肺炎链球菌的鉴定方法
肺炎链球菌的分离和鉴定ppt演示课件
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6. 凝集试验
包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白 A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。
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表1 非β 溶血链球菌的鉴别
———————————————————————————————————— 菌 种 Optochin 胆汁 胆 汁 6.5%NaCl 吡咯烷 卫星现象 CAMP 血清群 敏 感 溶菌 七叶苷 肉汤 酮酶 ———————————————————————————————————— 肺炎链球菌 + + — — — — — — 牛链球菌 — — + — — — — D 无乳链球菌 — — — d — — + B 草绿色链球菌 — — — — — — — — 营养变异链球菌 — — — — + + — — ———————————————————————————————————— *d.不同菌株
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细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有 重要价值，同时对临床治疗的药物选择 也具有十分重要意义。
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一、生物学性状
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1. 形态与染色
肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛 头状，成双排列，少呈链状。在组织中 可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失）， 无鞭毛及芽孢。
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2. 培养特点
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.18.Fra bibliotek19.
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3.抗原结构
（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在 于肺炎链球菌的细胞壁。 （2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜 中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可 将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其 中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。 （3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋 白质，无特异性。
肺炎链球菌检测-菌落形态鉴定 Colony Morphology Test
中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所呼吸道传染病室
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
菌落形态鉴定
（Colony Morphology Test ）
试验开始前，请准备：
哥伦比亚血琼脂平板于室温下平衡至少20min。
试验步骤：
1.将疑似标本以三区划线方式接种于哥伦比亚血琼脂平板上。
℃2条件下培养18-20h。
2.35 5%CO
3.挑取疑似菌落，典型菌落形态：脐窝状，灰白色，半透明，草绿色溶菌环。
常见肺炎链球菌菌落形态：草绿色溶血环，灰白色、表面光滑、扁平的可疑菌落；或草绿色溶血环，中央塌陷、边缘隆起、呈脐窝状的可疑菌落；或草绿色溶血环，表面光滑、湿润有粘液的可疑菌落。
4.挑取单个疑似肺炎链球菌菌落，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，35℃条件下
培养18-20h。
5.进行其他肺炎链球菌特异性鉴定。
将菌落形态观察结果及时添加至
Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
本手册仅供实验室内部使用 2011年第1
版。
肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程
肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程1.引言肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原微生物，对于疾病的防控具有重要意义。
测定肺炎链球菌的活菌数含量是判断疾病传播性和临床治疗效果的重要指标。
本文档旨在规范肺炎链球菌活菌数含量的测定操作，确保测定结果的准确性和可靠性。
2.实验所需材料肺炎链球菌培养基冰箱分装管微量移液管、移液器和吸头显微镜细菌计数板和计数室3.实验步骤1.取一小瓶肺炎链球菌培养基放置于冰箱中冷藏，保持4℃。
2.取适量肺炎链球菌培养基，分装于无菌分装管中，避免反复冻融，可存放在-20℃的冰箱内长期保存。
3.取一支肺炎链球菌分离菌株，用无菌吸头取适量细菌液，接种于肺炎链球菌培养基中。
4.将接种好的培养基放置于恒温摇床中，在37℃恒温箱中培养24小时。
5.取培养好的细菌液，用无菌吸头吸取适量的细菌悬液，放置在显微镜片上。
6.用显微镜观察细菌悬液中的活菌，计数并记录。
7.将细菌计数板放置在计数室中，将观察到的活菌在计数板上记录。
4.实验注意事项所用材料必须无菌，以防止其他微生物的污染。
活菌的计数应在24小时内完成。
活菌数的检测应重复3次并取平均值。
实验环境应保持洁净，避免灰尘和其他污染物对实验结果造成干扰。
5.结果记录与分析根据实验步骤所得的数据，计算平均活菌数含量，并记录在实验数据表中。
通过对不同样本的活菌数进行比较和分析，可以了解肺炎链球菌的传播程度和感染风险。
6.结论本操作规程提供了一种测定肺炎链球菌活菌数含量的标准化方法，经过验证具备准确性和可靠性。
科学使用本操作规程可以为疾病的早期预防和传播控制提供重要的实验数据支持。
注意：本操作规程仅供参考，具体实施过程请根据实验条件和要求进行调整。
三种试验方法鉴定肺炎链球菌的比较和评价
１３１ 细 菌分 离与 纯化 ．．
将 接 种 了标本 的含５ ％脱
纤维 羊血 的哥 伦 比亚 琼脂培 养皿 置 ３ｏ ５ ｏ 培 ５ｃ、％ｃ ２
养箱 ｌ —２ ， ８ ４ｈ 挑选菌落周 围有草绿色溶血环 ， 细 小 、 白色 、 面 光 滑 、 平 的可 疑菌 落 ， 中 央 塌 灰 表 扁 或 陷、 边缘隆起、 呈脐窝状的可疑菌落， 或表面光滑 、 湿
标准， 但该法并不适用于临床实验室进行常规应用 ， 其 它一 些 鉴定 方 法 如 ： Ｐ ０Ｓ ｅ ｙｔ Ｇ ＩＣｒ Ａ Ｉ２ ｔｐｓｓｍ、 Ｐ ａｄ ｒ ｅ
润有粘 液 的可疑 菌 落 ， 分纯 后 进行 革 兰 氏染 色 和 触 酶试验 ， 选取 触 酶阴性 、 革兰染 色呈 矛头 状成双 排 列 或短链 状 的革兰 阳性球 菌进行 以下 三项 鉴定试 验 。 １３２ ０ｐ ｃｉ 感 试 验 ．． ｔｈ ｏ ｎ敏 配 制 ０ ５麦 氏单 位 菌 ．
滴 １％去氧胆酸钠溶液于可疑菌落上面， ３ｃ ０ 置 ５【 ＝ 孵育 １ ｉ后观察结果 ， ５ｍｎ 菌落溶解消失者 为阳性 ，
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凝集法肺炎链球菌试剂盒购 自法 国生物梅里 埃公 司。Ｏ ｔ ｈ ｐ ｃｉ 片 （ｔ／ ） 自英 国 Ｏ ＯＤ公 司 。 ｏ ｎ纸 ５ｅ 片 购 ， ， ＸＩ
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文章编号 ：０７ ２７ ２０ ）５ ６４ ２ １０ —４８ （０ ７０ —０６ —０
三 种试 验 方 法鉴 定 肺 炎 链 球 菌 的 比较 和 评 价
株（ Ｉ＋Ⅱ）其它草绿色链球菌 ９ 株（ ， ６ Ⅲ＋Ⅳ ＋Ｖ ＋Ⅵ） 见表 ｌ 。 。
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。
准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。
该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。
