十七烟草原生质体融合.ppt
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《原生质体融合育种》课件
原生质体融合育种
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
植物原生质体融合技术PPT课件
+0.3% Macerozyme果胶酶； 0.7M 甘露醇。
▲ 番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5% Cellulysin 纤维素酶+0.3%
Macerozyme果胶酶；102.6g/L 蔗糖。
▲ 水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2% Onozuka Rs 纤维素酶
+1% Driselase 纤维素酶+2% Macerozyme R-10果胶酶+1%
－优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。
－缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。
★ 酶解分离法
– 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶 酶、果酸酶等
– 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或 它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
– 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及
◆ 去除植物细胞壁以获得大量的原生质体 ◆ 诱导原生质体融合形成杂种细胞 ◆ 筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化 ◆ 从细胞团，愈伤组织到最后成株
3
4
◆ Why 技术应用
植物原生质体融合的意义：
◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性 障碍 ◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞 创造条件
5
◆ How 技术方法
选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂
19
2). 酶解
用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮， 将叶片切成2cm长的小片，然后放入含 酶溶液中处理。
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
原生质体融合PPT学习教案
缘杂种成为现实 ◆打破了物种间的界限
第1页/共48页
植物体细胞杂交的几个重要进展
1960年 Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成 功；
1971年 Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完 整植株；
1972年 Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种， 这是第一个植物体细胞 培养基
杂种细胞
第26页/共48页
D、温度敏感型选择
耐高温不 耐低温型 细胞
耐低温不 耐高温型 细胞
融合
高温下培养 低温下培养
杂种细胞
第27页/共48页
机械选择法： 利用天然存在或是人为造成的两个 亲本在物理特性上的差异即可见标记，进行筛选。 利用或人为的造成细胞生长或分化能力上的差异进 行筛选。 做法：在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出 来进行培养的方法。
第30页/共48页
第31页/共48页
（三） 杂种植株的再生和鉴定
植 物 原 生 质 体 融 合 及 再 生 植 株 过 程
第32页/共48页
杂种植株的鉴定方法：
（1）杂种植物形态特征、特性鉴定 （2）杂种植物的核型分析 （3）同工酶分析 （4) 分子标记鉴定：RFLP、AFLP、SSR、
ISSR 、RAPD标记鉴定
1974年 Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细 胞融合并建立了相应的融合技术；
1978年 Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋马铃 薯）；
1981年 Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融 合概念；
1987年 Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。
第21页/共48页
3 杂种细胞的选择
• 互补选择： • 机械选择法： • 双荧光标记选择法：
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植物体细胞杂交的几个重要进展
1960年 Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成 功；
1971年 Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完 整植株；
1972年 Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种， 这是第一个植物体细胞 培养基
杂种细胞
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D、温度敏感型选择
耐高温不 耐低温型 细胞
耐低温不 耐高温型 细胞
融合
高温下培养 低温下培养
杂种细胞
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机械选择法： 利用天然存在或是人为造成的两个 亲本在物理特性上的差异即可见标记，进行筛选。 利用或人为的造成细胞生长或分化能力上的差异进 行筛选。 做法：在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出 来进行培养的方法。
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（三） 杂种植株的再生和鉴定
植 物 原 生 质 体 融 合 及 再 生 植 株 过 程
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杂种植株的鉴定方法：
（1）杂种植物形态特征、特性鉴定 （2）杂种植物的核型分析 （3）同工酶分析 （4) 分子标记鉴定：RFLP、AFLP、SSR、
ISSR 、RAPD标记鉴定
