间充质干细胞治疗支气管肺发育不良的研究进展

㊃综述㊃间充质干细胞治疗支气管肺发育不良的研究进展黄蓉(综述)㊀陶莉㊀吕回(审校)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia ,BPD )常见于早产儿㊂20世纪80年代以来随着医疗技术的提高,早产儿成活率逐渐升高,同时BPD 发病率也逐渐增加㊂目前,BPD 的常规治疗并不理想,故亟需寻求一种新创性疗法减轻BPD 造成的呼吸系统损伤,提高生活质量㊂近年来,间充质干细胞(mesenchymal stem cell ,MSC )的研究为BPD 的治疗提供了新切入点㊂该文就MSC 治疗BPD 的可能作用机制及目前研究现状进行了初步探讨㊂ʌ关键词ɔ㊀间充质干细胞;支气管肺发育不良;抗炎;再生修复;旁分泌Mesenchymal stem cells in the treatment of bronchopulmonary dysplasia ㊀Huang Rong ,Tao Li ,Lyu Hui.Department of Neonatal Intensive Care Unit ,GuangZhou Women and Childrenᶄs Medical Center ,GuangZhou 510000,ChinaʌAbstract ɔ㊀Bronchopulmonary dysplasia (BPD )is a chronic lung disease that commonly occurs in pre-term.Since the 1980s ,with the advances in perinatal care ,survival rate of preterm has been raised ,while BPD continues to be a significant cause of morbidity and mortality for premature infants.However ,the treatment effect of BPD is unsatisfactory.It is urgent to search for innovative ways to reduce the respiratory injury that caused by BPD as well as to improve the quality of life.In recent years ,mesenchymal stem cellsᶄ(MSC )research has pro-vided a new way for the treatment of BPD.This review primarily summarizes the current status of the MSC ther-apies and its possible mechanism on BPD.ʌKey words ɔ㊀Mesenchymal stem cell ;Bronchopulmonary dysplasia ;Anti-inflammatory ;Regenerative re-pair ;Paracrine㊀㊀DOI :10.3760/cma.j.issn.1673-4408.2016.09.004作者单位:510000广州市妇女儿童医疗中心㊀㊀自1968年Northway 提出支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia ,BPD )概念已有40余年,近年来,美国国立儿童健康与人类发育研究所(NICHD )㊁国家心脏㊁肺和血液研究院及少见疾病委员会共同制定了BPD 的新定义,为生后28d 仍需持续用氧或机械通气或纠正胎龄(postmenstrual age ,PMA )36周仍需持续用氧㊂随着产前糖皮质激素和肺表面活性物质的应用,超未成熟儿生存率也相应提高,以纤维化为主要病理改变的 经典型 BPD 已明显下降,更为常见的是一种 轻型 BPD (又称 新型 BPD ), 新型 BPD 大多见于胎龄小于30周早产儿,而超未成熟儿BPD 发生率则更高㊂新型BPD 的病理生理特点为肺泡数目减少㊁体积增大㊁结构简单及肺微血管发育不良,小管期末和囊泡期发育停滞,导致引起肺顺应性降低,气体交换面积减少,气道阻力和呼吸功增加㊂尽管对BPD 关注和研究已近半个世纪,但依然缺乏有效的防治措施㊂近年来,随着干细胞研究的不断深入,为我们开展新型治疗提供了思路㊂动物实验研究发现间充质干细胞(mesenchymal stem cell ,MSC )移植可以减轻肺部纤维化㊁改善肺结构㊁提高BPD 存活率㊂1㊀MSC1．