对鲫的半数致死浓度（LC50）及其安全浓度；通过氨氮胁迫试验研究氨氮对鲫免疫系统的影响；利用高通量测序技术分析氨氮对鲫肠道菌群结构的影响，研究氨氮浓度、暴露时间与肠道菌群种类、含量的关系；初步探讨氨氮—免疫—肠道微生物三者之间的关系。
本研究得到的主要结果如下：1. 氨氮在96 h时对鲫的LC50为110.66 mg·L-1，安全浓度为11.07 mg·L-1。
2.通过氨氮胁迫试验，发现在安全浓度（10 ppm）处理组中，免疫相关基因（IL-1β，CXCL-8，TNFα）和抗氧化酶相关基因（GST，CAT，PRX）第15天时与对照组相比表达量显著上调；在高浓度（50 ppm）处理组中，免疫相关基因（IL-1β，CXCL-8，TNFα）和抗氧化酶相关基因（GST，SOD，CAT，PRX）第15天和第30天表达量较对照显著下调；再经15天无氨氮处理，免疫相关基因和抗氧化酶相关基因表达可恢复到对照水平。
3.通过16S rDNA微生物多样性分析，发现氨氮胁迫对肠道菌群物种丰度无显著影响；对肠道菌群结构组成显著影响，在属水平上，随着氨氮胁迫浓度升高拟杆菌属Bacteroides和鲸杆菌属Cetobacterium比例先升高后降低；在高浓度组中，黄杆菌属Flavobacterium相对含量随氨氮暴露时间不断升高，在第30 d时与对照相比相对含量升高近25%，病原菌含量的升高可能与免疫基因显著下调有关。
综上所述，氨氮胁迫对鲫免疫系统及肠道菌群结构有一定的影响。
高浓度氨氮胁迫抑制免疫相关基因和抗氧化酶相关基因的表达，同时鲫肠道内潜在病原菌黄杆菌属Flavobacterium含量升高。
三种免疫添加剂对草鱼非特异性免疫功能的影响
分 别 于试 验 开 始 后 的第 ｌ 、８ ４２ 、
３ ５和 ４ ２天取样 ，每箱取 ３ 尾鱼 ，尾静脉采血 ， 于 ４ ３ ０ ｍ ｎ ℃， ０ ０ｒ ｉ 离心 ，０ｍｎ 收集血清备用。 ／ １ ｉ，
ｃ ｌｓｄｉｔ ｕ） 干 粉 为 底 物 （ｉｍ ｙｏｅｋｉ ｓ冻 ｃ Ｓｇ ａ公 司产 品 ） ，
在 正式 实验 前 ，草 鱼 放 入暂 养 池 驯养 二 周 ， 以
适应试验环境 ， 其后移人 网箱中。 每天投喂 ３ ， 次 分 别为 ６３ 、１ ０和 ｌ ：０ 投 饵量 为 鱼体 重 的 ４ ：０ １： ３ ６３ ， ％～ ５ 并根据水温 、 ％， 摄食情况调整 。试验从为 ２ １ 年 ００
挑选规格整齐 、 体质健壮的鱼 ３０尾 ， ５ 平均体 质量
１８ ／ ，用 ３ ０ 尾 ｇ ％的食盐水溶液消毒后 ，随机分成 ７ 组， 每组 ２ 尾 ， ５ 每组 ２ 重复 ， 个 放入 １ 网箱 中． ４个
网箱为 １ ｘ ． ｒｘ ． ｍ。设 ２个对 照组 。网箱 放 ． ｍ １ ０５ ０ ０ｅ
后 ， 即置 于 冰浴 中 １ ｎｎ终 止 反 应 ， 其 光 密 度 立 ０一 ｉ 测 的溶菌 酶活 性在 试验后 期 （ ３ 第 ５和 ４ ２天 ） 于对 照 高
组， 但与对照组差异不显著（ Ｏ ５ 。 ．） ０
表 １ ３种 免 疫 添 加 剂 对 草 鱼 血 清 溶 菌 酶 活性 的影 响
效 、 用 的方法 ｌ１ 实 】。 ＿ ２
相 容性 ， 可被 溶 菌酶 等溶 解 ， 毒副 作 用 ， 无 其代 谢 物
也无毒 ， 能被生物体完全吸收【。研究表明 ， ｎ Ｊ 壳聚糖 既可 以提高 出于正常生理 条件下鱼体 的非特异性
亚硝态氮胁迫对草鱼非特异性免疫性能的影响_叶俊
第43卷第4期Vol.43No.4淡水渔业Freshwater Fisheries2013年7月Jul 2013收稿日期：2013－01－13；修订日期：2013－05－13资助项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（NYCYTX －49）；“十二五”农村领域国家科技计划课题（2012BAD25B01）；湖北省自然科学基金重点项目（2012FFA029）；中央高校基本科研业务费专项资金（2013PY024）第一作者简介：叶俊（1990－），男，硕士研究生，专业方向为水产养殖学。
E-mail ：yesanzi@通讯作者：李大鹏。
E-mail ：ldp@ 亚硝态氮胁迫对草鱼非特异性免疫性能的影响叶俊1，肖琛1，尹晓燕1，汤蓉1，2，李大鹏1，2（1.华中农业大学水产学院，武汉430070；2.淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，武汉430070）摘要：为探讨亚硝态氮胁迫对草鱼（Ctenopharyngodon idellus ）非特异性免疫性能的影响，将草鱼（0.15ʃ0.05g ）分别暴露在0mg /L 、0.2mg /L 、0.4mg /L 、0.8mg /L 、1.0mg /L 、2.0mg /L 、4.0mg /L 和8.0mg /L 的亚硝态氮溶液中，分别在暴露后0d 、1d 、4d 、7d 测定草鱼体内补体C3和C4含量、超氧化物歧化酶（SOD ）活力、谷胱甘肽（GSH ）含量以及γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ－GCS ）活性。
结果表明，亚硝态氮胁迫对草鱼非特异性免疫性能产生了消极影响，其胁迫效应随着暴露浓度的不同而表现出不同的特性。
当暴露浓度低于1.0mg /L 时，补体C3和C4含量维持正常水平或显著升高；但暴露浓度超过1.0mg /L ，补体C3和C4含量水平会显著下降。
SOD 活性随着暴露时间而显著升高，但高浓度暴露使SOD 活性在暴露7d 时显著下降。
γ－GCS 活性一般都随着暴露时间延长而显著升高，虽然暴露后期其活性下降，但还是显著高于对照组。
