ecoli感受态细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化课件
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【注意事项】
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素： 1、细胞生长状态和密度：最好从－70℃或-20℃ 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞 的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌 株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过 高或不足均会影响转化效率。
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• 三、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离 心管中，置冰上。 2、加入连接产物10μl，轻轻摇匀，冰上放置60分 钟。 3、42℃水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上 冷却2分钟。 4、向管中加入800 µl SOC液体培养基(不含Amp)， 混匀后37℃振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生 长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。（其间可以将IPTG 7µl和X-Gal 40 µl涂布 于预制的Amp平板上）。
接种于20 ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基 中,37℃振荡培养1-2小时至OD600 ＝0.5左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
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• 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟， 然后于4℃下5000 rpm离心10分钟。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
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• 三、试剂
1. LB固体和液体培养基 2. Amp母液 3. 含Amp的LB固体培养基 4. SOC液体培养基 5. 0.1mol/L CaCl2溶液
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
RbCl(KCl)法， CaCl2法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但制备较复杂 电击感受态细胞转化效率高,但需电击仪 CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛.
一. 实验原理
1. 概念
感 受 态 细 胞
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转 化
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
4. CaCl 2 法制备感受态细胞原理
1） 感受态细胞的状态： 制备感受态细胞时不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
E.coli 感受态细胞的制备及转化实验技术
5．冰上放置20min，2000g离心2min
6．弃上清，加0.1ml预冷的 0.1 M CaCl2溶液，轻 轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞 注意：离心后观察沉淀，如果出现中间空心的沉 淀说明操作正常
7 ．将取 0.1ml 感受态细胞转移到 1.5ml 离心管中， 加2µ l 质粒，混匀，冰上放置30min
平板培养基
每个平板大约20ml的培养基
用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌 落。在实际工作中，每微克有105以上的转 化菌落足以满足一般的克隆实验。
8．42℃水浴90秒,在冰上放置2min
9．加入 0.5 ml新鲜LB培养基，37℃ ，200rpm振 荡约 30min － 45min （注：转纯质粒可省略，转连 接产物需进行） 10. 取 100µ l 涂布到含有氨苄青霉素的平板上,加Xgal/IPTG各3μL 11．倒置平皿，37℃培养12~16h
一. 实验目的
通过本实验，学习大肠杆菌感受态细 胞制备和转化的原理与技术方法。
二. 实验原理
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞
膜的通透性发生变化，成为能使许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞 (competent
cell) 。