1㊀MSC 生物学特性㊀间充质来源的祖细胞/干细胞称间充质干细胞,其概念最初是由Friedenstein 等[1]于20世纪70年代提出的㊂其发现了骨髓中的非造血祖细胞成分,并称之为成纤维细胞集落形成单位(CFU-F )㊂2005年国际细胞治疗协会(the Interna-tional Society for Cellular Therapy ,ISCT )提出了定义人多潜能的MSC 基本标准[2]:(1)纺锤形,在标准培养条件下贴壁生长;(2)表达CD 105+㊁CD 73+㊁CD 90+,不表达造血细胞表面标志物CD 34㊁CD 45㊁CD 11㊁CD 19以及DLA-DR ;(3)在体外特定刺激下,细胞可分化为软骨细胞㊁脂肪细胞和成骨细胞㊂1．2㊀MSC 来源的选择㊀有研究表明,MSC 不仅存在于骨髓㊁脂肪组织㊁胎盘,还存在于脐血㊁胎儿内脏等,脐带作为胎儿与母体间的营养桥梁,其中也含有丰富的MSC ㊂最近有研究指出,脐带源性MSC 具有更强的增殖分化潜能,在生物学上更接近胚胎干细胞,易于分离㊁纯度高㊁无致瘤潜能㊁低免疫原性且不受伦理及法理的限制,使其成为MSC 的最佳来源[3]㊂1．3㊀MSC 在医学领域上的应用㊀MSC 具有广泛的分化潜能和进行移植的可能性,还具有免疫抑制效应万方数据并能在培养中增殖,这些都使人们对于MSC通过静脉注射或定点给药的方法来应用于临床各种病理治疗的兴趣大大增加㊂一期临床研究证明了MSC移植的安全性以及移植受体对其良好的耐受性[4]㊂从这以后,临床试验已经在缺血缺氧性脑病㊁阿兹海默症㊁骨髓增生异常综合征㊁心肌梗死㊁系统性红斑狼疮㊁1型㊁2型糖尿病㊁肝脏衰竭等疾病的防治等方面进行了大量研究[5]㊂2MSC治疗BPD的作用机制2．1㊀MSC的再生修复机制㊀BPD的发病因素为早产导致的肺发育不成熟,胎龄小于28周的超未成熟儿出生时肺刚脱离小管期进入囊泡期,肺泡还需4~6周才能发育,毛细血管和肺泡上皮基底膜刚开始融合,形成类似于成人的血气屏障,如果双层的毛细血管网没有融合,出生后婴儿将因为肺毛细血管发育不良而引起严重的低氧血症,且此阶段的胎儿气道上皮分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ),并开始产生肺表面活性物质,若肺表面活性物质分泌不足,可能出现肺不张或肺气肿㊂MSC可分化为多种非造血组织的实质细胞和表型㊂MSC可分化为支气管上皮细胞和Ⅰ型肺泡上皮细胞(AECⅠ)及AECⅡ㊂van Haaften[6]实验表明,MSC与离体肺组织共同培养时,可表达AECⅡ的免疫表型和超微结构特征,而其迁徙测验结果表明相较于正常肺组织,高氧损伤的肺组织更易吸引MSC㊂Krause等[7]和Ortiz等[8]研究表明,MSC可迁徙至受损肺组织并分化为AECⅡ㊂MSC可促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的形成,VEGF是一种对内皮细胞有高度选择性且强有效的促细胞分裂素,研究表明VEGF可特异地作用于血管内皮细胞,并诱导基质金属蛋白酶和胶原酶的表达,促进细胞外基质降解,利于内皮细胞移行,从而诱导内皮细胞的迁移,为新生血管的产生做准备[9]㊂有研究报道指出高氧可致VEGF的表下调,从而抑制肺发育过程中的肺泡化及血管生成㊂Zhang等[10]研究发现在高氧下VEGF的mRNA㊁蛋白表达水平明显下调,而经MSC治疗3d后,VEGF的蛋白表达较治疗前上调,治疗14d后,VEGF的mRNA表达水平上调㊂Chang 等[11]研究表明,沉默VEGF,可消除MSC在高氧引起细胞死亡中的保护作用,上调促炎细胞因子表达㊂同时,MSC可减轻高氧所致大鼠肺损伤模型中肺泡化及血管的损伤㊂2．