一种复方中草药制剂对草鱼非特异性免疫机能的影响
㊀㊀2022年第63卷第1期151收稿日期:2021-09-12基金项目:浙江省重点研发计划(2019C02049;2020C02014)作者简介:郑善坚(1971 ),男,浙江金华人,副教授,硕士,研究方向为水生动物生态学,E-mail:zhengsj@㊂文献著录格式:郑善坚,胡金春,叶霆,等.一种复方中草药制剂对草鱼非特异性免疫机能的影响[J].浙江农业科学,2022,63(1):151-153.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20212946一种复方中草药制剂对草鱼非特异性免疫机能的影响郑善坚1,胡金春2,叶霆2,史文竞2,于瑾3(1.浙江师范大学,浙江金华㊀321004;2.衢州市水产技术推广中心,浙江衢州㊀324000;3.龙游县养殖业发展中心,浙江龙游㊀324400)㊀㊀摘㊀要:为探究复方中草药制剂对草鱼非特异性免疫机能的影响㊂本研究在草鱼饲料中添加1%的复方中草药制剂,分别对拌喂0d㊁7d㊁14d㊁14d (拌喂7d 后停7d)及21d (拌喂7d 后停14d)的草鱼进行尾静脉取血,测定血清中MDA 含量㊁SOD 活性和MHC Ⅰ免疫基因表达量㊂试验结果显示,拌喂复方中草药制剂7d 的草鱼血清内SOD 活性最高,拌喂14d 草鱼血清中SOD 反而有下降,拌喂7d 后停用7d 和拌喂7d 后停用14d 时草鱼血清内SOD 活性差异不显著,但各试验组的SOD 活性仍显著高于对照组;拌喂复方中草药制剂的草鱼血清中MDA 含量与对照差异不显著;拌喂14d 草鱼MHC Ⅰ免疫基因表达量有较明显上升,但其余各试验组和对照组间无显著差异㊂结果认为,添加复方中草药制剂可以增强草鱼的非特异性免疫机能㊂关键词:中草药制剂;草鱼;非特异性免疫;MHC Ⅰ中图分类号:S948㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2022)01-0151-03㊀㊀草鱼(Ctenopharyngodon idella )是我国养殖产量最高的淡水鱼类,2019年产量达到553.3万t (2020中国渔业年鉴)㊂草鱼耐粗饲,生长速度快,肉质细嫩,具有极高的经济价值㊂但随着草鱼养殖密度提高,受水质㊁饲料质量及种质退化等影响,草鱼病害问题突出,造成巨大的经济损失㊂研究表明,单一或复方的中草药内服等可以提高水产动物抵御外界不良环境的能力,可促进水产动物的非特异性免疫指标的提高,增强其免疫机能,提高水产动物生存能力[1]㊂田照辉等[2]将由植物多糖㊁益生素㊁寡糖和天然分子筛等成分有机结合成的复方中草药制剂在饲料中添加1%饲喂,显著降低了草鱼的病害发生率和死亡率㊂植物多糖㊁益生素和寡糖还能调节肠道菌群微生态环境,增加消化酶的分泌,促进动物生长,增强机体免疫力和抗病力[3-6]㊂本试验通过筛选复方中草药制剂,研究其在不同拌喂策略时对草鱼血清免疫活性影响,以期为草鱼的健康养殖提供科学指导㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料㊀㊀试验用草鱼来自于浙江龙和水产养殖开发有限公司,草鱼体质健壮,外表无伤,规格为(162.04ʃ7.31)g,经室内循环流水暂养7d 后开始试验㊂1.2㊀复方中草药制剂组成㊀㊀使用的复方中草药制剂主要由郁金㊁五味子㊁甘草㊁黄芪多糖等组成,使用前与草鱼饲料(通威饲料182,蛋白28%)按1%的添加比例制成粒径约2.0mm 的饲料颗粒,避光风干备用㊂1.3㊀处理设计㊀㊀试验以未添加复方中草药制剂的实验初始草鱼为对照(S Ⅰ);设计4个试验组,分别为持续拌喂复方中草药制剂7d 组(SⅡ),持续拌喂复方中草药制剂14d 组(SⅢ),拌喂7d 后停7d 组(S Ⅳ)及拌喂7d 后停14d 组(SⅤ),每个试验组设3个重复㊂试验在养殖桶(直径1m,水位0.5m)内进行,每桶放养10尾试验草鱼;每日19:00投喂1次,投饵率为鱼体重的2%;试验期间水温为26~32ħ,溶解氧保持在6mg㊃L -1以上,pH 为7.8ʃ0.1㊂1.4㊀指标测定与分析1.4.1㊀血液生化指标测定㊀㊀随机选取3尾鱼进行尾静脉采血,室温自然凝152㊀㊀2022年第63卷第1期固20min后,3000r㊃min-1室温离心20min取上清液,-20ħ保存,用于血液生化指标测定㊂SOD 采用WST-1法测定,MDA采用TBA法,使用试剂盒均来自南京建成生物工程研究所㊂1.4.2㊀血液中免疫相关基因MHCⅠ的表达量分析㊀㊀草鱼MHCⅠ基因引物F:5ᶄ-GATCCCTCCTCTC CAGTGACG-3ᶄ,R:5ᶄ-GTCCTCATTGGGAAGAAGTTCA-3ᶄ,委托上海生工合成㊂取试验草鱼血液样品300μL,RNA提取试剂盒提取总RNA,按照cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书要求进行mRNA反转录㊂将得到的cDNA模板置于qRT-PCR反应体系中,经过6000r㊃min-1离心后,置于ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪,以95ħ10min;95ħ15s,60ħ1min,40个循环为扩增程序;β-actin(登录号: DQ211096.1)为内参基因,每孔3个技术重复㊂采用2-ΔΔCt法分别计算MHCⅠ免疫基因在血液中的相对表达量,重复做3次独立反应㊂1.5㊀数据统计分析㊀㊀采用SPSS22.0软件统计分析数据,使用Shapiro-Wilk和Levene检验进行数据的正态性和方差同质性分析,利用方差分析(ANOVA)检验各组之间的显著性,并用Duncan