1974年 Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细 胞融合并建立了相应的融合技术；
1978年 Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋马铃 薯）；
1981年 Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融 合概念；
1987年 Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。
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3 杂种细胞的选择
• 互补选择： • 机械选择法： • 双荧光标记选择法：
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究近年来，由于全球气候变化和农业技术升级的不断提升，烟草品种改良已然成为烟草生产者关注的重要课题。
烟草种间叶肉原生质体融合（hybrid protoplast fusion）作为一种高效的烟草品种改良技术已被广泛研究。
研究表明，原生质体融合方法在烟草品种改良方面可以实现新品种的定向育种、突变育种和株系特性改良，特别是可以获得跨系品种，有效地实现烟草品种改良。
烟草种间叶肉原生质体融合方法是利用烟草叶片中的原生质体将烟草不同品种的叶肉细胞组合起来，使其外源遗传物质在细胞间融合，形成新的烟草雏形体。
原生质体融合完成后，用培养基将合成的原生质体培养花芽，此时原生质体已经能够分解，形成植株。
烟草原生质体融合技术是一种高效的烟草品种改良方法，但由于其复杂性，相关技术仍有待进一步改进。
因此，开展烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究，可以更好地利用原生质体融合技术，有助于进一步改善烟草品种，提高烟草产品的质量和产量。
为了更好地改进烟草种间叶肉原生质体融合方法，需要对烟草叶肉细胞的种间变异进行重点研究，以更好地揭示种系特性的差异。
此外，还需要研究原生质体融合后植株的生长特性，探究原生质体融合方法对烟草叶肉细胞遗传变异的影响。
此外，还可以采用代谢组学方法，研究原生质体融合后烟草植株能量代谢状态的变化情况，为进一步优化烟草种间叶肉原生质体融合方法提供参考。
有鉴于此，对烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究具有重要的意义，可以有效提高烟草生产的质量和产量，促进烟草育种水平的提高。
为此，应该加强对烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究，以期为烟草品种改良和遗传育种提供新思路，为全球烟草育种提供重要的技术支持。
总之，烟草种间叶肉原生质体融合方法是实现烟草品种改良的有效方法，但目前还有待进一步改进。
未来，需要从更多方面进行深入研究，以更好地改进该技术，为烟草的遗传育种提供新思路。
试验十七烟草原生质体融合
二、实验目的
学习植物原生质体融合的方法，为进行体细 胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，血球记数板。
四、实验步骤
1、配制酶液
各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（5）溶液III： 60 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 水
, 28.5 ml无菌
（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶
2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离
2～3周龄愈伤 组织和叶片各 约1g和0.5g，叶 片剪成细条
加入到酶液中、 用镊子分散愈 伤组织
黑暗、 25℃酶
解5~6小时，间 歇轻轻摇动。
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤
800rpm离 心3min
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml混 合原生质 体悬浮液
加入0.2ml 高钙 高pH PEG融合 液
静置 10min
5min内缓慢加
入5ml W5稀释 液，轻轻吸打混
匀
重新悬浮在 0.5ml W5，静 置>10min
800rpm离心 3min，弃上 清夜
静置>30min
（5）融合原生质体的观察
学习植物原生质体融合的方法，为进行体细 胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，血球记数板。
四、实验步骤
1、配制酶液
各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（5）溶液III： 60 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 水
, 28.5 ml无菌
（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶
2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离
2～3周龄愈伤 组织和叶片各 约1g和0.5g，叶 片剪成细条
加入到酶液中、 用镊子分散愈 伤组织
黑暗、 25℃酶
解5~6小时，间 歇轻轻摇动。
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤
800rpm离 心3min
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml混 合原生质 体悬浮液
加入0.2ml 高钙 高pH PEG融合 液
静置 10min
5min内缓慢加
入5ml W5稀释 液，轻轻吸打混
匀
重新悬浮在 0.5ml W5，静 置>10min
800rpm离心 3min，弃上 清夜
静置>30min
（5）融合原生质体的观察
烟草的质量与化学指标PPT课件
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5
2杂气：令人不愉快的气味。包括青杂气、 土怪气、枯焦气、地方性杂气等不良气味。
青杂气：叶绿素降解不充分产生的 枯焦气：下部叶过熟易产生枯焦气，燃烧
不良也会产生枯焦气 土怪气：下部叶粘土过多 土怪气和地方性杂气：地方性土壤条件对 烟叶化学成分的不良影响。
.
6
3吃味：各种化学成分燃烧时反映在口腔内 的酸甜苦辣涩的综合感觉
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7 尼古丁值
尼古丁值＝总烟碱/游离烟碱
比值大，苦辣味轻，刺激性小
.