2㊀抗炎免疫调节作用㊀炎性反应是BPD发病中的关键环节,高氧引起的活性氧代谢产物是BPD发病过程中的关键炎性介质,早产儿出生后常暴露于机械通气㊁高氧及气压伤中,导致肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤,引起肺微血管通透性增高,肺泡渗出液增多,进一步触发炎性因子瀑布反应㊂Gupta 等[12]发现移植MSC能够降低大鼠肺泡灌洗液(BALF)炎性因子MIP-2和TNF-α浓度以及髓过氧化酶(MPO)活性,升高肺泡灌洗液及血浆中抗炎因子L-10的水平,减轻大鼠肺损伤㊂Chang等[13-14]研究证实了MSC的移植能够减轻肺部炎症反应,减低炎症因子IL-1a㊁IL-1b㊁IL-6及TNF-α水平㊂Curley等[15]在机械通气引起大鼠肺损伤模型中,证明MSC可以降低TNF-α水平,同时升高IL-10水平因此降低肺泡炎症反应以及肺组织损伤㊂Ortiz等[8]发现MSC可以产生IL-1RA,明显减轻肺纤维化及肺胶原蛋白的堆积㊂HGF是MSC分泌的另一种特殊上皮生长因子,具有调节细胞通透性的作用㊂Birukova 等[16]研究发现HGF可以通过Tiaml活化Rac基因,抑制RhoGTP酶的活性来缩短细胞间的距离,阻止肌动蛋白应力纤维的形成,稳定肺微血管内皮细胞,减轻肺血管内皮细胞通透性,从而减轻炎症反应㊂此外,MSC可以抑制自然杀伤(NK)细胞对靶细胞的溶解作用㊂MSC不仅能强烈抑制IL-2诱导的NK细胞增殖,还能降低NK细胞的细胞毒性及分泌活性,其机制可能和NK细胞表面活性受体(如NKp30㊁NKp44㊁NKG2D)的表达下调有关[17]㊂2．3㊀MSC的旁分泌机制㊀MSC具有多向分化潜能,可募集㊁迁移至损伤部位并增殖㊁分化为Ⅰ㊁Ⅱ型肺上皮细胞等,这一度被认为是MSC参与肺损伤修复的主要机制㊂但随着研究的不断深入,关于MSC治疗肺部疾病的多项临床前研究表明,MSC在肺部虽有植入,但较低的植入量与损伤修复效果不成比例,表示可能存在旁分泌机制㊂Liang等[18]在实验中观察到MSC的标准培养基能够抑制肺血管平滑肌细胞的增殖,提示可能MSC本身具有免疫调节功能外,还能分泌抗平滑肌细胞增生的因子,这些因子直接抑制了血管的重构㊂Hansmann等[19]为了验证MSC的条件培养基能够逆转BPD及肺动脉高压的损伤,予以静脉注射MSC,结果显示其能够部分逆转肺泡损伤及完全逆转轻度肺动脉高压㊂Aslam等[20]研究表明在高氧致新生鼠肺损伤模型中应用单剂量的MSC标准培养基,短时间内减轻了肺部炎症的浸润,表明在培养基中含有抗炎介质㊂同时标准培养基还能够抑制右心室肥大㊁血管重建㊁以及血管壁的增厚㊂Lee 等[21]在低氧预处理的小鼠中予以MSC标准培养基,通过抑制巨噬细胞的聚集,抑制包括单核细胞趋化因子-1㊁缺氧诱导分化因子-1㊁缺氧诱导有丝分裂因子万方数据在内的炎症因子的表达,从而能够减轻肺部早期的炎症反应并预防后期因缺氧引起的血管重构及肺动脉高压㊂这些实验结果表明细胞植入并非损伤修复所必需,干细胞分泌物在损伤修复中可能具有重要作用㊂为了验证MSC的分泌因子,Dorronsoro和Robbins[22]通过蛋白质组学测得了一些炎症调节因子,基质成分以及一些与来源于不同细胞类型的胞外囊泡紧密相连的蛋白㊂这些蛋白包括CD63㊁CD81㊁膜突蛋白㊁热休克蛋白等主要储存于多囊体中的外泌体内并以膜融合的方式释放㊂外泌体介导的细胞间功能mRNA与非编码区RNA的水平调节,被认为是细胞与细胞间的通讯机制㊂外泌体可提供不同的信号,包括蛋白质㊁脂类㊁核酸类物质如mRNA㊁非编码RNA㊁线粒体等,改变受体细胞的信号通路,重塑肺功能[23]㊂3㊀MSC治疗BPD的热点问题3．1㊀MSC的移植时机㊀有研究指出BPD细胞治疗在损伤早期进行干预的效果优于晚期的补救治疗㊂目前一些研究选择移植的时间点不尽相同㊂Ortiz等[8]在博来霉素引起小鼠肺纤维化损伤的模型中,证明在博来霉素暴露后马上移植MSC的治疗效果比博来霉素暴露一周后移植MSC有效,研究表明早期移植能明显减少因博来霉素引起的肺纤维化和肺内胶原蛋白沉积㊂Zhang等[10]选择高氧暴露后第7天,van Haff-ten等[6]选择高氧暴露后的第4天移植MSC,实验结果均表明MSC移植可以减轻高氧所致肺损伤㊂Chang等[13]就移植时间的选择上进行试验研究,将新生鼠置于高氧环境下21d,同剂量的MSC不同时间点移植,早期(生后3d),晚期(生后10d),联合期(生后3d+生后10d),结果显示相较于晚期,早期及联合期移植明显减轻了因高氧引起的炎症因子(如IL-1α㊁IL-1β㊁IL-6)㊁生长转换因子-β的增加,同时明显上调了肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)及VEGF的表达㊂然而早期组与联合组间差异并没有统计学差异㊂3．