s法进行多重分析, P<0.05为差异显著㊂结果以平均值ʃ标准误(MeanʃSE)来表示㊂2㊀结果与分析2.1㊀复方中草药制剂对草鱼免疫活性的影响㊀㊀由图1可知,使用复方中草药制剂后的试验组草鱼SOD活性均显著高于对照组,除SⅣ组和SⅤ组之间无显著性差异外,其余各组间差异显著㊂草鱼SOD 活性依次是SⅡ组>SⅢ组>SⅣ组>SⅤ组>对照组;试验组草鱼血液MDA含量和对照组无显著性差异㊂同一指标不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)㊂图1㊀复方中草药制剂对草鱼免疫活性的影响2.2㊀复方中草药制剂对草鱼免疫基因MHCⅠ表达量的影响㊀㊀由表1可知,使用复方中草药制剂后试验组草鱼SⅢ的MHCⅠ免疫基因的相对表达量显著高于其他组,其他各组之间无显著性差异㊂表1㊀抗应激剂对草鱼免疫基因MHCⅠ表达量的影响组别MHCⅠ基因相对表达量SⅠ 1.00ʃ0.05bSⅡ 1.03ʃ0.00bSⅢ 1.79ʃ0.01aSⅣ 1.24ʃ0.35bSⅤ 1.05ʃ0.02b㊀㊀注:同列无相同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)㊂3㊀讨论3.1㊀复方中草药制剂对草鱼非特异性免疫功能的影响㊀㊀SOD是鱼体非特异性免疫功能的重要指标㊂SOD可以帮助鱼体清除自由基,对增强吞噬细胞的防御能力和机体的免疫功能具有重要作用[7]㊂试验发现,在饲料中添加1%的复方中草药制剂可以显著提高草鱼血清中SOD活性㊂其中,添加1%复方中草药制剂持续拌喂7d时草鱼的SOD活性最高,其次是持续拌喂14d时的草鱼,然后是拌7d 停7d和拌7d停14d时的草鱼㊂李赫等[8]发现投喂含黄芪多糖㊁枸杞多糖和金丝桃素的饲料使草鱼血清SOD活性显著高于对照组㊂本试验用的复方中草药制剂含有黄芪多糖㊁姜黄等,被证明具有增强机体免疫机能,能不同程度地提高草鱼血清的SOD活性㊂研究也发现,持续拌喂复方中草药制剂14d时草鱼血清SOD活性较持续拌喂7d时反而下降,分析原因可能是持续拌喂复方中草药制剂造成了草鱼的免疫疲劳㊂这与Lin等[9]认为,长期口服复方中草药制剂会降低鱼类免疫水平的结果一致㊂姚嘉赟等[10]在研究3种免疫增强剂(黄芪㊁参芪和酵母)对黄颡鱼血清中SOD活性的影响中发现,各试验组的血清SOD活性在7d达到峰值,此后呈降低趋势,与本研究的结果类似㊂本研究发现,添加复方中草药制剂草鱼血清的MDA含量与对照差异不显著㊂MDA是细胞氧化代谢产物之一,其含量的高低可以反映机体细胞受到自由基攻击的程度㊂当生物体内的氧化胁迫超过生物体自身抗氧化防御系统的保护能力时,就不可避免地对生物体造成毒害[11]㊂徐军等[12]研究发现,当草鱼受到臭氧的胁迫时,其血清中的MDA含量会升高,胁迫解除时,MDA含量的水平会恢复至正常水平㊂本研究草鱼血清中的MDA含量未见显著性差异,推测可能是由于本试验草鱼并未受到外来胁迫,因此,变化并不明显㊂3.2㊀复方中草药制剂对草鱼MHCⅠ免疫基因的影响㊀㊀主要组织相容性复合体(MHC)在免疫系统中起着重要的作用,通过编码抗原识别蛋白激发机体特异性免疫反应㊂MHCⅠ类分子主要是呈递内源性抗原多肽,与处理后的多肽结合形成复合体,并激活细胞毒性T细胞(CD8+),使T细胞进行细胞免疫[13]㊂吴凡等[14]检测草鱼在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后的MHCⅠ区部分免疫基因表达量发现,BRD2㊁MHCⅠa㊁PSMB9㊁TAP2的表达量在攻毒后都有显著性变化,表明这4个基因在草鱼免疫方面具有重要的作用㊂许友卿等[15]发现,在饲料中添加5.0%和7.5%杜仲叶粉组使青鱼肾组织中MHCⅠ基因表达显著高于对照组,添加2.5%杜仲叶粉组相比于对照组无显著差异㊂本研究中1%复方中草药制剂持续拌喂14d,草鱼血清中MHCⅠ免疫基因的表达量有显著提升,其他试验组与对照组无显著性差异㊂说明1%复方中草药制剂具有调节免疫基因的功能,但需要一定的持续时间㊂3.3㊀复方中草药制剂的作用机制㊀㊀本试验的复方中草药制剂主要组成为郁金㊁五味子㊁甘草㊁黄芪多糖等㊂其中郁金含有挥发油和姜黄素,具有行气解郁㊁清心凉血㊁利胆退黄等功效[16],姜黄素能够显著提高罗非鱼的SOD活性,增强机体免疫力,促进肠道组织发育[17];五味子具有降血脂和舒张血管的心血管保护作用,具有抗氧化和免疫活性[18];甘草中的甘草多糖可对特异性免疫㊁非特异性免疫有正向调节作用,可以提高异育银鲫上清中GSH-Px和SOD活力以及抑制脂质过氧化产物MDA的生成来减轻对肝细胞的损伤;黄芪多糖则具有增强机体免疫功能㊁抗病毒㊁抗氧化等多种药理功效㊂黄芪多糖可使小鼠血清中IgA㊁IgG㊁IgM的含量显著提高;还可刺激T㊁B 淋巴细胞㊁抗体分泌细胞及自然杀伤细胞,使其活力增强[19]㊂复方中草药制剂通过综合调节动物机体的特异性与非特异性免疫,参与草鱼的免疫保护㊂参考文献:[1]㊀谢少林,邹青,姚东林,等.抗应激饲料添加剂对草鱼生长㊁免疫和抗应激能力的影响[J].水产科技情报,2013,40(6):312-316.[2]㊀田照辉,卢俊红,朱华,等.一种免疫增强剂对北京地区草鱼种生长和抗病力的影响[J].淡水渔业,2015,45(6):85-88,112.[3]㊀萨茹丽,杨斌,敖长金.天然植物提取物在动物氧化应激中的研究概况[J].动物营养学报,2018,30(6):2021-2026.[4]㊀周艳玲,孙育平,黄燕华,等.饲料中添加谷胱甘肽对黄颡鱼幼鱼组织谷胱甘肽含量㊁免疫及抗氧化性能的影响[J].水生生物学报,2018,42(4):728-735. [5]㊀萨茹丽,杨斌,敖长金.天然植物提取物在动物氧化应激中的研究概况[J].