形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。
链条的长度和排列模式可能因菌株而异。
荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。
荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。
血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。
生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。
胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。
尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。
分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。
PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。
抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。
通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。
2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。
3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。
4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。
6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。
7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
肺炎链球菌检验
3
生物标记物发现
质谱技术可以发现与肺炎链球菌感染相关的生物 标记物，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
生物信息学在肺炎链球菌检验中的应用
数据整合与分析
01
生物信息学可以对来自不同实验平台的数据进行整合和分析，
挖掘肺炎链球菌感染相关的生物标志物和药物靶点。
药物设计
02
基于生物信息学方法，可以预测和设计针对肺炎链球菌的新型
兼性厌氧菌
肺炎链球菌为兼性厌氧菌，在 有氧或无氧环境下均能生长。
营养要求高
肺炎链球菌对营养要求较高， 需要丰富的铁、维生素B等才
能正常生长。
肺炎链球菌的致病性
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02
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致病物质
肺炎链球菌主要通过产生 毒素和酶致病，如荚膜多 糖、溶血素等。
感染途径
感染主要通过呼吸道飞沫 传播，也可通过接触污染 物品传播。
设备和专业操作。
药敏试验
总结词
药敏试验用于检测肺炎链球菌对抗菌药物的敏感性和耐药性，指导临床合理用药。
详细描述
药敏试验通过在培养基上接种肺炎链球菌，并添加不同抗菌药物，观察细菌的生长情况，从而判断细菌对抗菌药 物的敏感性和耐药性。药敏试验对于临床医生选择合适的抗菌药物具有重要意义，能够指导临床合理用药，提高 治疗效果并减少耐药性的产生。
疾病类型
感染后可引起大叶肺炎、 脑膜炎、中耳炎等多种疾 病。
肺炎链球菌的流行病学
季节性流行
肺炎链球菌感染有明显的 季节性，冬季和春季是高 发季节。
人群易感性
儿童、老年人、身体虚弱 者及免疫功能低下者易感。
地区分布
全球范围内均有肺炎链球 菌感染的报道，但发病率 和病死率存在地区差异。
02
肺炎链球菌检测讲解
国外感染情况
在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。 每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性 中耳炎30-50％；在发展中国家，每年约有 500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50 万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）
2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约 0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1％的亚甲蓝试剂。
SP血清学分型步骤：
3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌 落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单 位浓度。
4 用接种环挑取约10μL菌悬液放入载玻片上， 再挑取同量的诊断血清（10μl）放入载玻片上， 并与菌悬液搅拌混匀。
本地区耐药情况
对红霉素、四环素、复方新诺明、 克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为 严重，多重耐药发生率为75%，高于北 京、上海、杭州地区。
SP培养呼吸道标本的运输和保存
尽快送检，要求2h内送到；
肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而且不适合4℃ 保存；
标本处理前检测是否合格。
痰标本合格的标准：
痰标本 鳞状上皮细胞 白血球 细菌种类
合格
<=10/低倍 >=10
1-3种
不合格 >=25/低倍 <=10
>3种
培养特性
初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好； 18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，
保存 挑选新鲜培养物置于保存管中，-76℃ 保存。
复活 取出保存管自然平衡至室温，接种适合 平板。
SP血清学分型：
肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗 研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手 段。
肺炎链球菌的检测与分型技术
2020/11/14
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The Ct value corresponding to the detection level of RT-
PCR and MRT-PCR for pneumococcal serotyping
Serotype
RT-PCT
MRT-PCR
Combined with other serotypes
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
2020/11/14
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/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾 病发病（发表的研究）
2020/11/14
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沒有感染者
帶菌者
发病者
2020/11/14
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肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障 肺炎球菌菌血症
脑膜炎 脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘 膜纤毛防御系 统
中耳炎 鼻咽部移殖
腹膜炎 关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
2020/11/14 Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: 10 ASM Press; 1994. p. 322-31
12A
19F
6C
12B
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肺炎链球菌的鉴定方法
来源：检验医学网
细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
一、生物学性状
肺炎链球菌革兰染色呈阳性。
球形或矛头状，成双排列，少呈链状。
在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。
