脯氨酸蛋白酶测定方法
蛋白酶的测定方法
蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定1、试剂配制①1%的酪素溶液：用 pH7.4 的 0.2M 磷酸盐缓冲溶液配制。
PH为7.4的0.2M磷酸盐缓冲溶液：0.2M 磷酸氢二钠（27.8g NaHPO4·2H2O溶于 1L 蒸馏水中）19ml 加 0.2M 磷酸二氢钾（53.65g KH2PO4溶于 1L 蒸馏水中）81ml 即成。
②0.1N 硫酸。
③20%硫酸钠。
④2%茚三酮液：2g 茚三酮溶于 100ml 丙酮。
⑤甲苯。
⑥甘氨酸标准溶液：取 0.1g 甘氨酸溶液水中，定容 1L，则得 1ml 含 0.02mg 氨基氮的标准液。
再稀释 10 倍做成标准液。
标准曲线的绘制：分别吸取工作液 1,3,5,7,9,13ml 移于50ml 容量瓶中，加 1ml 的茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。
在风光光度计上于 500nm 处比色测定颜色深度。
以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。
2、操作步骤称 4g 风干土，置于 50ml 三角瓶中，加 20ml1%酪素溶液和 1ml 甲苯，小心振荡后用木塞盖紧，在30℃恒温箱中培养 24h。
培养结束后，于混合物中加 2ml0.1N 硫酸和 12ml 20% 硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心 15min(6000 转/min)。
取上清液2ml，置于 50ml 容量瓶中，按绘制标准曲线显色的方法进行比色测定。
为了消除土壤中原来含有的氨基氮引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
蛋白酶活性，以 24 小时后1g 土壤中氨基氮的毫克数表示。
3、结果计算NH2-N(mg)=a×5式中 a——从标准曲线查的氨基氮毫克数5——换算成 1g 土的系数。
脯氨酸含量的测定
脯氨酸含量的测定脯氨酸是一种重要的氨基酸，由于其参与了生物体内多种代谢反应，因此在生物学、医学、食品科学等领域都具有重要的应用价值。
对于脯氨酸含量的测定，常用的方法主要有生物化学法、色谱法、质谱法等。
下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。
一、生物化学法生物化学法是一种常用的脯氨酸含量测定方法，其原理是利用苯酰亚胺与脯氨酸在强酸条件下的酰化反应，生成具有紫色色素的N-苯酰脯氨酸，可通过分光光度计测定其吸收光谱来确定含量。
1. 操作步骤：（1）样品制备将待测样品粉碎并过筛，加入盐酸或硫酸等强酸，混合均匀，常温下反应数小时，将反应溶液转移至滤袋中过滤，然后将滤液经旋转浓缩至干燥，加入适量的甲醇或氯仿等溶剂，振荡溶解，即可制备待测样品。
（2）标准曲线制备取不同浓度的脯氨酸标准溶液，分别进行相同的处理方法，制备不同浓度的标准溶液。
然后以标准溶液的吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（3）分光光度计测定将待测样品和标准溶液分别置于分光光度计中，以标准曲线为参照，通过测定吸收光谱来确定样品中脯氨酸的含量。
二、色谱法色谱法多用于测定含量较低的脯氨酸，其原理是利用离子交换色谱分离脯氨酸，在检测器中进行检测并计算。
将待测样品加入甲醇或氯仿等溶剂中，过滤经过滤纸，然后加入0.5N NaOH(或1N NaOH) 溶剂，混合并振荡，使脯氨酸完全转化为盐基态的氨基酸。
（2）色谱条件设置利用离子交换色谱柱，设置流速，根据需求设置检测器(如紫外检测器)，调整溶液的pH值、离子强度等，使得脯氨酸能够被完全分离。
（3）色谱分离及检测按照设定条件进行色谱分离，并在检测器中检测脯氨酸的吸收光谱，通过计算峰面积或峰高，来确定样品中脯氨酸的含量。
三、质谱法质谱法通常用于测定含量较低的脯氨酸，其原理是利用高分辨率质谱仪对样品进行荷质比分析，获得脯氨酸分子的荷质比和相应的亚分子和碎片离子，进而计算出样品中脯氨酸的含量。
将待测样品中的脯氨酸沉淀或提取出来，常用的提取方法包括利用乙酸酐等试剂进行衍生化处理。
测定脯氨酸药品配制及操作
测定脯氨酸药品配制及操作一、药品二、试验用具电子天平、烧杯、蒸馏水、容量瓶（250ml）1个、50ml容量瓶6个、试管6支（制作标曲应用）、水浴锅、试管若干、药品、标签、研钵、称量纸、注射器。
三、溶液配制酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解贮于冰箱中。
6mol/L磷酸：浓度为85%的磷酸大约是14mol/l，如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的2.3倍即可。
3%的磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
冰醋酸甲苯四、试验步骤1、标准曲线的制作(1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100 μg。
(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6 μg·ml-1。