动物营养学报,2018,30(6):2021-2026.[6]㊀孙超,孙召君,张大伟.复方中草药制剂防治草鱼肝胆综合症研究[J].今日畜牧兽医,2020,36(6):62. [7]㊀ROOSTA Z,HAJIMORADLOO A,GHORBANI R,et al.Theeffects of dietary vitamin C on mucosal immune responses andgrowth performance in Caspian roach(Rutilus rutilus caspicus)fry[J].Fish Physiology and Biochemistry,2014,40(5):1601-1607.[8]㊀李赫,宋文华,于翔,等.几种免疫增强剂对草鱼SOD㊁CAT及AKP活性的影响[J].水产学杂志,2010,23(4):6-9.[9]㊀LIN S M,PAN Y,LUO L,et al.Effects of dietaryβ-1,3-glucan,chitosan or raffinose on the growth,innate immunityand resistance of koi(Cyprinus carpio koi)[J].Fish&Shellfish Immunology,2011,31(6):788-794. [10]㊀姚嘉赟,徐洋,盛鹏程,等.3种免疫增强剂对黄颡鱼非特异性免疫机能的影响[J].安徽农业科学,2014,42(10):2921-2923.[11]㊀王奇,范灿鹏,陈锟慈,等.三种磺胺类药物对罗非鱼肝脏组织中谷胱甘肽转移酶(GST)和丙二醛(MDA)的影响[J].生态环境学报,2010,19(5):1014-1019. [12]㊀徐军,马广智.臭氧对草鱼鱼种血液MDA GSH浓度以及GPX活性的影响[J].华南师范大学学报(自然科学版),2004,36(2):110-113.[13]㊀JARATLERDSIRI W,DEAKIN J,GODINEZ R M,et al.Comparative genome analyses reveal distinct structure in thesaltwater crocodile MHC[J].PLoS One,2014,9(12):e114631.[14]㊀吴凡,郭稳杰,詹柒凤,等.草鱼MHCI区基因的表达特征[J].华中农业大学学报,2017,36(5):60-66. [15]㊀许友卿,张青红,李颖慧,等.饲料中添加杜仲叶粉对青鱼生长和组织免疫相关基因表达的影响研究[J].农业现代化研究,2015,36(6):1074-1079.[16]㊀袁晓旭,杨明明,赵桂琴.郁金化学成分及药理作用研究进展[J].承德医学院学报,2016,33(6):487-489. [17]㊀张宝彤,张波,萧培珍,等.姜黄素对罗非鱼生长性能㊁血清生化指标及肠道组织形态的影响[J].中国饲料,2014(2):34-37.[18]㊀王春梅,李贺,陈建光.北五味子多糖对高脂血症大鼠血管内皮功能的影响[J].中药药理与临床,2013,29(3):100-103.[19]㊀王悦,贾李佳,韩蓓佳,等.新疆胀果甘草多糖对小鼠免疫功能促进作用研究[J].食品研究与开发,2016,37(7):41-43.(责任编辑:王新芳)。
环境胁迫对鱼类免疫机制影响的研究进展
《环境胁迫对鱼类免疫机制影响的研究进展》摘要：王艳玲赵金良赵岩摘要深入了环境胁迫对鱼类免疫反应机制影响针对目前鱼类免疫系统研究现状以及各环境胁迫因子下鱼类免疫指标变化般规律进行综述并今研究提供些方向，℃当环境温低0 ℃鱼体免疫应答反应下降明显[30];rb等[3]发现鱼类抗体水平适免疫临界温下达到峰值适宜温围抗体滴随温升高而增r[3]研究也证明了这结论说明温会影响鱼体特异性免疫;彭婷等[33]对罗非鱼（rr l）进行低温胁迫处理发现0 ℃与℃下脾脏系数差异显著即温影响了鱼体免疫器官发育;r等[3]发现循环水养殖系统高温胁迫导致西洋鲑（l lr L）外周血液性粒细胞增加、免疫球蛋白减少;L rv等[35]等发现鲤鱼（r ）（±05）℃低温条件下可增强对8l5靶细胞非特异性毒性细胞活性而（8±05）℃高温和（0±05）℃适温下其活性没有显著变化说明温会影响鱼体非特异性免疫，今以下几问题还有待深入研究（）鱼类适应不环境胁迫程参与应答免疫相关基因有哪些相应基因络调控机制是怎样;（）实际养殖环境因素复杂不环境胁迫因子共作用具有叠加作用对鱼类免疫机制影响也更复杂;（3）如何提高鱼类免疫力适应环境胁迫王艳玲赵金良赵岩摘要深入了环境胁迫对鱼类免疫反应机制影响针对目前鱼类免疫系统研究现状以及各环境胁迫因子下鱼类免疫指标变化般规律进行综述并今研究提供些方向关键词环境胁迫;免疫机制;影响近年随着工业发展和城市扩张水体环境明显恶化鱼类长期置身水环境对水体变化反应灵敏环境胁迫导致水产动物疾病甚至死亡事件频发养殖济损失巨这已成水产养殖行业面临巨挑战因研究如何提高抗病害能力增强鱼体免疫力减轻环境胁迫带不利影响是现下发展绿色水产养殖亟待重课题目前关环境胁迫对鱼类生理学方面影响已有较多研究胁迫因子对鱼类免疫基因及调控络研究相对较少就当今鱼类免疫系统研究现状以及环境胁迫下鱼类免疫指标变化规律进行综述鱼类免疫系统概述鱼类免疫系统主要由免疫器官及组织、免疫细胞和体液免疫因子三类所构成哺乳动物样鱼类主要通固有免疫和适应性免疫行使免疫防御、免疫稳、免疫监督功能以抵御外界病原微生物侵害保持鱼体环境相对稳定状态维持机体正常生命活动和生存发展[]鱼类免疫器官及组织鱼类免疫器官及组织较简单主要由胸腺、头肾、脾脏以及黏膜相关淋巴组织（L）等构成以往研究普遍认胸腺是鱼类枢免疫器官鱼类胸腺由淋巴细胞、原浆细胞以及其它游离充质细胞组成[]鱼类免疫应答主要责淋巴细胞成熟分化进而发挥细胞免疫功能卢全[]研究发现对正常龄草鱼实行饥饿胁迫其胸腺重量减少胸腺明显萎缩退化影响鱼体免疫功能头肾被认是鱼类初级外周免疫器官主要由淋巴组织构成如鲤（r