2. 培养特点
（1）培养基
肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血）。
琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。
1）标本处理
及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。
因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
2）选择性分离培养基
培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
3)培养环境
5～10％CO2、35℃培养24～48h。
（3）肺炎链球菌的菌落形态
在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。
3.抗原结构
（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚
体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。
二、肺炎链球菌鉴定
肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。
其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。
必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。
在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。
必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。
1. 溶血性检查
肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。
2. Optochin(OP)敏感试验
optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。
该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。
optochin敏感试验方法似药敏试验。
挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5μg/片的optochin纸片，置5~10%CO2的大气中（或烛缸），35℃孵育过夜。
抑菌环直径>=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。
抑菌环直径<>
也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径>=14mm。
应注意鉴别。
但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而缓症链球菌和口腔链球菌对OX耐药。
这可作为辅助鉴别点。
3. 胆汁溶菌试验
自溶酶是一种L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。
自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。
肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。
（1）试管法:
取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。
（2）平皿法:
加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。
试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。
4.乳胶凝集试验
结果准确、快速、特异性高。
5. 荚膜肿胀试验
取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。
可用于肺炎链球菌的分型。
6. 凝集试验
包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。
三、肺炎链球菌的药敏试验
K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血培养基。
直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液，在15分钟内接种完)作为接种液。
稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和Etest法。
培养条件：为35℃ 、5％CO2培养20～24小时。
质控菌株ATCC 49619。
1.肺炎链球菌的耐药机制
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-内酰胺类抗生素的作用靶位，改变后使PBP与青霉素G的结合力下降；
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于1967年；
多重耐药肺炎链球菌（MDR）1977年首次在南非爆发流行。
肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致。
肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变，即核糖体50S亚单位改变所致，由ersB(erythromycin resistance methylase)基因介导，其耐药表型为MLS，即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。
另一耐药机制为主动外排系统，由mefA 基因介导，其耐药表型为M，即对14元环（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素）、15元环（阿奇霉素）大环内酯类低水平耐药，而对16元环大环内酯类（罗他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素）、林可霉素和链阳霉素B敏感。
耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径:
(1)克隆传播，是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。
(2)基因水平转移，是把耐药基因转移到敏感菌株中。
过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。
一般认为在抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确能生存下来, 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。
研究发现证实儿童鼻咽部存在“隐匿性耐药克隆株” 。
随着我国儿童β-内酰胺类抗生素大量使用, 可以预计不久的将来, 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。
2.耐青霉素肺炎链球菌的检测
纸片扩散法对β内酰胺类药物结果的准确性不够，用1μg/片苯唑西林(OX)筛选肺炎链球菌对抑菌环直径小于20mm时，就必须做稀释法证实是耐药。
3.肺炎链球菌的药敏报告
用1ug/片苯唑西林纸片测试青霉素敏感性，当抑菌环≥20mm或MIC≤0.06ug/ml可报告青霉素敏感。
并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、
头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。
当苯唑西林抑菌圈≤19mm时应确定青霉素、头孢噻肟或头孢曲松的MICs，因为抑菌环≤19mm可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌株中。
当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌，应常规报告MICs。
测定的药物应包括青霉素、头孢噻肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。
总结
1. 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是条件致病菌；
2.肺炎链球菌对营养要求较高，在含有新鲜血液的培养基中生长良好；
3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌与其他α－溶血链球菌相区别；
4. 血清学鉴定特异性高；
5. 要注意对PRP和MDR的检测。