粗蛋白测定方法

粗蛋白测定方法—凯式定氮法

粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。

一、实验原理

蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫～%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。

由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。

硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。

二、仪器和试剂

1、仪器:消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、100mL 锥形瓶、100mL 量筒、表面皿、酸式滴定管、小漏斗、玻璃珠等。

2、试剂:

（1）血清或卵清蛋白等其他含蛋白质样品；

（2）消化液：30%过氧化氢、硫酸与水的比例为3∶2∶1，临用时配制；

（3）催化剂：硫酸铜(CuSO45H2O)与硫酸钾(K2SO4)以1：3配比研磨混合；

（4）50%氢氧化钠溶液；

（5）2%硼酸溶液;

(6)标准盐酸溶液(约L);

(7)混合指示剂(田氏指示剂)混合指示剂由50mL %甲烯蓝乙醇溶液与%甲基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。

三、实验步骤

(一)安装微量凯氏定氮仪

定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。蒸汽发生器包括一个电炉及一个3～5升容积的烧瓶。反应室上边有两个小烧杯，一个供加样，一个盛放碱液。样品和碱液由此可直接到反应室中。反应室中心有一长玻璃管，其上端通到反应室外层，下端靠近反应室的底部。反应室下端底部有一开口，上有橡皮管和管夹。由此放出反应废液。反应所产生的氮可通过反应室上端细管经冷凝管通入收集瓶中。反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。

安装仪器时，将蒸汽发生器垂直地固定在铁架台上，用橡皮管把蒸汽发生器、反应室、冷凝管连接起来。橡皮管连接的部位应在同一水平位置。冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。要认真检查整个装置是否漏气，以保证所测结果的准确性。

(二)样品的处理

(1)固体样品:随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h，用坩埚钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥1h，称重一次，恒0重即可。

(2)血清样品: 取人血(或猪血)放入离心管中，与冰箱中放置过夜。次日离心

除去血凝块，上层透明清液，即为血清。吸出1mL 血清加到50mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。溶液如果显混浊，加少量氯化钠再混匀。

(3)卵清蛋白: 取2g 卵清蛋白溶于%NaCl 溶液并稀释至100mL。如有不溶物，离心取上清液备用。

(三)消化

取5支消化管并编号，在1、2、3号管中各加入精确称取干燥样品(注意：加样品时应直接送入管底，避免沾到管口和管颈上)，加催化剂，混和消化液3mL，在4、5号管中各加相同量的催化剂和混合消化液(若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水)作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。摇匀后，将5支消化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化。先用小火加热煮沸，不久看到消化管内物质变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质上升到消化管的颈部，否则将严重地影响样品测定结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时，适当加强火力。在消化时，应是全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将消化倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。通常消化需要1～3h(对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间)。待消化液变成褐色后，为了加速消化完成，可将消化管取出，稍冷，加30%过氧化氢溶液1～2滴于管底消化液中，再继续加热。消化完毕，取出消化管冷却至室温。

(四)蒸馏

(1)仪器的洗涤:仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器(正在测定中的仪器)加样前使蒸汽通过1～2min 即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸气洗涤到吸收蒸汽的硼酸—指示剂混合液中指示剂的颜色合格为止。洗涤方法如下：

取2～3个100mL 锥形瓶，加入10mL 2%硼酸、2滴混合指示剂，用表面皿覆盖备用。现煮沸蒸汽发生器，其中盛有2/3体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行水封。关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。这样用蒸汽洗涤5min 左右，在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸—指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min，