几种酶的测定方法
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理是通过测量酶催化下特定底物转化为产物的速率来反映酶的活性水平。
主要有以下几种常用方法：
1. 光度法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生有色产物或吸收物质，通过测量产物的吸光度变化来间接评估酶活性。
例如，过氧化物酶活性的测定可以使用过氧化氢和染色剂底物，通过测量产物有色化合物的吸光度变化来评估。
2. 放射性同位素法：将底物标记上放射性同位素，通过测量酶催化下放射性同位素的放射活性来确定酶活性。
例如，通过添加放射性标记的底物[^3H]葡萄糖，测量酶催化下的葡萄糖转化为[^3H]二氧化碳的速率来评估葡萄糖酶活性。
3. 荧光法：利用酶催化下底物与某些荧光试剂反应产生荧光物质，通过测量产物的荧光强度变化来评估酶活性。
例如，酸性磷酸酶活性的测定可以使用荧光底物4-甲基硝基苯磷酸，通过测量产生的荧光信号来评估酶活性。
4. 比色法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生可测定的颜色变化，通过测量产物的颜色强度来评估酶活性。
例如，硫酸酯酶活性的测定可以使用对硫酸酯类底物水解产生的有色产物对硝基酚，通过测量颜色强度来评价酶活性。
这些方法均基于酶催化下底物转化为产物的反应，并结合了不同的测定原理和技术手段来获取酶活性的定量数据。
生物化学检验中酶的测定综述
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
CK-MB
这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时
间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测 限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他 分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛 接受。 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门 的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基 因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。
由于同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不
同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等 方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的 分析和鉴定提供了理论基础。 临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精 确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶 的总活性和各同工酶组分的活性。
电泳法
在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最
CK-MB
是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测
定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度 （Mass）的方法。 CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗 CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、 FEIA等方法测定。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多
肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化 作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、 生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的 一组酶称为同工酶。 凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶， 而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶 或酶的多种形式。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
土壤五种酶的测定方法
参考文献：1、关松荫等，编著. 土壤酶及其研究法[M].农业出版社，1986.2、周礼凯，编著. 土壤酶学[M].科学出版社关松荫等，1986蔗糖酶：比色法(1) P274-276脲酶：比色法P294-297蛋白酶：比色法9(1) P302-304磷酸酶：磷酸苯二钠法(2) P312-313过氧化氢酶：容量法P323蔗糖酶比色法1、试剂(1) 苯甲酸溶液0.25%(2) 3,5-二硝基水杨酸(3) pH5.5磷酸缓冲液(4) 8%蔗糖溶液(5) 甲苯2、操作步骤5克风干土→50mL三角瓶→15mL 8%蔗糖溶液→5mL pH5.5磷酸缓冲液→5滴甲苯→摇匀放入恒温箱→37℃培养24h →取出迅速过滤→吸取滤液1mL →流水冷却3min →蒸馏水稀释至50mL →508nm比色3、结果计算蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。
葡糖糖（毫克）= a×4式中a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4——换算成1g土的系数标准曲线：以光密度为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标。
Y=0.229×（－0.0209）R２=0.9961注意：Y值为吸光度值，相当于表中的A平均X值为根据上述公式计算的结果，相当于a值葡萄糖含量为a* 4 （毫克）蛋白酶比色法（1）1.试剂（1）1%酪素溶液（2）0.1N硫酸（3）20%硫酸钠（4）2%茚三酮液（5）甲苯（6）甘氨酸标准溶液2.操作步骤4g风干土→50ml三角瓶→20ml1%酪素液→1ml甲苯→30℃恒温箱24h→2ml0.1N硫酸→12ml20%硫酸钠液→15min(6000转/min)离心→上清液2ml 50ml容量瓶→1ml茚三酮→沸水浴10min→蒸馏水稀释至刻度→500nm比色3.结果计算蛋白酶活性，以24h后1g土壤中氨基氮的毫克数表示。
NH2-N(mg)=a*5式中 a——从标准曲线查得氨基氮毫克数b——换算成1g土的系数标准曲线：以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标。
植物五种酶活性检测方法
欢迎阅读选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。
1、多酚化酶（Polyphenoloxidase ，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g ）,料液比1:2，加入内含5%PVP （w/v ）经遇冷的pH 为7.2的柠檬酸-，取上取 1.2ml （（37℃恒合液。
0.01为2离心20min 取酶提取液0.2ml ，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min ，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。
PAL 的酶活性以每小时在290nm 处吸光度变化0.01OD 为一个活力单位。
3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase ，LOX )活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。