25
8多酚值＝多酚/总还原性物质的比值
总还原性物质：多酚和还原糖 多酚值 仅适用于调制方法相同的同类型同产地烟 叶的比较，比值越大，颜色越深
9氮值＝烟碱氮/氨氮量 烟碱氮＝烟碱含 量*0.1728 烟碱氮对烟质影响较小，氨 氮量来评价含糖量较低的白肋烟的质 量，比值越大，烟质越好
.
23
6 水溶性糖与挥发碱的比值
水 溶 性 总 糖 比 值 =烟 碱 (氨 当 量 )% +其 总 他 挥 挥 发 发 碱 碱 (氨 当 量 )%
在挥发性碱中烟碱占了一大部分，其 它挥发碱含量虽然小，但是对烟质的影响很 大。因为其它挥发碱如NH3本身就是刺激性很 强的物质，并且其它挥发性含量高，使烟叶 的碱性增强，促使部分结合态烟碱转变为游 离态，增强了烟气的刺激性。
.
14
有人提出，影响健康的因素很多，遗传、 个人体质、饮食习惯、药物和环境等等， 仅将吸烟作为各种疾病尤其是癌症的罪魁 祸首是不符合实际的。如焦油中的主要致 癌物质苯并芘全世界每年释放总量为5044t， 烟草燃烧仅产生0.05-0.25t。
.
15
第二节 化学指标
一、主要化学指标 二、评定烟质的经验指标
实验十七 (1)烟草原生质体分离和培养新版14
（3）其他：灭菌蒸馏水，培养皿和烧杯等（同实验 十六）
jgyj
7
养基悬浮原生质体） 4
800rpm离 心3min
4、原生质体培养
（1）记数：取1滴原生质体于血球记数板，在显微 镜下统计1个大方格（10-4ml）中的原生质体数目。 （2）调整密度：用D2培养基调整原生质体密度为 1×105个原生质体/ml。 （3）植板：取0.8ml原生质体悬浮液于培养皿 （Ø=3.5cm），形成均匀的一层薄层。Parafilm封 口。 （4）培养：将培养皿置于25℃、300 lx条件下培养 。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2（Bright Yellow 2）愈伤组织系 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，、配制酶液（各组10ml）
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 （Cellulase Onozuka R-10） +0.5%离析酶 （Macerozyme R-10）（4000rpm离心6min后过 滤灭菌于无菌三角瓶中）
2、酶液处理BY2愈伤组织细胞
2～3周龄愈 伤组织1g
jgyj
加入到酶 液中、用 镊子分散 愈伤组织
黑暗、 25℃ 酶解5~6小时， 间歇轻轻摇 动。 3
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤 800rpm离 心3min
弃上 清液
悬浮在 1ml 原生 质体培养 基中
jgyj
加入3ml CPW 培养基，用滴 （再重复上述操作2 管重新悬浮原 次，最后1次用D2培 生质体
实验十七
（1）烟草原生质体分离和培养
一、原理
原生质体是无细胞壁的细胞部分。利用纤 维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，能获得大量 的原生质体。
《原生质体融合育种》课件
稻米和小麦的基因交换
细胞工程育种的应用
通过原生质体融合育种，实现稻 米和小麦遗传特性的交换， 以提 高两个农作物的产量和适应能力。
利用细胞工程技术和原生质体融 合，可以快速培育出抗性强、高 产优良品种。
植物基因编辑的进展
通过原生质体融合育种的细胞工 程技术，实现植物基因编辑， 能 够更精准地改良植物性状技术，将植物细胞分离并制备出原生质体。
2
随机融合和定向融合的区别
随机融合是将制备好的原生质体混合后融合，而定向融合是特定选择要融合的原生质 体进行融合。
3
影响融合效率的因素
原生质体浓度、温度、融合时间等因素会对融合效率产生重要影响。
应用案例
了解原生质体融合育种在农业和植物科学领域的具体应用案例。
优缺点
了解原生质体融合育种的优势、局限性以及未来发展方向。
原生质体融合育种的优点
快速获取新品种、遗传特性可控、有效提高农作物产量。
原生质体融合育种的缺点
融合效率低、变异性高、对环境的适应能力有限。
未来发展趋势
进一步改进原生质体融合育种技术，提高融合效率和品种稳定性。
结论
通过本课件的学习，我们了解了原生质体融合育种的基本原理、应用案例、优缺点以及未来发展趋势。 原生质体融合育种具有巨大的应用潜力，将助力农作物产量提升和遗传特性的改良。
《原生质体融合育种》PPT课 件
让我们一起了解原生质体融合育种的奥秘与应用。
介绍
原生质体融合育种是一种基因育种技术，通过将不同植物的原生质体融合，实现基因交流和遗传特性的 选择性增强。
什么是原生质体融合育种
原生质体融合育种是通过融合植物细胞的原生质体， 实现不同植物间基因的交流，以达到遗传性状 的改良。
微生物原生质体融合育种精品PPT课件
☺促融时间：促融时间增加可以使原生质体融合机会增多，但是，PEG对原 生质体有毒，为保证原生质体的再生能力，促融时间不宜过长。
☺无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合， 而 K+、 Na+会显著降低融合率， 融合时一般 Ca2 +0 . 01 mol / L、 Mg2+0 . 02 mol / L 为佳。各菌种间略有差异。
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3、原生质体再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最 适再生条件存在一定的差异 ▪ 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁 合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。 ▪ 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全， 营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 ▪ Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与 活性。
过
低速离心数分钟
程
除去上清液，收集沉淀物
0.1 mol/L CaCl2洗涤两次 用融合液悬浮制备的融合体
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原生质体融合的影响因素
