生物反应器

在补料的同时间断地采出一定量的发酵液体产物， 延长发酵培养周期，发酵周期常常由于菌体的老 化而结束。
第四节 生物反应器的放大
生物反应器的放大是指在反应器的设计与 操作上，将小型反应器中的最优反应结果 转移至工业规模生物反应器中重现的过程。 传统上生物反应过程的开发，通常经历实 验室小型试验、中间试验和工厂化规模放 大的3个阶段。
工厂化规模放大

一般是在完成设计工作后进行一段时间的 试验生产，最终建立合理的工艺条件。
在上述3个阶段的不同大小的反应器中进 行相同的生物反应时，由于规模的不同， 生物反应器的流体流动与动量传递、热 量传递和质量传递特性存在差异，有可 能导致在生产反应器上不能达到实验室 反应器的最优反应结果。 如何通过估计不同规模生物反应器中的 过程状态，对放大的反应器进行合理配 置，使其进行的反应过程与实验反应器 的细胞生长与代谢过程相似，这就是生
由表中数据看出体积增加、频率下降及无挡板对传氧都是不 利的，实验室数据在放大成罐操作时还是很有参考价值的。
(2)搅拌罐中的传氧系数kLα

搅拌罐中的传氧系数与体系的特性、罐及 搅拌桨的几何尺寸、操作参数等有关，不 少研究者得出了许多关联式，因所用的罐 体系和几何尺寸不同得到的式子有些是矛 盾的。下面只介绍几个文献上常引用的关 联式。
如荷兰的 GenPharm 公司用转基 因牛生产乳 铁蛋白，预 计每年从牛 奶生产出来 营养奶粉的 销售额是50 亿美元。
研究生物反应器的目的
要确定为达到一定的生产目的需要多大的 生物反应器，什么样的结构更好； 对已有的生物反应器进行分析，达到优化 的目的； 分析各种生物反应器的数据，从而对细胞 的生长、代谢等过程有更深入的理解。
第一章
生物反应器 （Bioreactor ）
第一节

概述
传统生物工业中使用的生物反应器称为“发酵罐” （fermenter）。20世纪70年代， Atkinson提出了生化反应器（biochemical reactor）一词，其含义除包括原有发酵罐外， 还包括酶反应器、处理废水用反应器等。与此同 时，Ollis提出了另一术语－生物反应器 （biological reactor）。进入80年代，生物 反应器（bioreactor）一词在专业期刊与书籍 中大量出现。

1.机械搅拌式反应器
机械搅拌式反应器

优点：适用性好，适应性强，从小型到 中型、到大型的细胞培养过程都可以用， 放大容易。 缺点：罐内的机械搅拌剪切力容易损伤 娇嫩的细胞，造成某些细胞培养过程减 产

2. 气升式反应器

优点：反应器内整体混合均匀，而且因不 用机械搅拌桨，减少了剪切作用对细胞的 伤害。由于液体循环流动速度较快，因此 反应器内供氧及传感都较好。 缺点：较高（从十几米到几十米高），因 而空气压缩机出口的压力较高。对反应器 设计要求较高，外循环困难。

根据上述两方面的考虑，对细胞群体可以 有4种模型。

在工程上应用最多的是非结构非离散模 型，通常简称均衡生长模型。

特点：不考虑细胞内部的结构（组分），
又不考虑各种细胞之间有任何差异，因 此可以把细胞用“浓度”这一个量来描 述，即把细胞看成一种“溶质”，从而 简化了胞内外的传递过程分析，也简化 了过程的数学描述。

第二节 细胞生长及代谢过程动力学
一、细胞生长的特点、描述方法的分类度的变化量。 （2）得率系数：两种物质得失之间的计量比。 （3）比速率：单位浓度的菌体单位时间引起某 物质浓度的变化量。
在作动力学分析时比速率的概念是很重要的，它 表示菌体活力的大小，能力的大小。
牛顿型流体和非牛顿型流体

服从此定律的流体称为牛顿型流体。所有 气体和大多数液体都属于这一类； 不服从牛顿粘性定律的称为非牛顿型流体。 如某些高分子溶液，胶体溶液、泥浆都属 于这一类。


一般细菌、酵母在低浓度下为牛顿型流体， 丝状菌或高密度培养时发酵液呈非牛顿型 流体性质。
研究搅拌功率往往从最简单的情况开始： 先研究牛顿型流体不通气时功耗Po，再研 究牛顿型流体通气时功耗Pg，再研究非牛 顿型流体不通气及通气时的功耗。
生物反应器的定义