r）[3]、四指马鲅（lr rl）[]、罗非鱼（l）[5]等它是免疫细胞发生、分化和增殖重要场所也是捕获抗原和产生抗体主要器官免疫应答程发挥协作用脾脏作鱼体次级外周免疫器官清除分子物质、促进抗体生成起着重要作用鱼类脾脏是红细胞、粒细胞等免疫细胞产生、贮存和成熟主要场所[6]黏膜相关淋巴组织（L）指鱼体不具备完整淋巴结构较分散淋巴生发心主要指皮肤、肠和鳃淋巴组织[7]鱼类免疫细胞免疫细胞是指直接或接参与免疫应答细胞主要分布免疫器官、组织液、血液和淋巴液鱼类免疫细胞主要包括淋巴细胞和吞噬细胞两类淋巴细胞（L）是鱼类数量较多类白细胞参与机体特异性免疫反应机体免疫应答起核心作用淋巴细胞对鱼类身生理状态变化和外界环境因子刺激十分敏感其细胞活性高低可以定程上反映机体免疫水平已证实鱼类淋巴细胞包括细胞和B细胞两类[8]硬骨鱼类淋巴细胞能产生免疫球蛋白B淋巴细胞不能产生免疫球蛋白淋巴细胞B淋巴细胞是体液免疫应答主要效应细胞头肾发育形成;淋巴细胞是细胞免疫主要效应细胞胸腺分化、增生、成熟吞噬细胞（g）是鱼类非特异性防御系统重要组成成分包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞等执行吞噬代谢功能般说鱼类通激活巨噬细胞和粒细胞表达增强机体免疫反应单核细胞是类普遍存所有硬骨鱼血液细胞具粘附吞噬功能[9]环境胁迫通常会导致单核细胞增多鱼类巨噬细胞种类繁多机体受到外刺激巨噬细胞可通识别并传递抗原、调节淋巴细胞活性及控制身增殖与分化等途径对机体免疫系统进行调控以保护机体不受损伤[0]粒细胞硬骨鱼分布较广泛根据、形态以及细胞颗粒染色特征可分嗜酸性、嗜性、嗜碱性三类张永安等认部分硬骨鱼仅有嗜酸性粒细胞极少数有嗜碱性粒细胞[0];周玉等认嗜性粒细胞是硬骨鱼类主要粒细胞而嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞存因鱼种类而异[]目前多数研究都是通观察免疫器官或组织免疫细胞形态和数量判断其免疫机能强弱krg等[]发现虹鳟遭受拥挤胁迫3周淋巴细胞数目明显减少斑叉尾鮰运输8 血液淋巴细胞和B淋巴细胞数目出现定幅下降孙红梅等[3]研究发现黄颡鱼长期饥饿影响下吞噬细胞数量减少鱼体免疫机能严重下降3鱼类体液免疫因子涉及生物免疫基因众多如7次跨膜超蛋白族成员（7）、Lr rg（G）、干扰素γ诱导蛋白（30）等7有助免疫功能调节和骨髓分化等生理程[];G催化苏氨酸（免疫球蛋白生成主要限制性氨基酸）分接影响机体免疫反应;30控制组织相容性复合体Ⅰ 和Ⅱ限制性抗原加工交叉递呈进而调节适应性免疫[5]张新尚[6]利用嗜水气单胞菌（rl）侵染斑马鱼发现br0基因有助调节鱼体固有性免疫信通路其编码蛋白质以3泛素连接酶形式调节机体免疫;陈松林[7]研究发现真鲷、牙鲆以及菱鲆抗菌肽基因、天然抗性相关巨嗜蛋白（R）基因等与机体抵抗病原体感染有关与高等哺乳动物相比鱼类主要依赖非特异性免疫抵御外界不良环境和病原侵害而非特异性免疫因子是鱼类非特异性免疫主要承担者鱼类非特异性免疫因子主要包括组织相容性复合体、溶菌酶、补体、干扰素等这些免疫因子已鱼类有着广泛而较深入研究鱼类主要组织相容性复合体（r bl lx）参与调节机体免疫激发机体特异性免疫反应免疫学上具有极重要义[8]Rrg等[9]鲤鱼胸腺、外周血液、肠检测到Ⅱβ基因表达该结定条件下也适用虹鳟[9]Kg等[0]应用RR技术分析免疫與非免疫西洋鲑Ⅱβ基因表达水平发现有较强组织特异性溶菌酶（lz）活力高低是衡量水生动物机体免疫功能指标鱼体溶菌酶活力和水平直接影响到鱼类免疫能力及健康状况有研究表明梭鲈（Lr lr）溶菌酶活力显著高河鲈（r lvl L）其抗病力更强[]般认鱼体急性胁迫状态下常表现血液溶菌酶水平升高王博等[]研究发现拥挤胁迫组呈现“”形趋势即胁迫初期草鱼处应激状态溶菌酶水平升高随延长鱼体产生定耐受性溶菌酶水平趋降低王晶等[3]指出免疫和免疫尼罗罗非鱼溶菌酶活性禁食胁迫7 显著下降免疫反应受到抑制补体（l）是鱼类抵抗外界不良生存环境重要成分存血清补体系统主要依靠途径、替代途径和凝集素途径被激活对金头鲷研究表明[]高密养殖环境显著降低了实验鱼替代途径补体活力致使机体免疫力下降另外等[5]指出补体3参与补体系统激活补体3身不具备活性只有化补体3或3b才能发挥作用研究发现鳟鱼3对吞噬细胞活动有定促进作用[6]3和3b发挥生物学功能形成包含补体9膜攻击复合物（）胡欣欣等[7]指出补体9与尼罗罗非鱼抗感染能力有极相关性干扰素（rr）是种高效非特异性免疫因子主要由巨噬细胞分泌鱼体抵抗不良环境程发挥重要作用余嘉欣等[8]研究发现尼罗罗非鱼γ干扰素R脾脏表达水平高其次是肠、鳃和肾无乳链球菌感染利用实荧光定量R技术检测到尼罗罗非鱼γ干扰素脾脏、鳃、肾表达上调了6～5倍说明不利环境下鱼类可通干扰素基因高表达增强机体免疫力环境胁迫对鱼类免疫系统影响定环境条件下由外界环境因素面影响使动物无法维持正常生理状态称环境胁迫（vrl r）也叫环境应激[9]胁迫可打破体与环境平衡状态从而导致鱼体生理机能紊乱使得鱼类免疫机能下降甚至死亡目前水产养殖业面临环境胁迫因素主要水温变化、溶氧、氨氮、盐碱等温鱼作变温动物对养殖水体温变化十分敏感水温变化和鱼体免疫机能关系已成当前热问题鱼类存免疫临界温且不种类鱼拥有不免疫临界温般说温水性鱼类免疫临界温较高冷水性鱼类则相对较低研究表明草鱼（rg ll）免疫临界温0 ℃当环境温低0 ℃鱼体免疫应答反应下降明显[30];rb等[3]发现鱼类抗体水平适免疫临界温下达到峰值适宜温围抗体滴随温升高而增r[3]研究也证明了这结论说明温会影响鱼体特异性免疫;彭婷等[33]对罗非鱼（rr l）进行低温胁迫处理发现0 ℃与℃下脾脏系数差异显著即温影响了鱼体免疫器官发育;r等[3]发现循环水养殖系统高温胁迫导致西洋鲑（l lr L）外周血液性粒细胞增加、免疫球蛋白减少;L rv等[35]等发现鲤鱼（r ）（±05）℃低温条件下可增强对8l5靶细胞非特异性毒性细胞活性而（8±05）℃高温和（0±05）℃适温下其活性没有显著变化说明温会影响鱼体非特异性免疫溶氧溶氧作外水质因子是水产动物生存发展重要限制因素合适溶氧是提高鱼体产量必要条件gl等[36]认养殖环境溶氧会影响舌齿鲈（rr lbrx）血清免疫球蛋白水平沈凡等[37]认慢性低氧胁迫会抑制黄颡鱼（lbgr lvr）免疫机能r等[]研究发现缺氧会显著抑制金头鲷头肾白细胞呼吸爆发活性降低其免疫力王博等[]研究发现慢性拥挤胁迫导致低氧胁迫下草鱼脾脏系数显著降低推测高密养殖环境可能引起养殖鱼类脾脏萎缩或退行性改变对机体免疫造成消极影响以上结表明鱼体免疫机能与水体溶氧含量密切相关低氧会抑制免疫使鱼类患病甚至死亡比例上升3氨氮氨氮胁迫是水环境胁迫种重要表现形式氨氮浓偏高会影响鱼类生长发育严重导致鱼类死亡陈长等[38]研究了短不氨氮浓对吉富罗非鱼（rr l）血清溶菌酶和补体3活性等非特异性免疫指标变化结表明氨氮浓高会降低鱼体免疫能力肖炜等[39]前者实验基础上进步研究了长低浓氨氮胁迫对吉富罗非鱼免疫影响发现30 实验组幼鱼血液白细胞数显著高对照组表明慢性氨氮胁迫会抑制吉富罗非鱼幼鱼非特异性免疫外韩春艳等[0]对奥尼罗非鱼急性氨氮胁迫实验发现随着胁迫延长实验组奥尼罗非鱼血清溶菌酶活力显著降低黎庆等[]发现慢性氨氮胁迫组实验鱼肝脏溶菌酶活性、头肾巨噬细胞吞噬指数和呼吸爆发显著降低说明高浓氨氮胁迫会抑制鱼体免疫应答盐、碱盐是水产养殖重要环境因素盐变化主要造成水产动物渗透胁迫进而引发应激盐升高或降低能引起非特异性免疫因子3、溶菌酶等变化彰显了水产养殖维持稳定环境重要性有研究指出急性低盐胁迫可引发军曹鱼（Rr ）稚鱼[]、许氏平鲉（b lgl）[3]溶菌酶活性升高体液免疫增强陈庆凯等[]认盐低会对黄姑鱼（b lblr）幼鱼血清免疫和抗氧化水平造成伤害童燕等[5]得出高盐胁迫抑制施氏鲟（r rk）幼鱼非特异性免疫机能结论王晓杰等[3]盐胁迫实验观察到溶菌酶活力胁迫达到峰值逐渐下降晏彤等[6]研究发现尼罗罗非鱼遭受盐刺激产生应激反应鱼体脾脏体积显著增且脾脏含有沉积颗粒异常巨噬细胞和性粒细胞增多对黄鱼进行鹽梯实验发现周各盐处理组溶菌酶活力存显著差异[7]碱是影响鱼类正常生长发育重要水质指标李祥等[8]研究发现高碱胁迫下异育银鲫（r r gbl）白细胞吞噬活性、血浆溶菌酶活性显著降低严重抑制其非特异性免疫功能Z等[9]分析了碱胁迫下尼罗罗非鱼（rr l）录组变化发现免疫相关基因差异表达显著;郭雯翡等[50]提出了构建抑制消减库方法通筛选有效功能基因发现盐碱胁迫下青海湖裸鲤（Gr rzlk）免疫相关基因表达下调3总结和展望目前多数环境胁迫对鱼类免疫机制影响研究结可概括环境胁迫会刺激鱼体下丘脑垂体肾组织轴导致血液皮质类固醇水平显著上升;环境胁迫引发抗氧化水平发生变化;环境胁迫可使鱼类免疫组织器官受损免疫细胞组成发生改变补体、溶菌酶等体液免疫因子活性受到影响今以下几问题还有待深入研究（）鱼类适应不环境胁迫程参与应答免疫相关基因有哪些相应基因络调控机制是怎样;（）实际养殖环境因素复杂不环境胁迫因子共作用具有叠加作用对鱼类免疫机制影响也更复杂;（3）如何提高鱼类免疫力适应环境胁迫对上述问题研究有助深入理鱼类应答和适应环境胁迫机制也推进水产绿色健康养殖提供科学依据参考献[]甘桢王蓓鲁义善等罗非鱼免疫学研究进展[]生物技术通报0（）339[] 卢全郭琼林草鱼出血病胸腺组织病理研究[]鱼病简讯989（0）775[3] 林光华林琼洪江等兴国红鲤血细胞发生研究[]南昌学学报（理科版）998（0）58+0[] 蓝军南温久福李俊伟等四指马鲅淋巴器官发育组织学观察[L]渔业科学进展9[00050]李彦江育林环境胁迫因子对鱼类免疫功能影响[]国兽医学报997（6）997[8] ó r g l rg br （r r L）[] & ll lg9933（）359[9] 周炳升李连祥银鲫白细胞及鳃颗粒细胞超微结构[]水生生物学报996（）883[0] 张永安孙宝剑聂品鱼类免疫组织和细胞研究概况[]水生生物学报000（3）6865[] 周玉郭场杨振国等欧洲鳗鲡外周血细胞显微和超微结构[]动物学报008（3）3930[] krg vrl r rvvl br rl r[]rr Bl989755[3] 孫红梅黄权丛波饥饿对黄颡鱼血液几种免疫相关因子影响[]连海洋学学报006（）30730[] Zg X X lrbr 7 rl br rgl ll l rgr br r ll[]b059（）35336[5] G Z gL X lr 30 b RRV rlr ll vr[]G0869[6] 张新尚鱼类R基因系统进化分析及免疫功能研究[]国农业科学院05[7] 陈松林海水养殖鱼类免疫相关功能基因克隆及其鱼类抗病育种应用潜力[]国动物学会比较分泌专业委员会二届国动物学会比较分泌学分会和发育生物学分会合学术研讨会论集国动物学会比较分泌专业委员会国动物学会比较分泌专业委员会0059[8] 张彦鱼类主要组织相容性复合体Ⅱ类基因结构与表达分析研究概况[]科技信息009（36）03[9] Rrg r Rb l l rr l r（rr r L）[]v l995;98396[39] 肖煒李宇徐杨等慢性氨氮胁迫对吉富罗非鱼幼鱼生长、免疫及代谢影响[]南方水产科学05（）887[0] 