白细胞分类计数(手工法)
白细胞分类计数参考方法
ICS备案号：WS白细胞分类计数参考方法Reference leukocyte differential count method（报批稿）中华人民共和国卫生部 发布目次前言 (Ⅲ)1范围 (4)2总则 (4)3方法 (4)3.1 样本采集 (4)3.2 血涂片制备和要求 (4)3.3 血涂片染色 (4)3.4 需分类的外周血有核细胞 (5)3.5 血涂片检查步骤 (5)3.6 检验人员要求和考核 (6)附录A（规范性附录）常见外周血白细胞形态学 (7)附录B（规范性附录）计算公式 (9)附录C（规范性附录）自动白细胞分类计数的性能评价 (10)参考文献 (16)前言为了保证白细胞分类计数结果具有溯源性和准确性，特制定本标准。
本标准修改采用了美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁发的《白细胞分类计数参考方法和仪器评价方法》标准（H20-A）。
本标准从20XX年XX月XX日起实施。
本标准的附录A、附录B和附录C都是规范性附录。
本标准由卫生部医政司提出。
本标准由上海市临床检验中心负责起草。
本标准主要起草人：胡晓波、许蕾、宋颖、方心驰、张锦锋。
本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。
白细胞分类计数参考方法1 范围本标准规定了建立白细胞分类计数参考方法中有关样本采集、血涂片制备的要求、血涂片染色、血涂片有核细胞检查的步骤、对检验人员的要求和考核等内容。
本标准适用于建立白细胞分类计数参考方法的实验室2 总则2.1 本标准采用手工目视显微镜计数法作为白细胞分类计数的参考方法。
2.2 为了保证参考方法检测结果的精密度和准确性，建立参考方法的实验室必须进行比对。
3 方法3.1 样本采集将静脉血采集于EDTA－K2抗凝剂（液体或粉末状）中（浓度为每毫升血液含1.5～2.2mg EDTA－K2·H2O）。
采血后立即混匀，应拒绝分析有肉眼可见凝块的样本。
3.2 血涂片制备和要求3.2.1 血涂片制备3.2.1.1 每份样本制作3张血涂片。
白细胞
白血病： 症状、体征 骨髓、肝、脾、淋巴结变化
无显著的感染表现 有相当数量的幼稚细胞 血象 往往有红细胞和血小板数量的变化
看WBC检查结果的方法：
1、WBC总数的变化是由某种或某些WBC 的变化引起的，本身无明确临床意义。 2、主要依据各种WBC数量变化，来推断 其临床意义。
感染性疾病的实验诊断程序
棒状小体（Auer小体）
2. 嗜酸粒细胞 ( eosinophil， E) ：
反应性增加：主要见于过敏性疾病、寄 生虫感染、猩红热等 异常增生性增加：慢粒 3. 嗜碱粒细胞( basophil ， B) ： 增加（过敏、慢粒、转移癌）
某男为中药房制剂师，经常从事药材粉碎 加工等工作，近来常感气短，阵发性哮 喘、咯大量黏液痰。
核右移
异型淋巴(空泡型)
异型淋巴--不规则型
异型淋巴--幼稚型
异型淋巴细胞
单核细胞
(monocyte,M)
白细胞计数与分类计数
白细胞计数：white blood cell count (WBC)
分类计数：differential count (DC) （一）临床应用： 感染、白血病、安全用药监护等 （二）标本采集：注意生理性变化的影响
（三）方法、原理
M+ E-
1.手工法
某女，半年前确诊为甲亢，一直口服他巴 唑治疗。
最近一次复查的血液分析仪检验结果为： RBC 4.0×1012 ／ L ， Hb 120g ／ L ， Hct 0.36，MCV90fl，MCH30pg，MCHC 333g ／ L ， RDW 14% ， WBC 3.2×109 ／ L ， LCR 42%，MCR 13%，SCR 45%，PLT 135×109／L。
