高效液相色谱法基本原理

高效液相色谱法基本原理

一、实验目的

1. 了解高效液相色谱法分离的基本原理；

2. 了解高效液相色谱仪的基本构造；

3. 了解高效液相色谱仪的基本操作。

二、基本原理

高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。

高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。

高效液相色谱分析原理：

（一）高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

（二）高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分Ｂ的分配系数介于Ａ，Ｃ之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

三、系统构成

1.主机：Waters Allance 2695高效液相色谱仪,分为①分离单元Allance2695；②紫外－可见检测器2487；③荧光检测器2474；④示差折光检测器2414。

2.操作控制系统：DELL Dimmsen 4550微机；Waters Millunnium32 V4.0 色谱管理器软件。

3.打印机：HP LaserJet 1000激光打印机。

四、实验步骤

1. 系统开机准备

（1）接通电源。

（2）打开电源，预热相关的检测器，其中紫外检测器(2487)需要预热30分钟以上；荧光检测器(2474)需要预热1小时以上；示差折光检测器(2414)需要预热至少24小时。

（3）打开高效液相色谱仪主机的电源。

（4）启动微机。

2. 操作步骤

（1）运行Millunnium32软件，登陆用户。

（2）Millunnium32软件窗口进行检测方法和测量参数设定，如梯度法或者自行设定检测方法、流动相的组分及比例、测定波长、洗脱时间等。

（3）输入样品名称、注释及操作者姓名。

（4）将空白样品分别放入参比池和样品池，校准用户基线。

（5）将样品放入样品池,开始测量。

（6）打开数据处理页面，进行数据处理。

（7）保存数据。

（8）检测下一个样品。

3. 系统关机清理

（1）关闭高效液相色谱仪主机及各检测器的电源。平常待机时，示差折光检测器(2414)无须关机，只要降低泵流速至0.1mL/min，使其继续保持平衡稳定即可。

（2）退出Millunnium32软件。

（3）关闭计算机。

（4）抽下电源插座，切断电源。

（5）作好仪器使用记录。

（6）清理实验室，打扫卫生。

五、实验注意事项

1. 严禁未经培训人员上机操作。

2. 无关人员不得进入仪器操作室。

3. 不得在仪器操作室内做与光谱检测无关的事情。

4. 认真阅读使用说明，精心操作。

5. 详细记载实验的检测项目及数据文件名。

6. 打扫实验室卫生，关好水电门窗，离开实验室。