ATP荧光法微生物(细菌总数)快速检测系统

ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统使用说明书第一部分ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统简介1、系统原理 (3)2、组成部件及相关功能 (4)3、应用领域、特点、效益 (4)4、检测注意事项及操作步骤 (4)5、ATP快检系统使用注意事项及故障排除 (9)6、对应关系曲线 (10)7、有关食品安全和卫生检测的问答 (11)8、具体样品检测的操作方法及方案 (14)第二部分ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统使用说明1、技术参数及性能 (23)2、仪器操作说明 (24)2．1开机、初始化 (24)2．2参数设置 (24)2．2．1选择RLU方式 (25)2．2．2选择其它样品名方式 (25)2．2．3设置文件类型............................... . (26)2．2．4设置日期时间......................... (27)2．2．5设置检测时间 (27)2．2．6 U盘格式化 (27)2．3测试 (27)2．4查询 (28)2．4．1查询测试结果 (28)2．4．1．1删除测试结果 (29)2．4．1．2删除文件 (29)2．4．2查询文件信息 (30)2．4．3查询仪器信息 (30)2．4．4查询电池电量 (30)2．4．5快速查询 (30)2．5通讯 (32)3、上位机软件 (33)3．1软件安装 (33)3．2驱动程序的安装 (36)3．3软件启动 (38)3．4软件运行 (39)3．5样品及回归方程设定 (40)3．6 “文件名”说明 (41)3．7文件、记录操作和数据库 (42)4、电池充电 (43)5、保修 (43)第一部分ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统简介1、系统原理萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂—萤火虫荧光素酶（简称虫光素酶，luciferase）、虫荧光素（D-luciferin）以及所有细胞生物都产生的生物能量物质—三磷酸腺苷（ATP）。

在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：ATP＋D-Luciferin＋O2 Mg++AMP＋Oxyluciferin＋PP i＋CO2＋LightLuciferase上式表明，只要具备适当条件，不仅萤火虫，即使在试管中也能发出荧光。

当反应系统中，虫光素酶和虫荧光素处于过量的情况下，荧光的强弱取决于ATP的数量。

以检测含细菌的样品为例，细菌细胞越多，ATP量越高，发出的荧光也就越强。

由于虫光素酶对ATP的反应非常灵敏，荧光强弱可通过荧光仪10~15秒内计量。

所以，在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，通过荧光值就能确定样品中细菌ATP 的含量，从而确定细胞数量，因此，此系统为半定量快速检测系统。

维持胞内ATP浓度的相对恒定，是ATP在细胞代谢中发挥中心作用的关键。

每个细胞的ATP量与胞内容积成正比，但ATP量与菌落形成单位（colony-forming units=cfu）之间却常常偏离这种关系，主要原因是样品中细菌细胞与细胞碎片彼此聚集成团，这种效应曾在大肠杆菌培养物这种单一菌群模式系统中有过描述，一个菌落有可能由单个或几个细胞扩增形成；另一种原因是检测者没有对样品作适当的预处理，比如没有去除胞外游离ATP。

根据相关文献记载，不同种类细菌中的ATP 含量不同，由于细菌ATP含量都处于10-18mol数量级，细微差别忽略不计，均值约为2.5×10-18mol。

对于同种细菌，影响细胞内ATP含量的因素也很多，生长阶段、培养基种类、有氧无氧以及代谢抑制物的存在，都会影响细胞数和荧光值的对应关系。

实测表明处于同一生长状态和批次样品中的ATP是相对恒定的，即在同一环境中微生物种类及生长情况固定，其ATP含量也相对恒定。

2、组成部件及相关功能2.1 试剂组，按检测操作顺序分为：（1）体细胞裂解试剂（TRA），能专一而有效地裂解样品中的非细菌细胞（主要为体细胞）并释出ATP，然后通过过滤比色杯底部的滤膜将其排除。

（2）细菌细胞裂解试剂（XRA），能专一而有效地裂解样品中细菌细胞并释出ATP。

（3）荧光反应试剂组（LLR），能与细菌ATP相互作用并有效地发出荧光。

（4）物表清洁度检测试剂组（SCR），能与物体表面ATP相互作用并有效地发出荧光。

2.2 微量荧光检测仪（也称微量光度计），准确计量检样的荧光值。

2.3 可供100次测定的样品预处理耗材。

（1）过滤比色杯的杯架一个，用于固定过滤比色杯。

（2）加压器一个，用于加压、排出体细胞ATP和试剂组。

（3）带滤膜荧光反应比色杯100个，为荧光反应容器。

（4）专用无菌吸水纸，置于过滤比色杯架，吸收加压后流出的液体。

（5）带密封圈专用无菌浓缩器，用于浓缩样品。

（6）自备微生物学无菌操作所需常规用具、器皿，样品采集无菌、无ATP的容器、塑料袋、手套、镊子等。

3、应用领域、特点、效益4、检测注意事项及操作步骤4.1 试剂的准备和注意事项：4.1.1 本公司提供的“ATP荧光法细菌总数快检系统”所含试剂组与微量荧光检测仪需匹配使用，不可用其它试剂替代。