白细胞手工计数
校正公式：白细胞校正数/L =X×
公式中：
X：未校正前白细胞数
Y：在白细胞分类计数时，计数100个白细胞的同时计数到的有核红细胞数。
6. 参考值
成人：
男 （~）×109/L
女 （~）×109/L
儿童：
（8~10）×109/L
婴儿：
（11~12）×109/L
新生儿：
20×109/L
7. 临床意义：
增加：பைடு நூலகம்
7.1.1生理性增加：新生儿、妊娠晚期、分娩期、月经期、饭后、剧烈运动后、冷水浴后及极度恐惧与疼痛等
7.1.2病理性增加：大部分化脓性细菌所引起的炎症、尿毒症、严重烧伤、传染性单核细胞增多症、急性出血、组织损伤、手术创伤后、白血病等。
减少：病毒感染、伤寒、副伤寒、黑热病、疟疾、再生障碍性贫血、极度严重感染、、X线照射、肿瘤化疗后和非白血性白血病等。
1. 原理
规范操作程序，提高检验结果的准确性和可比性。
2. 试剂
白细胞稀释液：冰乙酸2ml，蒸馏水98ml，10g/L亚甲蓝溶液3滴，混匀过滤后备用。
3. 标本处理：
用EDTA-K2真空采血管采集静脉血，采集完毕立即轻轻颠倒混匀。或者用微量吸管采集末梢血。
4. 方法
取小试管1支，加白细胞稀释液。
用微量吸管准确吸取血样20μl，擦去管外多余血液，将吸管插入小试管中稀释液的底部，轻轻将血放出，并吸取上清液清洗吸管两次，混匀。
×101个大方格容积为μl，换算为μl
×20血液稀释倍数
×106由1μl换算成1L.
5. 注意事项
小试管、计数板需保持清洁，以免杂质、微粒等被误认为细胞。。
白细胞计数白细胞计数与白细胞分类计数讲稿
骨髓异常增生
白血病时，可有一种或几种白细胞 增加，伴有原始、幼稚细胞、形态 异常或出现异常结构。
有时也会因细胞成熟及释放障碍使 周围血白细胞减少和形态异常。
（3）应激
如大出血、大面积组织损伤（烧伤、心 肌梗死、挤压伤等）、中毒、大量血细 胞破坏等，由于应激，多导致中性粒细 胞增加甚至核象改变。而应激又经常导 致嗜酸性粒细胞减少。
（2）在检验医师正式签发的血液检查报告 单中，白细胞手工分类结果为：Nsg 86%， Nst9%，L5%。中性粒细胞内有中毒颗粒 及空泡变性，还有中性晚幼粒细胞1%。
该血象说明了什么？
2.某女，半年前确诊为甲状腺机能亢进，一 直口服他巴唑治疗。最近一次复查时，血 液检验结果为：
RBC4.0×1012／L，Hb120g／L，Hct0.36， MCV90fl，MCH30pg，MCHC333g／L， RDW14%，WBC3.2×109／L，LCR42%， MCR13%，SCR45%，Plt135×109／L。 血片上红、白细胞、血小板形态基本正常。
（1）该血象是否异常？可能原因是什么？ （2）若明确诊断，还需与哪些疾病鉴别？ （3）是否有必要进行白细胞手工分类？预
期结果如何？ （4）对该病人的情况应如何处置？
3.某男，16岁，因“感冒、发烧”静脉点滴 青霉素和病毒唑，3天后不见好转。
手工法白细胞检查结果为：WBC6.2×109 ／L， 中 性 分 叶 核 粒 细 胞 5 2 % ， 单 核 细 胞 4%，淋巴细胞44%。改用“菌必治”5天 后症状无缓解，且出现咽部疼痛、乏力等 症状，查体咽部充血、扁桃腺Ⅰ度肿大。
2.电阻抗法白细胞计数及分群
3.其他分析技术（VCS、激光法、
白细胞分类计数(手工法)SOP
白细胞分类计数（手工法）SOP文件编号: xxxx医院 XXXX临床检验实验室版序:xxxx页码:第1 页，共5 页白细胞分类计数(手工法)[测定原理]把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，用复合染料构成的染色液染色，血片中的细胞由于内容物不同，而被染成不同的颜色，根据各类白细胞形态特征予以分类计数，得相对比值(百分率)，以观察数量)形态和质量的变化，对疾病有辅助诊断意义。
