陕北木枣基因组DNA提取方法研究_王延峰 - 副本 - 副本

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图 2 木枣不同取材部位基因组 DNA 的电泳检测 （1：嫩茎；2：韧皮部；3：叶芽；4：花瓣； 5：花蕾；6：嫩叶；M：DNA Marker 2）
3讨论
为获得高质量的 DNA，需减少其内源 Dnase 的 降解以及次生产物（色素、单宁、酚类）的干扰，应选 取合适部位的材料，适宜的采后保存方式以及较优 的提取方法。该研究表明，改良 CTAB 法对快速冷 冻材料的提取效果较优，且木枣不同取材部位中以 叶芽和嫩叶的提取效果最好。
湖南农业科学 2012，（17）：4~5，9
Hunan Agricultural Sciences
陕北木枣基因组 ＤＮＡ 提取方法研究
王延峰 1，贺晓龙 1，张艳丽 1，张向前 2，姚 尧 1
（1.延安大学生命科学学院，陕西 延安 716000； 2. 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西7] Long Y H，Xie L，Liu N，et al. Comparison of gut-associated and nest-associated Rmicrobial communities of a fungus-growing ter－R mite （Odontotermes yunnanensis）[J]. Insect Science，2010，17 （3）：265-276.
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第 17 期
龙海涛：CAP-trapper库，必须除去小片段双链 cDNA， 但能基因这一 主要目的，在保证插入片段长度的同时，需兼顾文 库的库容量。
2，6：酒精处理；3，7：新鲜叶片；M：DNA Marker 2）
解，溶液极粘稠，移液枪吸取困难，取量不准。该法 提取的快速冷冻、酒精处理、新鲜 3 种处理所得到 的基因组 DNA 经乙醇沉淀后均有不同程度的色素 残留，如酒精处理的为赭色，新鲜的为淡黄绿色，快 速冷冻的为乳黄色。且各加样孔较亮，这说明 SDS 法提取的 DNA 样品中可能含有较多的未被去除的蛋白质、多糖及一些其他次生代谢产物[6]。
1%的 β-巯基乙醇可以有效地阻止褐变发生， 完全可以制备高质量的 DNA，既经济又高效；3% CTAB 提取缓冲液可破碎细胞核，充分结合 DNA， 完全与蛋白质解离，离心时可充分与多糖等物质分 离，达到纯化分离 DNA 的目的[6]；2%SDS 提取液可 得到质量较高的 DNA，且 DNA 产率更高、更稳定； EDTA 是一种能抑制 DNA 酶活性，保护 DNA 不被 内源核酸酶降解的螯合剂，浓度过低或过高都会 导 致 DNA 降 解 或 破 损 ，EDTA 最 佳 使 用 浓 度 为 30～50 mmol/L[7]。因此，建议采用 SDS 提取缓冲液
关键词：木枣；SDS 法；改良 CTAB 法；基因组 DNA
中图分类号：S665.1
文献标识码：A
文章编号：1006-060X（2012）17-0004-02
Extraction Method for Extracting Total DNA from Muzao Jujube from Northern Shanxi
1.3 试验方法
1.3.1 改 良 Ｃ ＴＡ Ｂ 法 将 研 磨 的 干 粉 迅 速 转 入 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 预热的 CTAB 提 取缓冲液，充分混匀后于 65℃水浴中保温 30～60 min[1-3]。加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），缓慢颠倒混 匀，10 000 r/min 离心 10 min，重复抽提 1 次，取上 清液加 2 倍体积的－80 ℃预冷的无水乙醇轻轻摇 匀；－80 ℃静置 10 min，用无菌枪头挑出 DNA 转入 另一离心管中；无水乙醇洗涤 DNA 沉淀 2 次，冷风 吹干后溶于 50 μL TE 溶液中，加入 1 μL 10 mg/L RNaseA，于 37℃保温 60 min，4℃保存备用。 1.3.2 ＳＤ Ｓ 法［４－５］ 将研磨的干粉迅速转入 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 预热的 SDS 提取缓冲液， 充分混匀后于 65℃水浴中保温 30～60 min；加等体 积的氯仿∶异戊醇 （24∶1），缓慢颠倒混匀，6 000 r/min 离心 10 min；上清液再用氯仿∶异戊醇（24∶1） 抽提，8 000 r/min 离心 10 min，收集上清液再以氯 仿∶异戊醇（24∶1）抽提，10 000 r/min 离心 5 min；收 集上清液，加入 2 倍体积无水乙醇轻轻摇匀，无水 乙醇重复洗涤 DNA 沉淀 2 次，冷风吹干后溶于 50 μL TE 溶 液 中 ，加 入 1 μL 10 mg/L RNaseA，于 37℃保温 60 min，4℃保存备用。
1 材料与方法
