蛋白电泳与转膜
蛋白质电泳与操作
3. 分离；
1
4. 染色和脱色。
2
3
应用：用于分析蛋白质的分子量，常用于蛋白质 纯度鉴定和相对定量。
案例二：2-DE分析
• 2-DE简介：2-DE即双向凝胶电泳，是一种分离复杂 蛋白质混合物的方法。通过第一向等电聚焦和第二 向SDS-PAGE分离蛋白质，可展示蛋白质的等电点和 分子量。
案例二：2-DE分析
采用自动化技术，减少人为误差，提高电泳操作的重复性和可靠性。
04 蛋白质电泳实验注意事项
安全注意事项
1 2
避免使用未经灭菌的器具
在实验过程中，应确保所有使用的器具均经过严 格的灭菌处理，以防止微生物污染。
避免直接接触缓冲液
某些缓冲液可能含有刺激性或腐蚀性成分，应避 免直接接触皮肤或眼睛。
3
正确处理废弃物
03 蛋白质电泳技术优化
优化电泳条件
01
02
03
缓冲液选择
根据蛋白质的性质选择合 适的缓冲液，以提高电泳 分离效果。
电压与电流控制
优化电泳过程中的电压和 电流，以获得更好的分辨 率和分离效果。
电泳温度
选择适当的电泳温度，以 减少热量对蛋白质的干扰， 提高分辨率。
改进样品制备方法
样品溶解与变性
采用适当的溶解和变性方法，使蛋白质充分溶解并保持其天然构 象。
琼脂糖凝胶电泳
根据蛋白质分子的电荷和分子 量进行分离，常用于基因工程 和分子生物学研究。
等电聚焦电泳
根据蛋白质分子的等电点进行 分离，常用于蛋白质组学和生
物医学研究。
蛋白质电泳的应用
蛋白质组学研究
用于鉴定、分离和比较不同组织和细胞类型的蛋 白质，有助于深入了解生命活动的分子机制。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
wb转膜条件公式
wb转膜条件公式一、引言WB转膜是生物实验中常用的技术，它将蛋白质从凝胶转移到膜上，以便进行后续的免疫反应。
为了获得良好的转膜效果，了解转膜条件公式及其实际操作步骤至关重要。
本文将详细介绍WB转膜条件的公式、实际操作步骤以及转膜条件对实验结果的影响。
二、WB转膜条件的公式介绍1.转膜公式WB转膜条件的公式可以表示为：转膜速率= （转膜电压× 转膜时间）/ 转膜距离其中，转膜电压（V）、转膜时间（s）和转膜距离（cm）是影响转膜速率的关键因素。
2.转膜条件的确定在实验过程中，需根据目的蛋白的大小、实验要求以及设备性能来确定合适的转膜条件。
通常情况下，较高的转膜电压和较长的转膜时间有利于大分子蛋白质的转膜。
3.转膜条件的应用根据实验需求，可以灵活调整转膜条件以达到最佳转膜效果。
例如，在研究低丰度蛋白质时，可以降低转膜电压和缩短转膜时间，以提高转膜效率。
三、WB转膜条件的实际操作步骤1.准备试剂和器材：磷酸缓冲液、转膜缓冲液、滤纸、膜、转移装置、电泳仪等。
2.蛋白质电泳：将待检测蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3.转膜：将电泳后的凝胶与转膜膜贴合，放入转移装置，按照预先设定的转膜条件进行转膜。
4.封闭：将转膜后的膜用封闭液封闭，以减少非特异性结合。
5.抗体孵育：将封闭后的膜放入特异性抗体溶液中，进行孵育，以检测目标蛋白质。
6.显色：加入显色剂，观察膜上目标蛋白质的显色情况。
四、转膜条件对实验结果的影响1.转膜效果的评判转膜效果可以通过目的蛋白的清晰度、信号强度和背景噪声等指标来评判。
合适的转膜条件可以提高蛋白质的转膜效率，减少非特异性结合，获得清晰的免疫印迹。
2.转膜条件与实验结果的关系转膜条件直接影响蛋白质的转膜效果，从而影响实验结果的准确性。
因此，在实验过程中，需要根据目的蛋白的特性和实验要求来调整转膜条件，以获得理想的实验结果。
五、总结与展望WB转膜条件公式为实验人员提供了理论依据，有助于优化转膜条件，提高转膜效果。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
westen blot原理
westen blot原理Western blot（又称为蛋白质印迹）是一种重要的蛋白质检测方法，它可以用于检测蛋白质的相对分子质量、数量和抗原特异性。
Western blot是通过将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其迁移至膜上，然后使用特异性抗体对目标蛋白进行检测的技术。
Western blot 能够检测样品中可能存在于微量的蛋白质，并且能够区分具有不同结构或特征的不同蛋白质。
Western blot 的原理是：将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其转移到聚丙烯酰胺或聚乙烯膜上，然后使用荧光素或辐射的能量使膜上的蛋白质变得容易检测。
Western blot 检测使用的抗体通常是标记有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素的二抗或其他特异性抗体。
其中辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶可以清晰地显示特异信号，并且可以通过开发和显色识别来显示相对定量。
Western blot 主要用于检测特定蛋白质，如抗体和结构蛋白，但是与其他定量蛋白质方法相比，Western blot 需要相应的蛋白质特异性抗体。
尽管Western blot已成为一种常见的蛋白质分析方法，但是它的应用也因其灵敏性、帮助诊断某些疾病和进行药学研究而备受欢迎。
Western blot 的优点包括：1. 可检测特定蛋白质，能够区分不同的蛋白质。
2. 可在单个实验中同时检测多个蛋白质。
3. 可定量检测蛋白质。
4. 可在不同样品中比较蛋白质表达水平。
Western blot 检测的主要步骤包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳、转膜和检测。
下面我们就将分别介绍这些步骤。
1. 制备蛋白质样品Western blot 检测的首要步骤是样品的制备。
样品的制备是决定Western blot检测结果是否准确的关键。
在制备样品时，鼓励使用相同的样品制备方法和提取技术，包括细胞溶解、组织破碎和蛋白质提取等技术。
样品的制备要求能够尽可能避免蛋白质的失活和降解。
免疫蛋白实验转膜方法
免疫蛋白实验转膜方法一、转膜方法的步骤1. 准备工作：将电泳仪中的凝胶取出，将其放入转膜缓冲液中浸泡10分钟，使凝胶中的蛋白质充分溶解。
2. 制备转膜装置：将转膜装置中的海绵与滤纸浸泡在转膜缓冲液中，然后将其放置在转膜仪器的阳极和阴极之间。
3. 转膜：将凝胶放在转膜装置的海绵上，确保凝胶与膜之间无气泡，然后将膜放在凝胶上。
接下来，将转膜装置放入转膜仪器中，调整电压和转膜时间，开始转膜过程。
4. 转膜结束：转膜结束后，将膜从凝胶上取下，可以进行后续的实验步骤，如免疫染色或探针杂交等。
二、转膜方法的注意事项1. 转膜缓冲液的选择：根据实验的需要选择合适的转膜缓冲液，常用的有常规转膜缓冲液和含有甲醇的转膜缓冲液。
前者适用于大多数常规实验，后者适用于转膜效果较差的蛋白质。
2. 转膜装置的选择：根据凝胶和膜的尺寸选择合适的转膜装置，确保凝胶和膜的接触面积尽可能大，并且没有气泡存在。
3. 转膜条件的调整：根据实验需要调整转膜条件，包括电压、转膜时间和转膜温度等。
过高的电压会引发蛋白质的破坏，过长的转膜时间会导致转膜效果不佳，过高的转膜温度会引起蛋白质的变性。
4. 转膜后的处理：转膜结束后，及时将膜从凝胶上取下，避免长时间接触凝胶导致膜上的蛋白质扩散。
此外，为避免膜的损伤，在处理膜时要轻拿轻放。
5. 转膜效果的评估：转膜结束后，可通过染色或探针杂交等方法来评估转膜效果。
染色方法包括Ponceau S染色和Coomassie Brilliant Blue染色等，探针杂交方法用于检测特定的核酸序列。
总结：免疫蛋白实验转膜方法是将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到固体膜上的重要步骤。
通过合适的转膜缓冲液、转膜装置和调整转膜条件，可以实现高效、准确的转膜过程。
在转膜后，及时处理膜并评估转膜效果是保证实验结果准确性的关键。
希望本文对免疫蛋白实验转膜方法有所帮助，为科研工作者提供参考。
蛋白电泳与转膜
5.1 电泳技术分类
5.1.1 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基 团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分 子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