(3)取6支试管，分别吸取2 ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2 ml冰醋酸和3 ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。
表2-5脯氨酸标准曲线表试剂 1 2 3 4 5 6系列Pro 溶液(mL) 2 2 2 2 2 2冰醋酸 2 2 2 2 2 2酸性印三酮溶液 2 2 2 2 2 2Pro 含量 2 4 6 8 10 12(4)冷却后各试管准确加入5 ml甲苯，振荡30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。
(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 ml测定液中脯氨酸的含量(μg·2 ml-1)。
脯氨酸测定方法
磺基水杨酸法
一：原理
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。
在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长 520nm 处有一最大吸收峰。
脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。
二：试剂
1：质量分数为3%的磺基水杨酸溶液
2：甲苯
3：2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和 6mol/L 磷酸以 3︰2 混合，作为溶剂进行配制，此液在 4℃下 2～3 日有效
4：脯氨酸标准溶液----用蒸馏水配置成100ug/ml（可以不用，看相对含量的高低就好）
三：方法
（1）脯氨酸提取取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入 5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提 10min。
（2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液 2ml，加 2ml 冰乙酸和 3ml 显色液，于沸水浴中加热 40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。
（3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下
式计算样品中脯氨酸含量的百分数。
脯氨酸（μg/g FW 或 DW）= CV/Wa
式中C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得；
V—提取液总体积（ml）；
a—测定时所吸取的体积（ml）；
W—样品重（g）。
*****标准曲线。
脯氨酸蛋白酶测定方法
脯氨酸内切蛋白酶的测定方法1定义：pH5.0 37℃条件下每分钟从Z-Gly-Pro-pNA释放1μM pNA所用的酶量为一个酶活力单位，以U表示。
2原理：脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase，PEP)能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶。
以Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺)为底物时，它水解脯氨酸羧基端肽键，生成Z-Gly-Pro和硝基苯胺，而硝基苯胺在410nm下的吸光值与其浓度在一定成范围内成正比，通过测定硝基苯胺的生成量来检测脯氨酸内肽酶的酶活力。
3试剂和溶液本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。
3.1 0.1M柠檬酸溶液：C4H2O7·H2O分子量为 210.14，0.1 mol/L溶液为21.01克/升。
秤取21.01克柠檬酸溶解在去离子水中并定容至1000ml；3.20.2M磷酸氢二钠：Na2HPO4·2H2O分子量为 178.05，0.2 mol/L溶液为35.01克/升。
秤取35.01克磷酸氢二钠溶解在去离子水中并定容至1000ml；3.3PH4.0缓冲溶液：将0.1M柠檬酸12.29ml与0.2M磷酸氢二钠7.71ml混匀。
3.4 4mM Z-Gly-Pro-pNA(N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺，分子量426.43，瑞士Bachem)，准确称取0.0171g Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺)，加入4ml二恶烷溶解，加入6mlPH4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解后即为PH5.0的底物溶液。
3.5 终止剂：0.2 mol/L碳酸钠溶液称取无水碳酸钠2.12g于烧杯中溶解，转至100mL容量瓶中定容。
4仪器和设备4.1 实验室常用仪器设备。
4.2 恒温水浴：（37±0.1℃）。
脯氨酸的检测方法
脯氨酸的检测方法Coca-cola standardization office【ZZ5AB-ZZSYT-ZZ2C-ZZ682T-ZZT18】脯氨酸的检测方法1. 原理样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm检测吸光度，并作空白对照实验。