收稿日期：2012-05-29 基金项目：陕西省教育厅自然科学基金（11JK0617）；延安市 科技局计划项目资助（2009kn-26） 作者简介：王延峰（1970-），男，陕西府谷县人，副教授，主要 从事生物技术研究。
1.1 材 料
1.1.1 供试材料 试验材料为陕北木枣的叶片、 叶芽、花蕾、花瓣、嫩茎、韧皮部，于 5 月采自延安 大学植物园，置于冰盒中带回。叶片分别采用新 鲜、-80℃快速冷冻、无水乙醇处理保存，其他材料 置于-80℃快速冷冻保存。 1.1.2 仪 器 与 试 剂 主 要 供 试 仪 器 ： 电 泳 仪 YJECP3000（北京君意东方），高速冷冻离心机（科 大创新），恒温水浴锅，Bio-Rad Gel 凝胶成像仪。试 剂：SDS 提取缓冲液 （2% SDS，500 mmol/L NaCl， 100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，1%β- 巯基 乙醇）；改良 CTAB 提取缓冲液（3%CTAB，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，30 mmol/L EDTA，1%β巯 基 乙 醇）；TE 缓 冲 液 （10 mmol/L Tris -HCl，1 mmol/L EDTA）；0.8%琼脂糖凝胶；DNA Marker。
2.2 木枣不同取材部位基因组 DNA 的提取
由图 2 可知，改良 CTAB 法对快速冷冻的枣树 各组织器官总 DNA 的提取，从 DNA 的产量上观 察，叶芽>嫩叶>韧皮部>花蕾>花瓣>嫩茎；在 DNA 条带的整齐度上，叶芽>韧皮部>嫩茎>嫩叶>花瓣> 花蕾；在总 DNA 降解程度上，花蕾、花瓣>韧皮部、 嫩茎>叶芽>嫩叶；在次生产物去除干净程度上，花 蕾、花瓣>嫩茎>叶芽、嫩叶、韧皮部。由此可见，不同 取材部位中以叶芽和嫩叶的提取效果最优。
重组效率、库容量、平均插入片段长重组率为 98.7%，库平均插入片段 约为 2.1 kb，插入片段全sing SDS method and improved CTAB method, total DNA was extracted from leaves of Muzao Jujube from
Northern Shanxi with different ways to preserve. Moreover, the efficient of extracting total DNA from different parts of Muzao jujube (leaf buds, flower buds, petal, ligneous phloem, tender stems and young leaves) were compared. The results showed that the total DNA extracted by improved CTAB method was the best when materials derived from leaf buds or young leaves stored at -80℃ , namely the performance for protein impurities interference less, DNA structure full and purity and productivity high.
1.2 试验设计
1.2.1 不同储存方式的木枣叶片基因组 Ｄ Ｎ Ａ 的 提取 分别取新鲜、快速冷冻、酒精处理的木枣叶 片各 0.1 g 放入灭菌预冷研钵中，加入液氮迅速研
第 17 期
王延峰等：陕北木枣基因组 DNA 提取方法研究
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磨成粉状。采用 SDS 法和改良 CTAB 法提取木枣叶 片的总 DNA。 1.2.2 木 枣 不 同 取 材 部 位 基 因 组 Ｄ Ｎ Ａ 的 提 取 在采用 SDS 法和改良 CTAB 法提取木枣叶片不同 储存方式总 DNA 的基础上，用改良 CTAB 法对木 枣不同取材部位（嫩茎、韧皮部、叶芽、花蕾、花瓣、 嫩叶）的总 DNA 进行提取。
Key words: Muzao jujube; SDS method; improved CTAB method; total DNA
红枣营养丰富，含多种维生素和矿物质，不但 可以食用，还可入药，深受人们喜爱。陕北木枣主要 产于黄河沿岸的宜川、延川、清涧、吴堡、佳县、神 木、府谷等县，由于土质独特，光照、气温、降雨量等 自然条件适宜，陕北木枣果大、肉厚、色红、味甜。在 枣树 DNA 提取上前人仅针对提取方法进行了大量 研究，但对于取材部位以及保存方式并无系统化的 比较研究。针对上述问题，采用改良 CTAB 法和 SDS 法提取木枣基因组 DNA，对获得高质量枣树 DNA 应选取的部位、保存方式以及最优提取方法 等进行了研究，以期为陕北枣种质资源的分子评 价，包括品种鉴定、分类研究、系谱分析、遗传图谱 鉴定、基因标记等提供参考。
[8] Warnecke F，Luginbühl P，Ivanova N，et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding high－ er termite[J]. Nature，2007，45（22）：560-569.