实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告

A
25
为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测
A
26
定量和定性测定的结果报告
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则 是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的 确认诊断。
定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范 围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷 贝数/ml或阴性。
1/log2=-3.32
如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =1/log1.5=-5.68
A
21
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
此种计算模式下，斜率 A必≤-3.32。
截距B则为原始模板趋 向于0亦阴性标本检测的 Ct 值，因此，一个实时 荧光PCR，如果设定的 扩增循环数为40，则其 截距B即应≥40。
A
12
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。
A
13
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
利用已知起始拷贝 数的外部标准品可 做出标准曲线，在 现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐 标为Ct值，横坐标 为起始拷贝数，少 部分以纵坐标为起 始拷贝数，横坐标 为Ct值。
A
5
基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
A
6
基本概念
扩增效率E（amplification efficiency） 扩增
效率指的是一个循环后的产物增加量与这个循 环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在 PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为 指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时 PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算
扩增效率过低。
A
17
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
重新重理（4）式
Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E )
可得：
LogX = -Ct×Log ( 1+E ) +
Log YCt
(5)
A
18
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐 标为Ct值时的数学模型
根据Y= AX+B，（5）式中的Y = LogX，X = Ct，A = -Log ( 1+E )，B = Log YCt
A
28
谢谢！
A
29
在扩增达到阈值线时，此时，n = Ct，于是，扩增产物的量为： YCt = X ( 1+E )Ct (2)
YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设 定以后，它就是一个常数。（2）式两边同时取对数，得：
Log YCt = LogX ( 1+E )Ct (3)
亦即：Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E ) （4）
系列稀释的标准品最好是RNA，也可以是双链DNA片段、单链 DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与RNA标准品相 比，DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录 没有关系，不能反映逆转录效率。
A
8
基本概念
相对定量（Relative quantitation） 在相对定 量中，标本中特定mRNA的测定是建立在外标 或参比样本（校准品）的基础上的。当使用校 准品的时候，定量测定结果可表示为靶RNA/ 校准品比值。有多种数学模型可用来计算相对 定量测定的平均正态化的基因表达。使用不同 的数学模型所得到的结果和标准差均会有所差 异。表5-1比较了不同的数据处理方法及其解 释。
实时荧光定量PCR检测 的数据处理及结果报告
卫生部临床检验中心 李金明
A
1
基本概念
线性基线期 (Linear base-line phase) 为PCR扩增的四个主 要阶段之一（图）。线性基 线期为扩增最初的10~15个循 环，此时，PCR反应处于起 始阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，因此， 基线荧光信号可根据此阶段 产生的荧光信号来计算。
A
9
A
10
基本概念
标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。
参比（Reference） 用于对检测结果进行标准 化的被动（Passive）或主动（Active）信号。 如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性 参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性参比 有其自己的引物和探针。被动性参比则为非 PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的 非PCR波动。
A
3
基本概念
指数期（Exponential phase） 为PCR扩增的四 个主要阶段之一（图）。 PCR达到其最大的扩增阶 段，理想条件下，每一循 环后，PCR产物倍比增加。
A
4
基本概念
平台期（Plateau phase） 为PCR扩增的四个主要阶 段之一（图5-1）。扩增 达到平台期，此时，荧光 信号不再随扩增循环数的 增加而增加。
A
16
基本计算公式的推导
如果扩增效率为100%，亦即E=1，扩增反
应管中原始拷贝数为10，扩增产物达到
1000分子拷贝，则预计的Ct
=
1 log
（2 Log
1000
-Log
10）=
1 log
2
×2
=
6.64。因此，如
果已知原始模板拷贝数为1，扩增产物达
1000分子拷贝时，其Ct <6.64较多，则说明
A
2
基本概念
指数期初期 （The beginning of exponential phase） 为 PCR扩增的四个主要阶段之 一（图）。进入扩增指数期 初期，荧光强度达到一个阈 值，该阈值通常为基线荧光 信号均值标准差的10倍。扩 增达到阈值时的循环数可称 为CT（ABI Prism有关文献） 或CP（LightCycler有关文 献）。CT或CP与原始扩增模 板数量正负相关，可通其与 原始模板的函数关系，来计 算原始模板的数量。
截 为距 Ct值B =趋L向og于Y0C时t ，的其原与始阈模值板线拷的贝选数定的直对接数相值关。，应
A
19
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
A
20
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
LogX = -Ct×Log ( 1+E ) + Log YCt (5) 可变换为:
Ct =( -1/log(1+E)) Log X +Log YCt / log(1+E) (7) A= -1/log(1+E), B= Log YCt / log(1+E) 如果扩增效率为1（100%），则斜率A =-
A
11
基本概念
内源性内标（Endogenous control） 为一个出现在每 一个实验样本中的特定RNA或DNA，通过使用内源性 内标这种主动性参比，对于加入到每一个反应中的总 RNA量的差异，其可以校正靶mRNA的定量。
外源性内标（Exogenous control） 为一个以已知浓 度加入至每个样本中的特性确定的RNA或DNA，外源 性主动性参比通常为体外构建的，可作为内阳性质控 以鉴别由PCR抑制所致的假阴性。外源性参比也可用 来校正样本提取或cDNA逆转录合成的效率。
可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值 与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一 条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该 直线斜率）即可计算出E值。
A
7
基本概念
绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列稀释 的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标 准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法 的准确度和线性范围内。
A
14
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
只要获得未知标 本的Ct值，即可 从标准曲线上计 算出该标本的起 始拷贝数，这是 采用外标进行实 时荧光PCR绝对 定量的基本原理。
A
15
基本计算公式的推导
Yn = X ( 1+E )n (1) 其中，Yn 为第n个循环后扩增产物的量，X为原模板数，E为 扩增效率，n为扩增循环数。
定性测定结果报告:报告“阳性”或“阴性”, “检出” 或“未检出”, “反应”或“未反应”
A
27
报告中所应具备的信息
标题，例如“检测报告” 报告的唯一性标识（如序号） 检测标本的特性和状态 检测标本的接收时间和进行检测的时间 采用的检测方法 实验操作及校核人员的签字，以及签发日期 检测报告中应给出参考结果或范围
A
22
日常扩增的实时荧光曲线所蕴含 的信息
A
23
定量和定性PCR测定的临床应用及 应注意的问题
为什么要做定量测定？
定性和定量测定结果报告上的混淆。
A