5.2.1 背景介绍：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳于1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一 步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后，蛋 白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
（3）上样缓冲液作用：蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩 的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加 入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度 的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳的行进过程，一般 加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。
-•
积层胶
Pro1- Pro2 Gly- Cl-
分离胶
+
凝胶分离范围
• SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和 交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液， 而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白 质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺～丙烯酰胺 ” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺 凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小 相差只有3% 的蛋白质。
蛋白转膜流程
蛋白转膜流程1.首先将含有目的蛋白的样品加入到转膜装置上。
Firstly, add the sample containing the target proteininto the transfer apparatus.2.然后准备两块含有孔的膜，通常使用聚丙烯膜或硝酸纤维膜。
Then prepare two membranes with pores, typically polypropylene or nitrocellulose membranes.3.将蛋白转膜装置放入含有适当电解液的转膜槽中。
Place the protein transfer apparatus into a transfer tank containing the appropriate electrolyte.4.连接正极和负极电极，开始电泳转膜过程。
Connect the positive and negative electrodes and start the electrophoretic transfer process.5.蛋白通过电泳迁移，向膜上移动。
Proteins migrate by electrophoresis and move onto the membrane.6.蛋白在膜上形成一定的带状图案。
Proteins form distinct bands on the membrane.7.停止电泳过程，取出转膜装置。
Stop the electrophoresis process and remove the transfer apparatus.8.准备用于检测的特异抗体或染色剂。
Prepare specific antibodies or stains for detection.9.将膜与特异抗体或染色剂接触，进行标记。
Incubate the membrane with specific antibodies or stains for labeling.10.观察蛋白带的形成和位置。
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积层胶
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分离胶
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凝胶分离范围
• SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和 交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液， 而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白 质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺～丙烯酰胺 ” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺 凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小 相差只有3% 的蛋白质。
（8）聚胶时间：虽然应用过硫酸铵／TEMED催化后灌胶15~20 min即可观察到凝胶的形成，但至少 需90 min才能保证95％以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更 长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很 长时间(完全聚合需8 h)。 （9）单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(w／v)，可选择的范围为3％~30 ％，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。 （10）SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则 SDS结合量不足。 （11）有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙 醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。
5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
5.2.1 背景介绍：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳于1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一 步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后，蛋 白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
5.2.6 常见问题：
（1）纹理和拖尾现象：由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅 助试剂如尿素。 （2）蛋白带过宽：与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。 （3）电泳时间比正常要长：可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。 （4）指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却 不好，导致分子有不同的迁移率。 （5）凝胶时间不对：通常胶在30 min内凝聚，如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS剂不够或者失 效。 （6）出现“皱眉”（两边向下中间鼓起）：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底 部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
5.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