[试剂及仪器](一)染色液1. 瑞氏—姬姆萨复合染色液I液取瑞氏染粉 lg、姬姆萨染粉0.3g，置洁净研钵中，加 2 ML丙三醇和少量甲醇(分析纯)，研磨片刻，吸出上层染液。
再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上清液。
如此连续几次，共用甲醇500ml。
收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各振摇3min，共5天，以后存放一周即能使用。
?液 pH6.4—6.8磷酸盐缓冲液磷酸二氢钾(无水)6.64g磷酸氢二钠(无水)2.56g加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整 pH，加水至1000ml。
2(快速染色液I液:磷酸二氢钾 6.64g磷酸氢二钠 2.56g水溶性伊红 Y 4g(或伊红 B2.5g)蒸馏水 1000ml石炭酸 40ml煮沸，待冷备用。
?液亚甲蓝 4g蒸馏水 1000m1蒸馏水 1000m1高锰酸钾 2.4g煮沸，待冷备用。
文件编号: xxxx医院 XXXX临床检验实验室版序:xxxx页码:第2 页，共5 页白细胞分类计数(手工法) 3(30s快速单一染色液贮存液瑞氏染粉 2.0g姬姆萨染粉 0.6g天青 E 0.6g甘油 10.0ml聚乙烯D比咯烷酮(PVP) 20.0g(或曲拉通X-100 3ml)甲醇 1000ml磷酸盐缓冲液(pH6.2-6.8)磷酸二氢钾 6.64g磷酸氢二钠 0.26g石炭酸 4.0ml蒸馏水加至 1000ml应用液l液、2液按3:1比例混合放置14天后备用。
(二)显微镜。
(三)计数器。
[标本的采集]取手指血或静脉血1.0ml，置于抗凝管中(2%EDTAK2)摇匀待检。
一、白细胞计数(White Blood Cell count WBC)及白细胞 ...
四大格所见WBC平均值 判断标准： WBC ≤4×109/L ,RCS ＜30% WBC (4.1--14.9)×109/L, RCS ＜20% WBC≥ 15×109/L, RCS ＜15%
三、变异百分率(v)评价法
V= I Xi-Xm l ×100
中性粒细胞neutrophil：
2）中性粒细胞增多（neutrophilia）：
反应性： 急性感染或炎症 严重的组织损伤或坏死 急性溶血、急性失血 急性中毒 恶性肿瘤
异常增生性：白血病 骨髓增殖性疾病
3）中性粒细胞减少（neutropenia）：
感染 血液系统疾病 理化损伤 单核-吞噬细胞系统功能亢进 自身免疫性疾病
（二）白细胞分类计数
淋巴细胞lymphocyte：
★淋巴细胞
1）增多（lymphocytosis）： 感染性疾病 淋巴细胞性恶性疾病 其他 ：免疫性疾病、急性传染病恢复期 相对增多 2）减少（lymphocytopenia）： 相对减少 绝对减少（接触放射线、应用肾上腺皮质激素、
DC percent（%） Absolute value（ ×109/L）
二、白细胞计数及分类计数的临床意义：
1．白细胞数量的变化： （1）生理变化：
年龄、时间、环境、身体状况等 （2）病理变化：
leukopenia leukophilia 主要受中性粒细胞等各类细胞数量的影响
（二）白细胞分类计数
Cellular morphology
一． The lymphocyte is smaller than neutrophil and possesses an ellipsoidal, slightly eccentrical nucleus.