转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得 新的遗传性状的一种技术方法。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能 实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗 传性状。
三．实验方法
1．挑取大肠杆菌DH5α单菌落，接于5mL LB液 体培养基中37℃振荡培养过夜 2 ．以 1:50 比例将 1ml 菌液转移到新鲜 LB 液体培 养基中，37℃振荡培养1.5－2 hr左右，使A600 在0.4－0.5左右
JM109感受态的制备与转化
【材料 】
重组质粒及空载体质粒，JM109大肠杆菌感受态 细胞 ，1.5ml塑料离心管，离心管架，1-10 ul、 1000 ul、200ul枪头，9cm培养皿，一次性滤膜 （0.22um），大量碎冰
方法2 PEG介导的感受态细胞制备
【材料 】
重组质粒PUC-U6及空载体质粒PUC119， JM109大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架， 1-10 ul、1000 ul、200ul枪头，9cm培养皿，一 次性滤器（0.22um），大量碎冰
【设备 】
微量移液器(2μl,200μl,1000μl)，高压蒸汽消 毒器(灭菌锅)，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇 床，离心机， 超净工作台，双蒸水器，冰箱， 制冰机等。
E.COLI JM109感受态细胞的制备与转化
1.目的（1）掌握大肠杆菌感受态细胞的原理 和方法
（2）掌握制备大肠杆菌感受态细胞的
操作方法
实验原理:
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感 受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。目前常用的感 受可态以细满胞 足制 一备 般方 实法验有的C要a求Cl2,制法备，出简的便感易受行态,且细其胞转暂化时效不率用完时全, 可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此 C细时a菌CCal2处2法+使于为细0使℃胞用的膜更C磷a广C脂l泛2低层。渗形C溶a成C液l液2法中晶制，结备菌构感体，受细使态胞位细膨于胞胀外的成膜原球和理形内是，膜：同间 隙中的部分核酸酶解离，诱导形成感受态细胞。待转化 DNA和Ca2+形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物粘附于细胞 表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经 42℃短时间热激处理，细菌细胞膜的液晶结构发生改变， 出现许多间隙，通透性增加，促进细胞吸收DNA复合物。 在营养丰富的培养基上生长数小时后，受体细菌分裂增殖， 被转化到细菌细胞中的重组子基因得到表达，在选择性培 养基平板上，可筛选出所需的阳性转化子。
感受态细胞的制备
CaCl2法Ecoli DH5α感受态细胞的制备及转化试剂：LB液体培养基LB/Amp(100ug/ml) 固体培养皿/15%甘油。
灭菌0.1mol/l 氯化钙，去离子水，灭菌Ep管，灭菌0.1MCacl2步骤：1.取DH5α菌划线，过夜培养。
(划线方法：用100μL枪头在菌液中蘸一下，在平板上划S形，第二次从第一次一个角开始划，分一下，第三次从第二次划线一个角分一下，逐渐降低菌液浓度)。
2.用灭菌枪头挑圆形菌落于LB液体培养基中（试管中5ml），37℃，200rpm，振荡培养12h左右，直至对数生长期。
（小摇）3.将菌种接种在锥形瓶LB液体培养基中（1ml/100ml），37度200r/min,振荡培养2-3h,至OD600=0.4左右。
（可透过锥形瓶中菌液看报纸上的字，模糊可见即可）。
（大摇）4A.分装到2个50ml离心管中，4℃，3000g，离心10min（离心前，离心机4℃预冷），弃上清。
5A.加10ml 凉的0.1MCacl于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀10min。
26A.4℃，3000g，离心10min,弃上清（从离心机取出时离心管尽量不要摇动）。
于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀30min。
7A.加10ml 凉的0.1MCacl28A.4℃，3000g，离心10min,弃上清。
/15%甘油于50ml离心管中，轻9A.加入2ml（2ml/50ml初始菌液量）0.1MCacl2轻摇匀。
10A.分装，在每个灭过菌的Ep管中装50μL～200μL，-80℃保存。
4B. 在Ep管中加入1.5ml菌液（2管）冰上10分钟，0～4度4000r/min ,2min 弃上清。
5B. 加入0.1mol/l氯化钙0.6ml，缓和悬菌，冰上10 分钟，4000r/min 10min,弃上清。
6B.加入冰氯化钙0.2ml缓和悬菌，分四管，冰上待用（-20度保存）。
转化1. 具有抗生素抗性的质粒0.5～2μL放入100μL感受态细胞中，冰上30min.2. 42℃热激90s,不要摇动管，立即放在冰上，冰上1～2分钟。
感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和提取流程.