（1）阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的 构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。 （2）结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭 圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒 定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。 （3）这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率 便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而 主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就 可以将各蛋白组分按分子量大小分开。
（3）上样缓冲液作用：蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩 的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加 入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度 的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳的行进过程，一般 加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。
5.2.4 实验步骤：
制胶—灌胶（灌分离胶—加蒸馏水—灌浓缩胶）—插入梳 子—加缓冲液（上、下两部分）—拔掉梳子—加样品—盖上 盖子，接通电泳仪电源—染色—脱色
垂直板电泳装置
加样
样品迁 移方向
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电 泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
混合样品
5.1.3 电泳技术的分类： 自由界面电泳：是不含支持物的电泳。溶质在自由溶液中泳动，故也称自由电 泳，适用于高分子的检测，但不易完全分离。 区带电泳：是含有支持物的电泳，支持物上混合样品被置于狭小的区带中泳动， 分离出彼此分离的区带。支持物有很多种，由此又衍生出区带电泳的不同分支。
在生物技术研究中区带电泳应用最为广泛！ 区带电泳的分类： （1）按支持物的物理性状不同分为： 纸电泳：支持物为滤纸; 粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳； 凝胶电泳：淀粉胶，琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶电泳； 缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳 （2）按支持物的装置形式不同分为： 水平板电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式； 垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。 柱状（管状）电泳：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳。
（4）激活剂的用量: 激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。 增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性 。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状， 只是其粘度较聚合前高一些。 （5）温度的影响：聚胶的最佳温度为23~25 ℃ ，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4℃冰箱)及玻璃 板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温 后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。 （6）氧气的影响：氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶 液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去 除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度(＜125torr)脱气至少15 min 。 （7）凝胶添加剂：凝胶中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加剂。SDS加入后不会对凝胶的聚 合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。
• 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰 胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝 胶的线性分离范围如下表：
双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29
丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）
15
12～43
10
16～68
7.5
36～94
5.0
57～212
5.2.3 体系中各成分的作用：
浓缩胶
• 电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区 ，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白 和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界 面附近，浓缩成一中间层。
•
Gly- Pro- Cl-
-
+
分离胶 • 孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入 分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电厂 消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子 量不同,通过分离胶受到的阻力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白 的分子量不同而分开.
实验5 电泳技术
2014-11-03
5.1 电泳技术分类
5.1.1 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基 团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分 子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
凝胶电泳（以蛋白分离为例）：
（1）单向电泳：在聚丙烯酰胺凝胶上分离，适于分离种类较少的蛋白。 （2）双向电泳：第一向使用预制胶条进行蛋白质的等电聚焦分离，第二向将胶 条中经过第一向分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质的分子量 大小与第一向相垂直分离。用于蛋白质的分离，可将提取的蛋白质混合物中数 千种蛋白质同时分离开。
大分子
电泳方向
电泳Βιβλιοθήκη 带孔胶小分子按分子 大小分离
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片
5.2.5 实验注意事项
（1）形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将 直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：丙烯酰胺、线性多聚丙烯酰胺 、金属离子等。 （2）TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化产物呈黄色 ，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶 速度。 （3）过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐 失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时 过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂凝胶)。