生物反应器就是为适应生物反应的特点而 设计的反应设备。而所谓生物反应则是由 各种不同的或一系列的生物催化剂——酶 在各种不同条件下催化的一个或一系列的 反应，从本质上说都是酶反应，故生物反 应器实质上就是酶反应器。
因为历史原因，人们往常将适合于利用 生长的和非固定化的细胞进行反应的生 物反应器称为发酵罐、其余各类称为酶 反应器。 国外有学者认为，生物反应器不同于传 统发酵罐的一个要点是“新”，就是指 采用固定化生物催化剂（无论酶或细胞、 组织）的反应器。 国内有权威人士提出，生物反应器即是 酶反应器、微生物反应器（发酵罐）和 动植物细胞培养用反应器的统称。
注意：
（4）理想流动与非理想流动
在研究小型反应器时根据其流动特点分为两种理想流 动模式： 一、全混式：反应器内各点浓度及其他条件均一； 二、活塞流式：反应器内物质沿一定方向流动， 完全没有反向混合。
（5）细胞生长的特点及细胞群体的描述
细胞的生长（繁殖）、代谢是一个复杂的 生物化学过程，既包含有各种细胞内的生 化反应，胞内与胞外的物质交换也包含有 胞外的物质传递及生化反应。这个反应体 系的特点是它是一种多相、多组分、非线 性的体系。
生物反应器
细胞 生物反 培养液（养分） 应器
蛋白质、疫苗…
组织…
转基因动物是指 通过实验方法，人工 地把外源基因导入动 物的受精卵（或早期 胚胎细胞），使外源 基因与动物本身的基 因组整合在一起，因 而外源基因能随细胞 的分裂而增殖，并能 稳定地遗传给下一代 的一类动物。
1982年，R.D.Palmiter 等科学家将金属硫蛋白 基因的启动子和大白鼠 生长激素基因拼接成融 合基因，把这种基因导 入小白鼠的受精卵，再 将这一受精卵移植到一 借腹怀孕的母鼠体内， 生下来的小鼠比正常小 鼠体格大一倍，称为 “巨鼠”。

2. 氧的传递

前面已讲过，氧的传递能力的好坏是由 kLα（传氧系数）来衡量的，它受流体物 性、反应器尺寸、操作条件等各方面的影 响。氧的传递又常限制细胞的生长，所以 这里我们先研究一下摇瓶培养中的传氧， 再研究发酵罐中的传氧。
(1) 摇瓶培养中的传氧

氧的传递除受流体物性的影响外，主要受 摇动频率(r／min)、装料体积及有无档 板的影响，下表给出用亚硫酸钠溶液测得 的传氧系数、供氧速率(OTR)与各因素的 关系。

物反应器放大的基本任务。
成功放大的例子
中国维生素C的两步发酵过程正在使用单
台容量为200～300m3的气升式反应器； 国际上乙酸生产的塔式反应器单台容量 已达到1000m3； 酵母单细胞蛋白的单台塔式反应器容量 达到2000m3。
一、 概述

1. 氧的供给 在发酵过程中，氧是如何得到供应的呢？
多相：体系内常含有气相、液相以及菌体 （固）相。 多组分：在培养液中有各种营养成分。 非线性：细胞的代谢过程通常不能用线性 方程或方程组来描述，即使简化模型中 的参数也常具有时变性。
对这样复杂的体系进行描述几乎 是不可能的。
通常对细胞群体所进行简化假设

是否考虑细胞内部复杂的结构？

是否考虑细胞之间的差别？


New Brunswick Scientific Co., Inc. (American, NBS Co.)

Biostat B2
Biostat ED10
Pilot Biostat UD50
各类生物反应器
机械搅拌式反应器
气升式反应器
鼓泡反应器 膜生物反应器 固定床和流化床反应器


实验得知，在深层培养中菌体摄取的是溶 解的氧，即气相的氧先溶在发酵液中再传 递给菌体。根据化工原理得知氧从气泡传 给发酵液的速率：

2. 罐内流体的混合
罐内流体的混合一方面是为了加强氧的传 递，另一方面使流体混合均匀避免局部过 浓或过稀的现象并强化菌体与营养物的接 触。 显然混合时间短些好。在反应器放大时混 合时间往往要要加长．通常小罐的混合时 间仅为几秒，而大罐的混合时间往往需要 几十秒以至分钟级。

小型试验阶段

主要任务是根据酶或细胞的生物学特性和催化 能力，研究生物反应的规律，选择合理的反应 器型式，确定其最优操作方式和操作条件。此 阶段的试验常在1～50L的实验室反应器中进 行。
中间试验（中试）

试验的重点是检验小型试验得出的最优设 计方案的可靠性，研究反应器几何尺度对 反应器操作性能的影响，之后对设计方案 进行一定的修正，并提出工业规模反应器 的设计与操作条件。中试研究一般在50～ 1000L的反应器中完成。
二、细胞浓度及其测量
1.直接测定法 2. 间接测定法



1.直接测定法 （1）细胞干重法:把一定体积的培养液离心、 收集细胞、洗涤、干燥、称重。 （2）显微计数法：利用显微镜和血球计数器 测定单位体积培养液中的细胞个数。 （3）平板计数法：将微生物培养液样品用无 菌生理盐水进行一系列的稀释（通常每次稀释 一个数量级），取一定量的稀释液均匀涂布在 培养皿中的固体平板培养基上，经一段时间的 培养，从平板上长出的菌落数、涂布的稀释液 体积以及稀释倍数可以算出原培养液中的微生 物浓度。 （4）浊度法：培养液的浊度或光密度与细胞 浓度成正比，因而可通过比色测定培养液中的 细胞浓度。

2.间接测定法
从图中可以看出，DNA含量的变化最小。

培养基中存在较多不溶性物质时，可以 通过测定构成细胞的大分子物质（如蛋 白质、RNA、DNA等)来确定细胞浓度。 采用这种方法来估计细胞浓度时，须确 定在培养过程中，这种组分在细胞中的 含量基本保持不变。