4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。
Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。
4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[取2-3ml5分ΔA470积（ml，5取（含1%PVP12h。
1000r/min离心20min,得到酶初提液。
取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。
取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。
（测定30s读数一次，5分钟）。
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
酶的测定方法
酶的测定方法
酶是一种生物大分子，能够催化生物化学反应。
酶的测定方法有多种，如下：
1. 活性测定法
酶的活性是指每单位时间内酶所催化的反应物的转化量。
通过活性测定法可以测定酶的活性，常用的方法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。
2. 蛋白含量测定法
酶是一种蛋白质，因此可以通过测定酶的蛋白含量来间接测定酶的含量。
常用的蛋白含量测定方法包括比色法、光度法等。
3. SDS-PAGE电泳法
该方法利用SDS-PAGE电泳将酶分离出来，然后通过染色等方法测定酶的含量。
4. 免疫学方法
该方法利用酶的抗原性质，通过抗体结合酶来测定酶的含量或活性。
常用的方法包括ELISA等。
总之，不同的酶测定方法适用于不同的酶以及不同的实验目的，选择合适的方法可以提高实验的准确性和可靠性。
- 1 -。
酶活测定原理
酶活测定原理酶活测定是通过测定酶反应产物生成的物质量或反应速率来确定酶活性的一种方法。
这种测试被广泛应用于生物、医学、环境和食品科学领域。
本文将重点介绍酶活测定的原理和方法。
一、酶的定义和分类酶是一类具有催化生物反应能力的蛋白质，在生物体内担任调节代谢过程的重要角色。
酶的活性被认为是其特异性、选择性和效率的关键因素。
酶根据其催化反应类型，可以分为六类：1. 氧化还原酶：例如过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，可以将还原剂氧化成相应的氧化物。
2. 转移酶：例如乙醛酸酯酶和谷氨酰胺转移酶，可以将一个基团从一个分子转移到另一个分子。
3. 加水酶：例如酯酶和葡萄糖苷酶，可以加入水分子切断化学键。
4. 合成酶：例如DNA聚合酶和RNA聚合酶，可以将单体结合成聚合物。
5. 裂解酶：例如蛋白酶和纤维蛋白溶解酶，可以降解大分子化合物。
6. 引导酶：例如酰基载体蛋白，可以在代谢过程中向该蛋白基团上结合或从该基团上解离。
二、酶活测定的原理酶活性通常通过测量酶反应的速率来评估。
酶反应速率与底物浓度、酶浓度、反应温度和pH值等条件有关。
在酶活测定中，这些条件必须被控制和标准化。
测量酶活性可以通过直接测量酶反应产物生成的量或测量反应底物消耗的量来进行。
下面介绍常用的酶活测定方法。
1. 进行光学密度测定酶活测定可以通过光学测量来实现。
在酯类水解反应中，酶催化酯水解为醇和羧酸。
在这种反应中，测量分离的醇透过率或吸光度变化，可以计算出相应的反应产物含量。
这种方法可以适用于其他酶反应，例如测定酒精脱氢酶催化的乙醛氧化反应。
2. 进行电化学测定另一种常用的酶活测定方法是电动势测定。
该方法用于测量电位差的变化以检测酶催化反应过程中电子的流动。
在氧化还原酶催化的反应中，测量体系中的电位差可以告诉我们酶的活性程度。
3. 进行放射性测定有些酶活性测定需要使用放射性示踪剂。
在DNA聚合酶催化下进行DNA复制实验中，可以使用放射性示踪剂来测量酶反应产物的数量。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶.本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑〔NBT〕在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收.而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成.于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高.据此可以计算出酶活性大小.二、材料、仪器设备与试剂〔一〕材料；水稻或小麦叶片〔二〕仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯〔反应试管处照度为4000Lx〕；5.试管或指形管数支.〔三〕试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液〔pH7.8〕；2. 130mmol/L 甲硫氨酸〔Met〕溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存.三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片〔视需要定,去叶脉〕0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml.取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液.2. 显色反应取5ml指形管〔要求透明度好〕4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂〔酶〕用量〔ml〕终浓度〔比色时〕0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min〔要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长〕.3. SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度.四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性.SOD总活性＝<A ck－A E>×V/<A ck×0.5×W×V t>上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积〔ml〕Vt测定时样品用量〔ml〕W样鲜重〔g〕蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重. SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：〔V=3ml〕磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3mlNBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：<1> 0.05mol/L PBS：pH7.8<2> 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml<3> 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml<避光保存><4> 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml<5> 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml<避光保存>注：〔1〕对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管<2> 