韩春艳郑清梅陈桂丹等氨氮胁迫对奥尼罗非鱼非特异性免疫影响[]南方水产科学00（03）75[] 黎庆龚诗雁黎明慢性氨氮暴露诱发黄颡鱼幼鱼谷氨酰胺积累、氧化损伤及免疫抑制研究[]水产学报0539（05）7873[] 冯娟徐力林黑着等盐变化对军曹鱼稚鱼相关免疫因子及其生长影响[]国水产科学007（0）05[3] 王晓杰张秀梅李涛盐胁迫对许氏平鲉血液免疫酶活力影响[]海洋水产研究0056（6）7[] 陈庆凯低盐胁迫对黄姑鱼幼鱼血清免疫和抗氧化性能影响[]海洋渔业036（6）565[5] 童燕陈立侨庄平等急性盐胁迫对施氏鲟皮质醇、代谢反应及渗透调节影响[]水产学报007（）38[6] 晏彤盐应激对尼罗罗非鱼免疫损伤及β葡聚糖缓作用研究[]华东师学08[7] g L L L l l lgl r lrg ll rkr r r r lr []qlr Rr067303[8] 李祥谢骏宋锐等水体胁迫对异育银鲫皮质醇激素和非特异性免疫影响[]水生生物学报rv br lgr G r00330065[50] 郭雯翡盐碱胁迫下青海湖裸鲤鳃抑制消减库构建及相关基因克隆[]上海海洋学0br rr rr r vrl r r r rb rr rr grl l x g r vr vrl r r rv r r r rrK rvrl r; ; （收稿日期000509）相关热词胁迫研究进展鱼类。
草鱼(Ctenopharyngodon idella)对亚硝酸氮、氨氮和温度胁迫的生理响应
草鱼（Ctenopharyngodon idella）对亚硝酸氮、氨氮和温度胁迫的生理响应草鱼是我国国内广泛养殖的一种淡水鱼类，但是在养殖过程常常会面对多种多样的环境胁迫而产生应激反应。
本研究通过在亚硝酸盐，氨氮和温度胁迫下草鱼几种应激反应相关基因的表达，初步探讨了环境胁迫下草鱼的生理响应。
1.亚硝酸盐胁迫对于草鱼（Ctenopharyngodon idella）sod和hsp90基因表达的影响在草鱼的养殖生产中，由于精养和工厂化养殖的扩大，水体中常含有较高浓度的亚硝酸盐。
本实验通过测定草鱼的24h半致死浓度，sod和hsp90的表达模式研究了草鱼在分子生物学水平上对高浓度亚硝酸盐暴露的响应。
经过半致死实验确定的亚硝酸盐24h LC<sub>50</sub>为445mg/L。
实验中草鱼被置于5个浓度的处理组中（50,87,151,263,400mg/L）,取肝脏，肠和鳃来测定sod和hsp90的表达情况。
经过高浓度的亚硝酸盐暴露处理， sod和hsp90的表达受到了显著的上调，但是在不同组织中的表达模式不同。
这些结果指出，高浓度的亚硝酸盐能够诱导应激蛋白的表达，并且sod和hsp90可以作为评估草鱼氨氮暴露水平的良好指标。
2.急性氨氮胁迫对于草鱼（Ctenopharyngodon idella）sod和hsp90基因表达及鳃部结构的影响本实验通过测定草鱼的24h半致死浓度，鳃的细胞结构以及sod和hsp90的表达模式研究了草鱼在组织学和分子生物学水平上对高浓度氨氮暴露的响应。
经过半致死实验确定的氨氮24h LC<sub>50</sub>为243mg/L试验中草鱼被置于5个浓度的处理组中（50,72,104,151,220mg/L）,之后取鳃组织进行组织切片分析，取肝脏，肠和鳃来测定sod和hsp90的表达情况。
经过高浓度的氨氮暴露处理，鳃组织的细胞排列和结构产生了明显的变化，并且sod和hsp90的表达受到了显著的上调，这些结果指出，高浓度的氨氮能够损害鳃部的细胞结构并且诱导应激蛋白的表达。
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（ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｉ ｓ ｈ ｅ ｒ ｉ ｅ ｓ ，Ｈ ｕ ａ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｗｕ ｈ ａ ｎ ４ ３ ０ ０ ７ ０，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｈ ｕ ｂ ｅ ｉ Ｃ ｏ ｌ ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｉ ｎ ｎ ｏ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ Ｆ ｒ ｅ ｓ ｈ ｗ ａ ｔ ｅ ｒ Ａ ｑ ｕ ａ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ，Ｗｕ ｈ ａ ｎ ４ ３ ０ ０ ７ ０，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ｅｆ ｆｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｎｉ ｔ ｒ ｉ ｔ ｅ ｏ ｎ ｔ ｈｅ ｎ ｏ ｎ－ － ｓ ｐｅ ｃ ｉ ｉｃ ｆ ｉ ｍｍ ｕ ｎｅ ｒ ｅ ｓ ｐｏ ｎｓ ｅ ｓ ｏ ｆ
Ｃｔ ｅ ｎ ｏ ｐｈ ａ ｒ ｙｎ ｇ ｏ ｄ ｏ ｎ ｉ ｄ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ
（ １ ．华 中农 业 大学水 产 学院 ，武 汉 ４ ３ ０ ０ ７ ０ ；
２ ．淡水水产健康养殖湖北省协 同创新 中心 ，武汉 ４ ３ ０ ０ ７ ０ ）