血涂片制作与白细胞分类计数
淋巴细胞
1.细胞大小为7～15µm。 2.细胞核与细胞浆比率 为5:1～2:1。 3.细胞呈圆形或卵圆形。 4.细胞核通常呈圆形或 卵圆形；偶见核凹陷或 轻度切迹。 5.核染色质散在致密或 粗颗粒状聚集；副染色 质无或少量。 6.无核仁；有时，可见小的、淡的核小体。 7.细胞浆少至中等量；淡蓝色至中度嗜碱性；可见核周淡染区； 有时有副核窝；小淋巴细胞无颗粒；大淋巴细胞的细胞浆较多， 含少数粗大嗜天青颗粒。
单核细胞
1.细胞大小为12～20µm。 2.细胞核与细胞浆比率 为4:1～2:1。 3.细胞呈圆形，可有伪足。 4.细胞核形态各异，呈圆 形、卵圆形、马蹄形、 切迹形或分叶形。 5.核染色质轻度聚集。 6.无核仁。 7.细胞浆含蓝灰色颗粒，少量空泡。
1.手工涂片法
取一滴血滴于洁净无油脂的玻片一端. 左手持玻片，右手再取边缘光滑的另 一玻片作为推片。将推片边缘置于血 滴前方，然后向后拉，当与血滴接触 后，血即均匀附在二玻片之间。此后 以二玻片约呈30—45度的角度平稳地 向前推至玻片另一端，推时角度要一 致，用力应均匀，即推出均匀的血膜 （血膜不可过厚、过薄）。将制好的血
（4）用蒸馏水冲洗（如自来水的pH值稳定于7.2左 右时亦可代用）。冲洗血膜时应将玻璃片持平， 冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸 取水分迅速干燥，即可镜检。
血涂片的染色步骤：
判断染色结果：红细胞
淡红色，无核的圆形细胞，因红细胞为双凹形，故边缘部 分染色较深，中心较浅，直径7-8微米。
颗粒白细胞
•
2.细胞呈圆形或卵圆形。
•
细胞核分叶，叶间有丝状
•
连接，分为2～5叶。
•
3.核染色质聚集。
•
4.无核仁。
白细胞计数计算步骤
白细胞计数计算步骤白细胞计数是一项常见的医学检验项目，用于评估人体免疫系统的功能和检测疾病。
白细胞是人体免疫系统的主要组成部分之一，通过对白细胞数量的计算，可以提供重要的健康参考指标。
下面将介绍白细胞计数的具体步骤。
一、前期准备进行白细胞计数需要一些基本的实验室设备和试剂。
首先，需要一个血液标本，可以是采集自患者的静脉血或者是其他合适的来源。
此外，还需要抗凝剂，用于防止血液在采集后凝结。
实验室技术人员需要确保标本的采集和储存符合规范，避免任何外部因素对结果的影响。
二、样本处理在进行白细胞计数之前，需要先对血液标本进行样本处理。
通常，最常用的方式是将血液标本进行稀释，以提高结果的准确性。
稀释液可以采用盐水或其他合适的稀释液。
将血液标本和稀释液按照一定比例混合，得到适当稀释的样本。
三、计数方法有多种方法可用于白细胞计数，常用的有手工计数和自动计数两种方法。
下面将分别介绍这两种方法。
1. 手工计数手工计数是一种基本的方法，需要使用显微镜和血液计数室。
首先，将稀释后的标本吸入血液计数室中，并等待一段时间，以使白细胞在计数室中沉淀。
然后，使用显微镜对计数室中的细胞进行观察和计数。
通常，需要随机选择数个视野并计算细胞的数量，然后取平均值作为结果。
2. 自动计数自动计数是一种高效且准确的方法，通过自动化设备进行细胞计数和分类。
在这种方法中，稀释后的标本被放入自动计数仪器中。
仪器将自动进行细胞计数和分类，然后给出结果。
自动计数具有快速、高通量和准确性高的优点，且消除了人为误差的影响。
四、结果解读得到白细胞计数的结果后，需要进行正确的解读。
白细胞计数的正常范围通常在每立方毫米血液中4,000到11,000个细胞。
不同的检测方法和实验室可能会有轻微的差异，因此应该参考具体的实验室参考值进行解读。
如果白细胞计数超出正常范围，可能表明存在某种疾病或感染。
在这种情况下，通常需要结合其他检验结果和临床症状来做出准确的诊断。
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(5)核棘突：胞核有各种形态的芽状突出，临床意义尚不明确，可能与中毒、癌转移、严重放射损伤等有关。
3．退行性变：表现为胞体肿大，结构模糊，边缘不清。胞核可呈固缩、肿胀、破碎、溶解等变化，退行变可以是细胞衰老死亡的表现。
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临床检验实验室