☺PEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促 融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质 体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一 般为40%。
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
☺无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合， 而 K+、 Na+会显著降低融合率， 融合时一般 Ca2 +0 . 01 mol / L、 Mg2+0 . 02 mol / L 为佳。各菌种间略有差异。
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3、原生质体再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最 适再生条件存在一定的差异 ▪ 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁 合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。 ▪ 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全， 营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 ▪ Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与 活性。
过
低速离心数分钟
程
除去上清液，收集沉淀物
0.1 mol/L CaCl2洗涤两次 用融合液悬浮制备的融合体
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原生质体融合的影响因素
☺PEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促 融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质 体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一 般为40%。
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究近年来，随着烟草作为重要经济作物的生产和加工业的发展，对烟草品种改良和遗传育种技术开发的需求也日益增加。
烟草种间叶肉原生质体融合方法（PTCH）是一种具有优越性能的遗传育种技术，具有改善烟草品种性状和产量性能，提高烟草品种可持续、安全和营养性的能力。
烟草种间叶肉原生质体融合方法是一种利用原生质体的育种技术，该技术是利用原生质体（cytoplasm）在来源于不同品种的叶肉细胞中质粒的迁移而改变细胞核基因组中的细胞。
PTCH方法主要分为三个步骤：原生质体瞬态转移（PTT），叶肉原生质体共生（PTC）和种间叶肉原生质体融合（PTCH）。
PTCH方法的基本原理是，首先将一个品种的叶肉细胞和另一个品种的叶肉细胞交叉混合，然后在恒温下用多抗药剂过滤，使这两个品种的细胞原生质体瞬态转移，这种迁移会改变两个品种叶肉细胞核基因组中的质粒，形成种间叶肉原生质体融合体。
通过对烟草种间叶肉原生质体融合体进行培养，将能够建立目标品种，以满足农业可持续发展的目标。
目前，烟草种间叶肉原生质体融合方法应用于实践已取得一定程度的成功，并取得了许多研究成果。
例如，研究人员在利用PTCH技术改良烟草品种时取得了良好效果，提高了产量20-30％；此外，该技术还可以改善营养和药用性状，促进烟草的营养转化；同时，在PTCH方法的改良中，还可以改良烟叶的口感，以及抗病虫害的能力，从而提高烟草品种的可持续、安全和营养性。
PTCH方法不仅在改良烟草品种方面取得了成功，而且在烟草病虫害抗性育种上也取得了不错的成果。
例如，利用PTCH方法可以改良烟草叶面积指数（LMA），以提高烟草抗病虫害的能力，其中，在LMA方面可以提高20％到30％；此外，该方法还可以改变烟草根系形态，从而提高烟草抗旱、抗盐胁迫的能力，改善烟草根系的根结结构；在烟草叶组织结构方面，可以改善烟草叶对寒害和病虫害的抗性；烟草分子育种也得到了改良，可以获得抗病虫害和耐药性等优良性状的目标品种。
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吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数 板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融 合率。 融合原生质体的特征： A：异源融合；B：同源融合 融合率=融合的原生质体数/观察的原生质体数
准备下次实验的试剂（各100ml）：
（1）2×CTAB提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0）， 2％（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇， 20mM EDTA
（2）TE缓冲液：10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA。
（3）50TAE电极缓冲液：称取24.2gTris溶解于适量蒸馏 水中，加入5.7ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶 液，定容到100ml。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl （pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（5）溶液III： ห้องสมุดไป่ตู้0 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 , 28.5 ml无菌水
（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶
2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离
2～3周龄愈 伤组织和叶 片各约1g和 0.5g，叶片 剪成细条
加入到酶 液中、用 镊子分散 愈伤组织
黑暗、 25℃
酶解5~6小时， 间歇轻轻摇 动。
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤
800rpm离 心3min