摘要 ：为探讨亚硝态 氮胁 迫对草鱼 （ Ｃ ｔ ｅ ｎ ｏ ｐ ｈ ａ ｒ ｙ ｎ ｇ ｏ ｄ ｏ ｎ ｉ ｄ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ ） 非特异性 免疫性 能的影响 ，将草 鱼 （ ０ ． １ ５±０ ． ０ ５ ｇ ） 分别暴露在 ０ ｍ ｇ ／ Ｌ 、０ ． ２ ｍ ＃Ｌ 、０ ． ４ ｍ ｇ ／ Ｌ 、０ ． ８ ｍ ｇ ／ Ｌ 、１ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ 、２ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ 、４ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ和 ８ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ的亚硝态氮
升 高 ，低 浓 度组 （＜１ ． ０ ｍｇ ／ Ｌ ） 在７ ｄ时恢 复至 对 照 水 平 。 关 键 词 ：草 鱼 （ Ｃ ｔ ｅ ｎ ｏ ｐ ｈ ａ ｒ ｙ ｎ ｇ ｏ ｄ ｏ ｎ ｉ ｄ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ ） ；亚硝 态 氮 ；非 特 异 性 免 疫 ；补 体 ；Ｓ Ｏ Ｄ；谷 胱 甘 肽 中 图分 类 号 ：Ｘ ５ ０ ３ ． ２ ２ ５ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文章 编 号 ：１ ０ ０ ０ — ６ ９ ０ ７ 一 （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ － ０ ０ ４ ０ － ０ ５
Ｃ ． ｉ ｄ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ（ ０ ． １ ５±０ ． ０ ５ ｇ ）ｗ ｅ ｒ ｅ ｅ ｘ ｐ ｏ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｅ ｉ ｇ ｈ ｔ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ｓ（ ０ ，０ ． ２ ，０ ． ４ ，０ ． ８ ，１ ． ０ ，２ ． ０ ，４ ． ０ ，ａ ｎ ｄ ８ ． ０ ｍｇ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｔ ｅ ｐ ｅ ｒ ｌ ｉ ｔ ｅ ｒ ） ． Ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ｃ ｏ ｍ ｐ ｌ ｅ ｍｅ ｎ ｔ Ｃ ３ ａ ｎ ｄ Ｃ Ａ，ｇ ｌ ｕ ｔ ａ ｔ ｈ ｉ ｏ ｎ ｅ（ Ｇ Ｓ Ｈ）ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ －
ｏ ｘ ｉ ｄ ｅ ｄ ｉ ｓ ｍ ｕ ｔ ａ ｓ ｅ（ Ｓ Ｏ Ｄ）ａ ｓ ｗ ｅ ｌ ｌ ａ ｓ＾ ｙ —ｇ ｕ ｔ ａ ｍ ｙ ｌ ｃ ｙ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎ ｅ ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ｅ ｔ ａ ｓ ｅ（ 一 Ｇ Ｃ Ｓ ）ｗ ｅ ｒ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｅ ｄ ａ ｔ ０ ｄ ，ｌ ｄ ，４ ｄ ａ ｎ ｄ ７ ｄ ｒ ｅ —
溶液 中，分别在暴露 后 ０ ｄ 、１ ｄ 、４ ｄ 、７ ｄ 测定 草鱼体内补体 ｃ ３和 Ｃ ４含量 、超氧化物歧化酶 （ Ｓ Ｏ Ｄ ） 活力 、谷胱
甘肽 （ Ｇ Ｓ Ｈ） 含量以及 一 谷 氨酰半 胱氨酸合成酶 （ 一Ｇ Ｃ Ｓ ） 活性 。结 果表 影响 ，其胁迫效应随着暴露浓度 的不 同而表现出不 同的特 性。 当暴露浓 度低于 １ ． ０ ｍｇ ／ Ｌ时 ，补 体 ｃ ３和 Ｃ ４含量维 持正 常水 平或 显著 升高 ；但 暴露 浓度超 过 １ ． ０ ｍｇ ／ Ｌ ，补 体 ｃ ３和 ｃ ４含 量水平 会显 著下 降。 Ｓ Ｏ Ｄ活性随着暴露时间而显著升 高 ，但 高浓度暴露使 Ｓ Ｏ Ｄ活性在暴露 ７ ｄ时显著下 降。＾ ｙ —Ｇ Ｃ Ｓ活性一般都 随着 暴露时 间延 长而显著升高 ，虽然暴露后期其活 性下 降 ，但还是 显著高 于对照组 。而 Ｇ Ｓ Ｈ含量 在暴露 ４ ｄ时 显著
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｅ ｖ ａ ｌ ｕ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｔ ｅ ｏ ｎ ｎ ｏ ｎ—ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ｉ ｍｍｕ ｎ ｅ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｓ ｅ ｓ ｉ ｎ Ｃ ｔ ｅ ｎ ｏ ｐ ｈ ａ ｒ ｙ ｎ ｇ ｏ ｄ ｏ ｎ ｉ ｄ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ ，
第４ ３卷
Ｖｎ １ ． ４ ３
第 ４期
Ｎｏ ． ４
淡
水
渔
业
２ ０ １ ３年 ７月
Ｊ ｕ ｌ ２ ０ １ ３
Ｆｒ ｅ ｓ ｈｗａ ｔ ｅ ｒ Ｆｉ ｓ ｈｅ ｒ ｉ ｅ ｓ
亚 硝 态 氮 胁 迫 对 草 鱼 非 特 异 性 免 疫 性 能 的 影 响
叶 俊 ， 肖 琛 ， 尹晓燕 ， 汤 蓉 ， 李大 鹏