感受态细胞的制备过程— LB 液体培养基:胰蛋白胨, 1%(W/V ;酵母提取物, 0.5%(W/V ; NaCl ,1%(W/V ,用固体 NaOH 调节 pH 为 7.0~7.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于室温。
摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制; — 0.1 mol/L CaCl2:称取 1.47 g CaCl2•2H 20(Amresco 分装溶于 100 mL去离子水中,灭菌后存于 4℃;—离心管(50 mL或 80 mL或 100 mL ,灭菌;—培养试管,灭菌;— 1 mL枪头,灭菌;— 1 mL加样枪;—滤纸,用牛皮纸包好后灭菌;— 10 mL量筒,灭菌;— 5 mL移液管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌;—冰,离心管架;—恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。
1.接种空白大肠杆菌于 3 mL LB培养基中, 37℃剧烈震荡培养过夜;2.将已培养好的种子液转入 100 mL LB培养基中扩大培养至 OD 650=0.3后,将培养好的细菌置于冰上冷却 10 min;3. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤纸上,将培养基控干;4.用 40 mL 冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。
冰上放置 30 min;5. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,再用 4 mL冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于 4℃放置 12~24 h以增加其敏感性后使用。
6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为100 μL每管,再加入100 μL甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。
,于液氮或 -70℃冰箱中存放。
存于低温下的感受态细胞, 一定不能融解。
如果已经融解, 应丢弃, 而不能再冻结保存而继续使用。
注意事项:1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为 JM109。
EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速 颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰 上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀， 室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙 醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸 上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。
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实验九 e.coli感受态细胞的制备和转化
[实验目的]
1. 学习分子生物学的实验操作技术。
2. 掌握 e. coli感受态细胞的制备和转化的方法。
[实验原理]
未经处理的受体菌细胞对受纳重组分子不敏感，难以实现转化。
当用理化方法诱导细胞，使细胞处于最适摄取和容忍外来dna的生理状态一感受态后，才有较高的转化频率，这种细胞称为感受态细胞。
将重组dna转化受体菌，技术关键是通过化学方法诱导细菌进人感受态，以利于外源dna 被导入。
这项技术始于mandel和hiag1970年的观察。
他们发现细菌经过冰冷氯化钙溶液处理及短暂热休克（hea shock）后，容易被λdna感染；随后cohen于1972年进一步证明质粒dna用同样方法也能进入细菌。
其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收dna复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
除化学法转化细胞外，还有电击法。
电击法不需要预先诱导细菌进人感受态，只依靠短暂的电击，促使dna进人细胞。
因其操作简单方便、转化率高，愈来愈为人们接受。
[实验用品]
一、试剂
1. lb（luria—bertani）培养基
配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
细菌培养用胰化蛋白胨 10g
细菌培养用酵母提取物 5g
氯化钠 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用5 mnaoh（约0.2ml）调至ph7.0，加人去离子水至总体积为1 000ml，高压灭菌20分钟。
2. lb（20％葡萄糖）
100ml lb中加人20g葡萄糖
3.1m cacl2
cacl2·6h2o 54g
去离子水 200mi
用0.22µm过滤器过滤除菌，分装成1ml，贮存于-20℃。
4. 50mm cacl2
将1m cacl2稀释20倍即可。
5. 50mm cacl2(含20％甘油)
取20ml甘油加50mm cacl2至100ml。
6. 10×cm [100mm cacl2，400mm mgcl2，5mm tris—hcl（ph
7.5）]
1m cacl2 10.0ml
0.5 m mgcl2 80 .0ml
1m tris—hcl (ph7.5) 0.4ml
ddh2o 100.0ml
二、仪器
1. 台式高速离心机
2. 空气震荡摇床
3. 紫外分光光度计
4. 恒温水浴
5. 培养皿
[实验内容及方法]
一、e. coli感受态细胞的制备（氯化钙制备法）
1. 将27℃培养的e. coli 5ml加入到含有20％葡萄糖的500ml lb培养基中；
2. 27℃震荡培养2小时；
3. 取1ml培养液，在波长600nm下测定其od值为0.2—0.3（以h2o为对照）；
4. 0℃下放置30分钟后，4℃ 3 000rpm离心5分钟，弃上清；
5. 沉淀中加 250ml 50mm cacl2使之悬浮；
6. 0℃下放置60分钟后，4℃ 3 000rpm离心5分钟，弃上清；
7. 沉淀中加20ml含有20％甘油的 50mm cacl2；
8. 分装，-70℃冰冻或液氮中保存。
二、质粒的转化
1. 取实验*制备的质粒dna 5µl于eppendorff管中，加10×cm5µl，再加水至50µl；
2. 冰浴上放置1~2分钟后，加入上述制备的e. coli感受态细胞50µl；
3. 0℃放置15分钟，25℃放置4分钟，0℃放置5分钟；
4. 室温放置 5分钟后，加 lb培养基500µl（总体积600µl）；
5. 37℃保温1小时后，铺板（每块培养皿50µl或100µl）；
6. 37℃培养过夜。
[实验结果与分析]
总结实验，统计质粒dna的转化情况。