实验十七
（2）烟草原生质体融合
一、原理
PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳 水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近 原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透 吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。
在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分 子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电 荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中， 发生原生质体融合。
弃上 清液
弃上清 液,重新 悬浮在
0.5ml CPW溶 液中
800rpm离 心3min
加入3ml CPW 培养基，用滴 管重新悬浮原 生质体
4、原生质体融合
（1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体 的密度调整为106个原生质体/ml。 （2）配置PEG融合液（无菌下） PEG溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1 （3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体 积混合。
二、实验目的
学习植物原生质体融合的方法，为进行体细 胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，血球记数板。
四、实验步骤
1、配制酶液
各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml 混合原 生质体 悬浮液
加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液
静置 10min
重新悬浮 在0.5ml W5，静置 >10min
800rpm离 心3min， 弃上清夜
5min内缓慢 加入5ml W5 稀释液，轻 轻吸打混匀
静置 >30min
（5）融合原生质体的观察
准备下次实验的试剂（各100ml）：
（1）2×CTAB提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0）， 2％（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇， 20mM EDTA
（2）TE缓冲液：10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA。
（3）50TAE电极缓冲液：称取24.2gTris溶解于适量蒸馏 水中，加入5.7ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶 液，定容到100ml。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl （pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（5）溶液III： ห้องสมุดไป่ตู้0 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 , 28.5 ml无菌水
（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶
2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离
2～3周龄愈 伤组织和叶 片各约1g和 0.5g，叶片 剪成细条
加入到酶 液中、用 镊子分散 愈伤组织
黑暗、 25℃
酶解5~6小时， 间歇轻轻摇 动。
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤
800rpm离 心3min
实验十七
（2）烟草原生质体融合
一、原理
PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳 水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近 原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透 吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。
在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分 子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电 荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中， 发生原生质体融合。
弃上 清液
弃上清 液,重新 悬浮在
0.5ml CPW溶 液中
800rpm离 心3min
加入3ml CPW 培养基，用滴 管重新悬浮原 生质体
4、原生质体融合
（1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体 的密度调整为106个原生质体/ml。 （2）配置PEG融合液（无菌下） PEG溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1 （3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体 积混合。
二、实验目的
学习植物原生质体融合的方法，为进行体细 胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，血球记数板。
四、实验步骤
1、配制酶液
各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml 混合原 生质体 悬浮液
加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液
静置 10min
重新悬浮 在0.5ml W5，静置 >10min
800rpm离 心3min， 弃上清夜
5min内缓慢 加入5ml W5 稀释液，轻 轻吸打混匀
静置 >30min
（5）融合原生质体的观察