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：〔1〕5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml〔2〕0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：〔1〕0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A<0.2mmol/L的HAc溶液>—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中〔2〕0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中〔临用前配制〕〔3〕0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml〔临用前配制〕方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液〔5min值为500-800即可〕—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：<1> 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕 <2> 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：<1>以不加H2O2的50mmol/L的PBS〔pH7.0〕为空白把A240调零<2>50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时—1min后在240nm下比色,1次/1min<连续读取5min>.20XX06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水.称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管〔做三个重复〕,加入25ml浓度为80％的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度,以80％的丙酮液为空白.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36〕也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰649Cx.c=<1000D470-2.05Ca-114Cb>/2452 抗氧化酶活性的定：〔2.5g样〕0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.8〕溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134〕. 取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液〔pH=7.8〕〔最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液.2.1丙二醛〔MDA〕的测定：20％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕；0.5% 硫代巴比妥酸〔TBA〕溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸〔TBA〕,用20％三氯乙酸〔TCA〕溶液溶解并定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕〔先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解〕；0.5ml酶液〔对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液〕〔做三个重复〕+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却〔至少30min〕――比色〔OD600、OD532、OD450〕.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕2.2超氧化物歧化酶〔SOD〕的测定：NBT<400ml>混合反应液:392mlPBS<Ph=7.8>,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液〔100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素〕.〔另配〕100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml<根>或0.02 ml<叶>粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度.2.3过氧化物酶〔POD〕的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.0〕溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml.0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS> + 0.02ml？？〔原来为0.01〕酶液〔根加0.05ml酶液〕〔对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液〕〔做三个重复〕,记录470nm处OD降低速度.将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕比色时加酶液,混合后即刻计时.2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量〔ml〕00.10.20.40.60.81.0H2O〔ml〕1.00.90.80.60.40.20冰乙酸〔ml〕2222222显色液〔ml〕3333333脯氨酸含量〔µl〕012468100.5ml酶液〔对照用0.5ml 80％乙醇代替〕〔做三个重复〕+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520.2.5可溶性蛋白的测定〔参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》〕牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml.90％乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水.？？？85％〔W/V〕磷酸：170ml磷酸+ 30ml蒸馏水.考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中,加入85％〔W/V〕磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L.常温下可保存一个月.标准曲线的制作：配制0～100µg/ml血清白蛋白血液管号123456100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.020.040.060.080.10配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液管号789101112100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.20.40.60.81.00.1ml 酶液〔做三个重复〕+ 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色.2.6过氧化氢酶〔CAT〕的测定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到500ml.1 ml 0.3%H2O2溶液+ 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定240nm处OD降低速度.