文件编号：
DGCPH-CL-SOP-07-04
白细胞分类计数（手工法）
版序：2005-1
页码：第3页，共5页
（2）．快速染色液染色
把干燥血片浸入快速染色液的I液中30s，水洗，再浸入Ⅱ液30s，水洗待干。
注：本染色法除了能快速用于急症外，对玻片质量要求也不高。随着染液多次使用，可适当延长染色时间或更换新液。
[试剂及仪器]
（一）染色液
1.瑞氏—姬姆萨复合染色液
I液取瑞氏染粉lg、姬姆萨染粉0.3g，置洁净研钵中，加2 ML丙三醇和少量甲醇(分析纯)，研磨片刻，吸出上层染液。再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上清液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各振摇3min，共5天，以后存放一周即能使用。
b．组织损伤：大手术后、心肌梗塞、肺梗塞等。
c．恶性肿瘤：急、慢性白血病、淋巴瘤等。
d．各种中毒：尿毒症、糖尿病酸中毒等。
减少见于：a．某些传染病：流感、伤寒、付伤寒、麻疹。
b．某些血液病：再障、粒细胞缺乏症、白细胞减少症。
c．化疗或放疗后，抗癌药物，X线及镭照射。
d．其它：脾功能亢进，自身免疫性疾病，高度恶病质。
中性杆状核粒细胞（N）：1-5%
中性分叶核粒细胞（N）：50-70%
嗜酸性粒细胞（E）：0．5-5%
嗜碱性粒细胞（B）：0-1%
淋巴细胞（L）：20-40%
单核细胞（M）：3-8%
[临床意义]
（1）中性粒细胞（N）中性粒细胞具有游走性和吞噬作用。
增高见于：a．急性感染和化脓性感染：肺炎、败血症、脓肿等。
蒸馏水1000m1
蒸馏水1000m1
高锰酸钾2.4g
煮沸，待冷备用。
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白细胞分类计数（手工法）
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3．30s快速单一染色液
贮存液
瑞氏染粉2.0g
姬姆萨染粉0.6g
天青E 0.6g
甘油10.0ml
聚乙烯D比咯烷酮(PVP) 20.0g
Ⅱ液pH6.4—6.8磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾(无水)6.64g
磷酸氢二钠(无水)2.56g
加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ml。
2．快速染色液
I液:
磷酸二氢钾6.64g
磷酸氢二钠2.56g
水溶性伊红Y 4g(或伊红B2.5g)
蒸馏水1000ml
石炭酸
煮沸，待冷备用。
Ⅱ液
亚甲蓝4g
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文件编号：
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(2)核右移：是指不仅分叶核粒细胞增多，且分叶过多，常见4叶、5叶(正常时多分3叶)，这是造血功能衰退或造血物质缺乏的表现。常见于营养性巨幼细胞性贫血和使用抗代谢药物后。此外，在疾病进行期突然出现核象右移，表示预后不良。
b．某些血液病：单核细胞性白血病、淋巴瘤、骨髓异常增殖综合症、恶性组织细胞病。
减少一般无临床意义。
[常见的异常白细胞形态的变化]
在外周血象中，除了各类白血病幼稚细胞外，通常能见到一些细胞形态上的异常变化。
(一)中性粒细胞
1．核象变化：反映中性粒细胞的成熟程度。正常血象中有少量杆状核细胞出现，它与分叶核细胞之间的比值约占1：13。
（2）嗜酸粒细胞（E）：嗜酸粒细胞与变态反应有关，并有吞噬抗原抗体复合物的作用。
增多见于：a．变态反应性疾病：支气管哮喘、药物过敏、荨麻疹、血管神经性水肿、过敏紫癜。
b．寄生虫病：蛔虫病、钩虫病、血吸虫病。
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[操作步骤]
1．采血后推制厚薄适宜的血膜片，血膜应呈舌状，头.体.尾清晰可分。