4.1.2 LLR试剂（含萤火虫荧光素酶和D-荧光素）应在冰箱冷冻室-20℃中贮存，有效期6个月。

LLR试剂组易变质，室温下不高于25℃时不得超过24小时，在0-4℃有效期为5天。

4.1.3试剂（LLR）在用于检测前按规定低温存放，检测前20分钟取出平衡到室温方可应用。

如果超过有效期，应弃用，重新购置。

体细胞裂解试剂（TRA）及细菌细胞裂解试剂（XRA）可处于室温下保存，2-8℃下保存效果最佳。

4.1.4，萤火虫荧光素酶对ATP极其敏感，生物材料容易引起ATP交叉污染，所以检测应尽量满足微生物学常规无菌操作，才能取得准确、真实的检测数据。

4.2样品采集和预处理简介非生理条件下，细菌细胞的ATP浓度将急速下降，但也同样拥有快速补偿机制以维持胞内ATP浓度相对稳定，保障生命活动正常进行。

因此，在采集细菌样品或进行预处理时要注意下列事项。

4.2.1.为避免离心浓缩一类非生理状况的步骤出现，可使用注射器将样品转移到一次性滤膜上。

如需洗涤细胞，应用无菌、无ATP的PBS缓冲液淋洗，以免影响胞内ATP浓度。

4.2.2.卫生监测时，常用涂抹法或用棉拭子擦拭采集样品，但此法对于有生物膜结构的细菌并非最佳方式，其一，细胞收集率不高；其二，棉花纤维干扰光检测。

可改进为用滴瓶将ATP提取液滴加到待检表面，用海绵签收集ATP后进行光检。

4.2.3.细胞的ATP含量与细胞大小成正比，体细胞和酵母细胞的ATP含量大约分别是细菌细胞的1000倍和100倍，但ATP量和菌落形成单位（cfu）之间常常偏离这种关系，理论上每个活细胞都形成一个菌落，而实际上细胞彼此聚集常常出现二个或几个活细胞形成一个菌落的情况。

4.2.4.样品预处理。

可用ATP降解酶如三磷酸酶（apyrase）去除非细菌ATP，用温和的去污剂如TritonX-100去除样品中体细胞ATP，也可使用上述两种制剂同时处理。

不同试剂的处理效果因样品而异，试剂的选择和搭配需经实验确定。

4.3 检测样品的预处理：（操作过程中需配戴一次性无菌手套）必须用无菌、无ATP的PBS溶液：磷酸二氢钾34g；1mol/L氢氧化钠溶液175mL；蒸馏水825mL；pH7.2；使用时将上述溶液吸取1.25ml，定容至1000ml，灭菌后备用。

实验室标准菌：在室温条件下用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤样品细胞3次，最后用1ml同种PBS缓冲液悬浮样品细胞。

物表清洁程度：将无菌棉签头部用TRA试剂润湿，在10cm×10cm范围内进行涂抹，涂抹时需不断旋转棉签头部，用1ml PBS缓冲液（不含钙、镁离子）浸泡棉签头部，从PBS缓冲液中吸出50μl待测。

液体样品：纯净水、自来水等细菌含量较低的样品需按比例浓缩；牛乳、果汁等浓度较大无法通过滤膜洗涤的样品需按比例稀释，稀释液应使用PBS（如使用国标生理盐水，检测数值会偏低）。

液体被检样品含细菌细胞数若高于1000cfu/ml，可直接抽取50µl被检样品进行测试；液体被检样品含细菌细胞数若低于1000cfu/ml，应进行浓缩处理。

浓缩方法如下：打开专用浓缩器，用无菌镊子取无菌过滤比色杯放入专用浓缩器内，注意上下胶圈放好，以免浓缩样品时发生泄露，拧紧浓缩器。

用一次性无菌医用针管抽取10ml 或其整倍数的被检样品，接到专用浓缩器上进行浓缩，用适当的压力缓缓地往下推注射器的柱塞（此时被检液体样品中的细菌被过滤比色杯的微孔滤膜截留，液体部分通过滤膜被排出）直到注射器与浓缩器中的液体部分完全被推出；拧开浓缩器，用消毒过的镊子从浓缩器中取出过滤比色杯备用。

固体样品处理：无菌操作称取25g被检固体样品溶于225mlPBS溶液中，然后把处理好的悬浊液用灭菌后的滤纸进行粗滤，抽取过滤后基本澄清无肉眼可见悬浊物液体进行测试。

（注：溶于PBS后所测结果为每克样品稀释10倍后所得光值）。

特殊样品处理：如需检测高盐、高糖、深加工产品，含抑菌剂、色素类样品需增加TRA洗涤次数，洗涤5次为佳。

冷藏或冷冻样品中微生物所含ATP会降低，如需检测冷冻的肉类、面食等，需使样品完全解冻至室温后再进行检测。

4.4 ATP标准曲线制定步骤4.4.1用双蒸水将浓度为1mM的ATP溶液，按1：10梯度比例制备成100µmol、10µmol、1µmol、100nmol、10nmol及1nmol系列溶液。

4.4.2用微量移液器吸取50µl荧光反应试剂组（LLR），加入荧光反应比色杯中，然后分别加入5µl稀释后的各梯度ATP溶液，用微量荧光检测仪检测RLU值，重复上述步骤，得到系列ATP溶液数据。

4.4.3以RLU值为纵座标，对应ATP浓度系列为横座标作图。

在1nmol-1µmolATP 浓度范围内，ATP浓度与相应RLU之间存在线性关系。

试剂组是否失效及失效程度的阳性对照。

如按，表示开始失效，应弃用。

4.5）放入架孔内。

4.5.2.2拿起TRA体细胞裂解试剂，向杯中滴加4滴，再用加压器置杯顶加压，排出杯中所有液体，由吸水纸吸净。

重复上述步骤一次。

4.5.2.3拉开抽屉后，屏幕显示准备测试状态（如下图）。

从杯架上取下过滤比色杯置于仪器可拉动抽屉小孔内。

4.5.2.4拿起XRA细菌细胞裂解试剂，垂直滴加2滴于杯中。

4.5.2.5用移液器从LLR试剂瓶吸取荧光反应试剂50µl加入杯底，缓和地吸挤三次混匀。

关闭抽屉，开始测试。

（注意：加入LLR试剂后，反应已经开始，所以操作应该迅速，务求操作时间一致，对样品测试达到平行数据十分关键。