将每分钟OD 减少0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕2.7 抗坏血酸〔ASA〕的测定：〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125〕5％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml.10％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml.150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液的配制：100ml.44％H3PO4溶液的配制：250ml.4％2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml.3％FeCl3溶液的配制：100ml.首先标制作准曲线.粗酶液的提取：取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入15m 5％三氯乙酸〔TCA〕溶液〔最好是较冷的三氯乙酸〔TCA〕溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸〔ASA〕含量的测定.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕测定：0.2ml 粗酶液+ 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液+ 0.2ml H2O,混匀〔振荡〕,至少30秒后,再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸〔TCA〕溶液+ 0.4 ml 44％H3PO4溶液+ 0.4 ml 4％2,2-二联吡啶溶液+ 0.2ml 3％FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕2.8 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料+ 2ml 0.3mol/L醋酸汞+ 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水〔每次10ml〕在摇动情况下冲洗2次.向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液,混匀,离心.上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗.离心后溶液与第一次离心液合并.向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/L KIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止.1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽.〔参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院##植物生理研究所编〕.2.9天冬酰胺合成酶〔AS〕的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶〔AspAT〕的测定：3 硝酸还原酶<NR>的测定采用离体法：〔1g样〕〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29〕亚硝酸钠标准溶液〔1µg/ml〕：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml.0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml.3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml.1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中.0.2％a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中.0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液.0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到1L.提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液. 2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液〔临用前配制〕. 首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液.摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色.以亚硝态氮〔μg〕为横坐标〔x〕,光密度值为纵坐标〔y〕绘标准曲线或建立回归方程.各试剂加入顺序管号1234567亚硝酸钠标准液<ml>00.20.40.81.21.62.0蒸馏水<ml>2.01.81.61.20.80.401％磺胺溶液<ml>44444440.2%α-萘胺<ml>4444444每管含NO2- <μg>00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶<NR>的测定.0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混匀〔对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替〕,在25℃水浴中保温30min.保温结束后立即加入1ml 磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.2％a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度.根据回归方程计算.。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
各种酶的测定方法:
土壤脲酶测定方法（靛酚比色法）
根据脉酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。
试剂配制：
1.甲苯（分析纯）
2.10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中。
（当天做当天配）
3.柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化
钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2升。
4.苯酚钠溶液：A.62.5克苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，
用乙醇稀释至100毫升。
B.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。
将二溶液保存在冰箱里。
使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5.次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。
（次氯酸钠活性氯
浓度为5.2%）。
标准溶液：
称0.4717克硫酸铵（105 °C烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。
将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。
分别吸取0、0.5ml、1.5ml、2.5ml、
3.5ml、
4.5ml、
5.5ml、
6.5ml、
7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加入试剂，最后定容至50 毫升使溶液浓度为：0、0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。