2. 应用范围本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。
本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。
3. 试剂及仪器脯氨酸3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配）2-甲氧基乙醇蚁酸(96%)，即甲酸异丙醇（2-丙醇）水溶液：水：丙醇= 1：115ml旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉）分光光度计，检测吸光度设定在520nm下1cm 玻璃比色皿4. 样品准备苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20的水进行稀释。
其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L(见稀释表)。
浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。
蜂蜜的稀释，采用蜂蜜加50ml水。
将样品在分析之前离心5min左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。
原果汁稀释表样品类型稀释比例颜色空白期望值Apple 苹果1:1yes Apricot 杏21:1yes Aronia 野樱莓1:1yes Banana 香蕉1:1yes Blackberry 黑莓1:1yes Cherry 樱桃1:1yes Cranberry 蔓越莓1:1yes Grape 葡萄16:1yes Grapefruit 柚子21:1no Guava 番石榴3:1yesKiwi 泥猴桃1:1yesLemon 柠檬21:1noLime 酸橙21:1noMandarin 中国柑桔21:1noMango 芒果1:1yesNectarine 油桃21:1noOrange 柑桔21:1noPapaya 番木瓜1:1yesPassion Fruit 西番莲1:1yesPeach 桃6:1yesPineapple 菠萝1:1yesPlum 李子7:1yesPrune 西梅16:1yes5:1yesRaspberry 悬钩子（树梅）Strawberry 草莓1:1yesTangerine 橘子21:1noTomato 番茄1:1yes5. 标准溶液的制备脯氨酸贮备液（500mg/L）：脯氨酸加水定容至100ml。
脯氨酸的检测方法
脯氨酸的检测方法1. 原理样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm检测吸光度，并作空白对照实验。
2. 应用范围本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。
本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。
3. 试剂及仪器3.1脯氨酸3.2 3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（0.3g茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配）3.3 2-甲氧基乙醇3.4 蚁酸(96%)，即甲酸3.5 异丙醇（2-丙醇）水溶液：水：丙醇=1：13.6 15ml旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉）3.7 分光光度计，检测吸光度设定在520nm下3.8 1cm 玻璃比色皿4. 样品准备4.1苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20的水进行稀释。
其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L(见稀释表)。
浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。
蜂蜜的稀释，采用2.5g蜂蜜加50ml水。
将样品在分析之前离心5min左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。
4.2原果汁稀释表样品类型稀释比例颜色空白期望值Apple 苹果1:1 yes Apricot 杏21:1 yes Aronia 野樱莓1:1 yes Banana 香蕉1:1 yes Blackberry 黑莓1:1 yes Cherry 樱桃1:1 yes Cranberry 蔓越莓1:1 yes Grape 葡萄16:1 yes Grapefruit 柚子21:1 no Guava 番石榴3:1 yes Kiwi 泥猴桃1:1 yesLemon 柠檬21:1 noLime 酸橙21:1 noMandarin 中国柑桔21:1 noMango 芒果1:1 yesNectarine 油桃21:1 noOrange 柑桔21:1 noPapaya 番木瓜1:1 yesPassion Fruit 西番莲1:1 yesPeach 桃6:1 yesPineapple 菠萝1:1 yesPlum 李子7:1 yesPrune 西梅16:1 yesRaspberry 悬钩子（树梅）5:1 yesStrawberry 草莓1:1 yesTangerine 橘子21:1 noTomato 番茄1:1 yes5. 标准溶液的制备5.1脯氨酸贮备液（500mg/L）：0.0500g脯氨酸加水定容至100ml。