2．推好的血膜在空气中晃动，以促使快干。天气寒冷或潮湿时，应于37 C温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。
3．染色：
（1）.瑞氏—姬姆萨复合染色液染色
置玻片于染色架上，滴加染液3—5滴，使其迅速盖满血膜，约1min后，滴加缓冲液5一10滴，轻轻摇动玻片或对准血片吹气，与染液充分混和，5一10min后用水冲去染液，待干。
版序：2005-1
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c．某些皮肤病：湿疹、牛皮癣、剥脱性皮炎等。
d．某些血液病：慢粒、恶性淋巴瘤、嗜酸性粒细胞性白血症、多发性骨髓瘤、何杰金氏病等。
减少见于：a．应用糖皮质激素、促肾上腺皮质激素。
b．伤寒、副伤寒等病患者。
（3）嗜碱性粒细胞（B）嗜碱性粒细胞主要参与特殊的免疫反应。
(二)淋巴细胞
淋巴细胞形态变异在多种疾病如各种病毒感染、传染性单核细胞增多症最为常见。此外，疟疾、过敏性疾病、淋巴结炎等亦可见，统称为异型淋巴细胞。传染性单核细胞增多症患者血液中常可出现3种异型淋巴细胞，即空泡型、不规则型和幼稚型。
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白细胞分类计数（手工法）
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[测定原理]
把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，用复合染料构成的染色液染色，血片中的细胞由于内容物不同，而被染成不同的颜色，根据各类白细胞形态特征予以分类计数，得相对比值（百分率），以观察数量﹑形态和质量的变化，对疾病有辅助诊断意义。
(或曲拉通X-100 3ml)
甲醇1000ml
磷酸盐缓冲液(pH6.2-6.8)
磷酸二氢钾6.64g
磷酸氢二钠0.26g
石炭酸4.0ml
蒸馏水加至1000ml
应用液
l液、2液按3：1比例混合放置14天后备用。
（二）显微镜。
（三）计数器。
[标本的采集]
取手指血或静脉血1.0ml，置于抗凝管中（2%EDTAK2）摇匀待检。或直接未梢取血涂成血片。
2．毒性变化：严重感染、恶性肿瘤、各种重金属或药物中毒、大面积烧伤等症时，中性粒细胞可出现形态变异。
(l)细胞大小不均：为骨髓内幼稚粒细胞发生不规则的分裂增殖所致。
(2)毒性颗粒：胞浆中部分或全部颗粒变粗，着色深，颗粒的分布及大小不等。可能为中性颗粒成熟过程中发生变性所致。
(3)空泡：可在胞浆或核中出现，常为多个，被认为是细胞脂肪变性后未能着色所致。
(1)核左移：是指杆状核细胞增多，常见于感染。如晚幼粒、中幼粒等细胞增多为核象极度左移，多见于类白血病反应或白血病。
①伴白细胞总数增高的核左移：称再生性左移，常见于急性化脓性感染，如大叶性肺炎等。
②白细胞总数不增加或减低的核左移：称退行性左移，常见于严重感染、机体抵抗力低下时，如伤寒、伴感染中毒性休克的败血症等。
（3）．30s快速单一染色液染色
将染液铺满血膜或将血片浸入染色缸内，30s后用自来水冲洗。
注：加表面活性剂PVP可增加染料的溶解度并起稳定作用，加入天青E可缩短染色时间。
4．选择涂片的体尾交界处染色良好的区域，在油镜下计数100个白细胞，按其形态特征进行分类计数，求出各类细胞所占比值（百分率）。
[参考范围]
增多见于：a．慢性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病。
b．某些转移癌及骨髓纤维化。
嗜碱粒细胞减少无临床意义。
（4）淋巴细胞（L）：淋巴细胞能产生和运载抗体，在防御病毒感染方面有重要作用。
增多见于：a．某些病毒或细菌所致的传染病：传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、传染病恢复期、结核病、百日咳。
b．淋巴细胞性白血病、白血性淋巴肉瘤。
减少见于：a．应用肾上腺皮质激素、接触放射线。
b．细胞免疫缺陷病、某些传染病的急性期。
（5）单核细胞（M）：单核细胞具有游走性和吞噬作用，除吞噬细胞和异物外，又能吞噬原虫及具有类脂质包膜的结核杆菌及麻风杆菌。
增多见于：a．某些感染：伤寒、结核、疟疾、黑热病、亚急性细菌性心内膜炎。