分析步骤：
称2~5克过20目风十土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好，15分钟后加10毫升10%尿素和20毫升pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在30C 恒温箱中培养24小时，过滤。
取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50毫升刻度试管中，加入4毫升苯酚钠溶液和3毫升次氯酸钠溶液，边加边摇匀。
20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色杯）。
反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。
每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。
还需减去无土基质（尿素+柠檬酸盐）。
结果计算：
月尿酶活性以24小时内每克土中氨态氮的毫克数来表示。
NH3-N （mg/1g 土24h）=（浓度X稀释倍数X比色体积）：（1000X十土重）
1000为ug换算成mg
土壤磷酸酶的测定（磷酸苯二钠测定法）
本法测定是以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的作用下，用水解基质所生成的苯酚的量来表示酶的活性。
试剂配制:
1.甲苯（CR）
2.①pH5醋酸盐缓冲液：（酸性土壤）
A：0.2N醋酸溶液：称取1.776克冰醋酸和9.58克醋酸钠溶解，加蒸馏水定容到1000毫升。
B：0.2N氢氧化氨溶液：取含25%〜28%的氨水14.02毫升稀释至500毫升。
取A、B溶液各250毫升用蒸馏水定容至1000毫升。
②pH7柠檬酸盐缓冲液：（中性土壤）
A：0.1M柠檬酸溶液：称21.01克柠檬酸溶于1000毫升蒸馏水中。
B：0.2M 磷酸氢二钠溶液：Na2HPO4*7H2O53.63 克或Na2HPO4*12H2O71.7 克稀释至1000毫升。
取A溶液64毫升，B溶液436毫升稀释至1000毫升。
③pH10硼酸盐缓冲液：（碱性土壤）
A：0.05M硼砂溶液（Na2B4O710・H2O）称取19.05克硼砂溶于1000毫升蒸馏水中。
B：0.2M氢氧化钠：8克氢氧化钠溶于1000毫升蒸馏水中。
取A溶液50毫升，B溶液43毫升，加水稀释至200毫升。
3.pH9.8氨性氯化氨溶液：称取20克氯化氨溶于100毫升浓氨水中，储存在橡皮塞瓶中，保存于冰箱。
4.0.5%磷酸苯二钠（Na2C6H5PO4・2H2O）：称5克磷酸苯二钠溶于1000毫升缓冲
液。
5.2%4-氨基安替匹林：称取2克4-氨基安替匹林，先用少量水溶解，最后稀释
至100毫升，浑浊时用滤纸过滤后使用。
（一周内有效）
6.8%铁氤化钾溶液：称8克铁氤化钾溶于少量水，定容至100毫升，储存在棕
色瓶中。
（一周内有效）
酚的标准溶液：
a.原液配制：0.5克重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至500毫升，储存于棕色瓶中，浓度即为1000ppm。
b.工作液配制：取2.5毫升原液稀释至250毫升，即浓度为10ppm，储存于棕色瓶中。
分别取工作液0、1、3、5、7、9、11、13、15毫升于50毫升容量瓶或50 毫升比色管中，50毫升溶液的浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0ppm试剂与测定相同。
分析步骤：
称过20目的风干土2克于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好瓶塞，15分钟后加0.5%磷酸苯二钠溶液20毫升（对照直接加20毫升缓冲液），摇匀并置37°C恒温培养24小时，培养结束后立即过滤。
吸滤液1~5毫升于50毫升容量瓶（或比色管）中，加入0.25毫升氨性氯化氨，0.5毫升2%4-氨基安替匹林和0.5毫升8%铁氤化钾溶液，边加边摇匀，15 分钟后定容，在波长510毫微米处比色。
（用1厘米比色杯，显色后1.5小时内稳定）
每一土样设置用水代替基质的对照，还需减去无土基质。
结果计算：
磷酸酶活性以24小时1克土酚的毫克数表示
酚（mg/1g 土, 24h）= （土样浓度X分取倍数X比色体积）：（1000X十土重）1000：ug换算成mg
（蔗糖酶）土壤转化酶测定方法
原理：转化酶水解蔗糖生成了葡萄糖和果糖，葡萄糖将3, 5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，用比色法测得葡萄糖生成量，以此来表示酶的活性。
试剂：
①3, 5-二硝基水杨酸溶液：0.5克3, 5-二硝基水杨酸溶于20毫升2NNaOH溶液和50毫升水中，加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100毫升，倒入棕色瓶中，并放入冰箱中保存。
②8%蔗糖溶液：分析纯蔗糖8克溶于100毫升蒸馏水中。
③甲苯
④磷酸缓冲液：（1）称取23.88克分析纯磷酸氢二钠（Na2HPO4・12H2O）溶于少量水中，定容至1升，即为1/15克分子浓度溶液。
（2）称取9.072克分析纯磷酸二氢钾溶于少量水中，定容至1升，即为1/15克分子浓度溶液。
（3）分别从（1）中吸取600毫升（2）中吸取400毫升混合即为pH7.0磷酸缓冲液。
（土壤理化分析P544）标准溶液：从1000ppm标准葡萄糖溶液中分别吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0毫升溶液放入25毫升比色管中即得0、20ppm、40ppm、80ppm、120ppm、160ppm、200ppm、240ppm、320ppm、400ppm 标准系列溶液。
与土样同法做。
测定步骤：取2.00克过20目筛的风干土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，15分钟后加入8%的蔗糖溶液15毫升，加磷酸缓冲液5毫升，于37^保温箱中培养24小时后过滤。
取1~2毫升滤液于25毫升比色管中，加3毫升3，5-二硝基水杨酸溶液，在沸水浴中煮沸5分钟，然后立即放入冷水中冷却，在分光光度计550毫微米处比色。
同时做无基质土壤（甲苯+蒸馏水15毫升+磷酸缓冲液5毫升）和无土基质土壤即试剂空白（甲苯+蔗糖溶液15毫升+磷酸缓冲液5毫升）为对照进行比较。
结果计算：
葡萄糖（mg/g十土• 24h）= （C*稀释倍数*25）/ （1000*十土重）C：还原糖的浓度（mg/L）
多酚氧化酶活性采用邻苯三酚比色法
多酚氧化酶主要来自土壤中的真菌、细菌和植物根系。
取1g 土于50ml容量瓶中，注入10ml浓度为1%的邻苯三酚，将瓶中混合物摇匀，30度培养3h，往瓶中加乙醚到刻度，用力摇多次，使生成的红紫梧精萃
取到乙醚相里，当含量高时，重复萃取至乙醚无色，将所有萃取液合并，定容到一定体积，然后在430nm处比色，同时设水空白和不加土的对照。
萃取液里的红紫培精的量，根据标准曲线查知。
多酚氧化酶活性以每100g 的红紫培精的mg数来表示。
标准曲线的制作：
标准溶液为重铭酸钾的溶液。
准确称取0.75g重铭酸钾溶于1L0.5N的盐酸中，这个浓度的溶液相当于10ml乙醚中含有1mg红紫培精，以此溶液为基础，稀释多倍，比色，作标准曲线。
过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定
该酶的测定原理是基于注入土壤的过氧化氢在反应后的剩余量来测的。
取2g 土于125ml三角瓶，注入40ml蒸馏水和5ml0.3%的过氧化氢，250r/min震荡20min，然后加入5ml的3N的硫酸，过滤，取25ml滤液用0.1N的高猛酸钾溶液滴定，消耗的高锰酸钾量（人）一用于滴定土壤滤液的高锰酸钾量（B），差值X 高猛酸钾滴定度的校正值T，即过氧化氢酶的活性为：（A—B）X T，以每g 土的0.1N高猛酸钾的ml数来表示，1N=1mol/L X离子价数。
0.1N高猛酸钾的滴定度用草酸钠标定，0.3%的过氧化氢用30%的过氧化氢1：100用蒸馏水来稀释。