2㊀MSC的移植途径㊀目前MSC治疗BPD的移植途径主要有静脉注射㊁腹腔注射及气道滴入㊂大量实验研究表明上述途径具有一定的治疗效果㊂Zhang 等[10]实验表明静脉注入MSC,能够提高高氧暴露下鼠的生存率,减轻高氧所致的肺损伤㊂Aslam等[20]发现予以静脉注射MSC可预防因高氧引起的小鼠肺动脉高压及肺血管的重构㊂Waszak等[24]在高氧诱导大鼠BPD模型中发现经腹腔内注射MSC-CM,可维持肺泡的生长以及减轻肺动脉高压㊂Chang等[11]研究人脐血MSC腹腔内或气管内移植能否减轻高氧造成的肺损伤,实验结果显示高氧引起的髓过氧化物酶及IL-6的mRNA升高在两种途径下都有减轻,然而只有气管内移植的MSC能够明显减轻肺泡受损,下调TNF-α㊁TGF-β㊁α-SMA蛋白的表达以及减少胶原蛋白的沉积㊂3．3㊀MSC的移植数量㊀Chang等[14]为探索MSC最优移植数量,将3组不同数量5ˑ103cells(HT1)㊁5ˑ104cells(HT2)及5ˑ105cells(HT3)MSC经气管移植入高氧所致肺损伤的大鼠体内,与HT1组相比,在HT2及HT3组中,因氧所致的肺损伤如肺泡化减少㊁胶原蛋白沉积及髓过氧化物水平升高等明显缓解,这些由于高氧所致的肺损伤明显得到缓解,说明大剂量的治疗效果更为理想,随后Chang等[25]又再将MSC应用于临床实验,实验中将两组不同剂量MSC,低剂量组(1ˑ107cells/kg)和高剂量组(2ˑ107cells/kg),经气管插管移植入高BPD风险的早产儿肺内,发现相对于低剂量组,高剂量组似乎上机的时间更长,BPD严重度评分更高,尽管没有统计学意义的差别,但这与临床前试验的结果相矛盾㊂另一临床试验,中国医科大学将常规治疗无效的6个月以内重症BPD患儿纳入临床研究范围,予以气管插管肺内移植MSC3ˑ106cells/kg,第一阶段检测肺泡灌洗液中炎症因子水平变化,第二阶段观察胸片的改变[3]㊂然而遗憾的是,目前为止,并未有报道㊂4㊀结语尽管近年来围生期的护理保健取得较大进步, BPD的发生率和病死率仍然较高以及存在呼吸系统和神经系统远期并发症㊂MSC为BPD提供了良好的临床前实验结果㊂随着MSC机制研究的不断深入,大量实验表明MSC主要通过外分泌体/微泡传递细胞-细胞间的信号,促进损伤修复,调节免疫及抑制炎症,进而减缓BPD发病进程或减轻BPD严重程度㊂然而目前MSC临床应用尚未形成规范化,存在一些问题亟需解决,如最合适的治疗时机㊁给药途径㊁最有效的细胞归巢㊁移植的数量㊁MSC可溶性旁分泌因子的提取等㊂对于阐明MSC治疗BPD作用机制的研究仍在继续,以期将来出现完整而安全治疗BPD的方案㊂参㊀考㊀文㊀献[1]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors innormal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Exp Hematol, 1976,4(5):267-274.[2]Horwitz EM,Le BK,Dominici M,et al.Clarification of the nomen-clature for MSC:The International Society for Cellular Therapy posi-tion statement[J].Cytotherapy,2005,7(5):393-395.DOI:10.1080/14653240500319234.[3]孙雨辰.干细胞治疗支气管肺发育不良新进展[J].国际儿科学杂万方数据志,2015,42(6):607-611.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4408.2015.06.002.[4]王劲,陈燕,王琳,等.骨髓间充质干细胞的旁分泌作用研究进展[J].中国小儿急救医学,2016(1):57-61.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4912.2016.01.014.[5]Kalaszczynska I,Ferdyn K.Whartonᶄs jelly derived mesenchymalstem cells:future of regenerative medicine?Recent findings and clin-ical significance[J].Biomed Res 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