脯氨酸特效内切蛋白酶应用试验
Ｚ０ ２３ ２１ ４ ４ ４
６７ ． ７２ ． ７４ ．
２ｏ ２５ ４ ４
７４ ７２ ． ．
２９９ ５ ．３ ３６２ ｌ． ９．２ ９．ｌ １ ３ ． ３６６ ２１６ ３ ７ ５ ４
ｌ．８ ３ １ ３ ５ ３ ９ ２ １ ２９３ ．６ ．２ ．９ ．３ ｌ ．１ ｌ．８ ｌ．２ ｌ ．８ ｌ．７ ８６９ ３９ ８０ ２７ ７ ４ ６ ．９ ８ ．７ ７ ．５ ８ ．３ ８ ． ８３８ ２８ ８４ ３ ２ ０４
ｌ５｝ 】｝
ｌ 新 １｝ 拌 ｝ ０ ｌ ０ ０
１１ 脯 氨酸特效 内切 蛋 白酶添 加方 法 ： ．
原麦汁浓度（ ） 。 Ｐ
总酸 （Ｉ］ ｍ ） ｍＪＯ Ｌ Ｏ
９８ ｌ． ｌ．ｌ １． ｌ． ． ０３ Ｏ３ ０４ Ｏ３ ７ ５ ３ ８
１１ １２ １ １ １２ １２ ． ８ ．３ ． ． ２ ４ ． ４
程无菌）要求至少与 ８ ％的麦汁混合。 ， ０ １ 采用相同原料 ， ． ２ 同一条糖化线 ， 相同糖化工 岂 连续生产 ， 其麦汁指标见 （ １。 表 ）
表 １ 麦汁理化指标
实 组 验
罐 号 ９＃ ０ ｌ＃ １ ５
泡持性（ 秒）
苦 味值 （ｕ Ｂ） 总 氮（ Ｌ ）
将每锅麦汁需要的脯 氨酸特效 内切蛋 白酶， 用
１２ ：０比例 的无 菌 水稀 释 ， 麦 汁管 道 加 入 （ 加 过 在 添
色度（Ｂ ） ＥＣ 浊度（Ｂ ） ＥＣ
４６ ．
５４ ．
５５ ．
５６ ５６ ． ．
Ｏ３ Ｏ３ Ｏ２ Ｏ３ ０３ ．８ ．８ ． ８ ． ６ ． ５
对照组
实验组
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脯氨酸内切蛋白酶的测定方法
1定义：pH5.0 37℃条件下每分钟从Z-Gly-Pro-pNA释放1μM pNA所用的酶量为一个酶活力单位，以U表示。
2原理：脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase，PEP)能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶。
以Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸-
脯氨酸-硝基苯胺)为底物时，它水解脯氨酸羧基端肽键，生成Z-Gly-Pro
和硝基苯胺，而硝基苯胺在410nm下的吸光值与其浓度在一定成范围内成
正比，通过测定硝基苯胺的生成量来检测脯氨酸内肽酶的酶活力。
3试剂和溶液
本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。
3.1 0.1M柠檬酸溶液：C4H2O7·H2O分子量为 210.14，0.1 mol/L溶液为21.01
克/升。
秤取21.01克柠檬酸溶解在去离子水中并定容至1000ml；
3.20.2M磷酸氢二钠：Na2HPO4·2H2O分子量为 178.05，0.2 mol/L溶液为35.01
克/升。
秤取35.01克磷酸氢二钠溶解在去离子水中并定容至1000ml；
3.3PH
4.0缓冲溶液：将0.1M柠檬酸12.29ml与0.2M磷酸氢二钠7.71ml混匀。
3.4 4mM Z-Gly-Pro-pNA(N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺，分子量
426.43，瑞士Bachem)，准确称取0.0171g Z-Gly-Pro-pNA (N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨酸-硝基苯胺)，加入4ml二恶烷溶解，加入6mlPH4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解后即为PH5.0的底物溶液。
3.5 终止剂：0.2 mol/L碳酸钠溶液
称取无水碳酸钠2.12g于烧杯中溶解，转至100mL容量瓶中定容。
4仪器和设备
4.1 实验室常用仪器设备。
4.2 恒温水浴：（37±0.1℃）。
4.3 分光光度计：有10mm比色皿，可在410nm下测定吸光度。
4.4 磁力搅拌器。
4.5 酸度计：精确至小数点后2位。
5试验流程
5.1酶样的准备：
5.1.1 液体酶:直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。
5.1.2固体酶：称取适量于烧杯中(精确至0.0001g)，用少量水润湿并调成糊状，再用水溶解，离心上清液做适当稀释。
5.2活力测定步骤
按顺序加入以下试剂，严格控制反应时间
6活力计算
酶活力的计算：
U＝N×(ΔA÷min)×（V×106）÷（γ×V×β）
＝N×ΔA×153.4
U –酶活力
N—稀释倍数
ΔA/min--吸光度变化；
V一1.35，反应体系体积(m1)；
106一将mol换算成μmol；
γ-8800，消光系数(cm2／mol)；
v一0.1，样品量(m1)；
β一1，比色杯光程
注意：此方法对于DSM商品脯氨酸蛋白酶测定时的稀释倍数为1或2，即原液或稀释到2倍测定，ΔA吸光值在范围之内；对于发酵液可将酶液加量扩大到5～10倍，即0.5ml～1.0ml，进行测定，ΔA 吸光值在范围之内，计算活力时将酶液毫升数V带入公式计算即可，及V为0.5或1.0ml。