生工 细胞核蛋白提取试剂盒

细胞核蛋白质提取试剂盒 Nucleoprotein Extraction Kit
产品编号：C500009 包装规格：50 Assays 产品简介
本试剂盒提供独特的组份，采用特殊的非离子型去污剂，以及焦磷酸钠等数种蛋白磷酸酶和蛋白酶抑制试剂，能够在非变性和低渗的条件下裂解细胞，经过洗涤去除大部分胞质蛋白和膜蛋白，释放的细胞核能够保持完整，再用Lysis Buffer 对
细胞核蛋白质进行抽提的同时可以保持核蛋白质的活性，因此该产品可合适用于SDS-PAGE 电泳、Western Blot 、免疫共沉
淀、EMSA 、Pull Down 和转录调控等后续蛋白质或分子生物学相关实验的研究，每次可以从107
个培养细胞或200 mg 动物
组织提取核蛋白质，本试剂盒可以使用50次。

产品特点 1. 提取的核蛋白质可以最大限度的保持蛋白质的活性，可以用于EMSA ，转录因子分析的实验。

2. 可以从50x107
个培养细胞或50x200 mg 动物组织提取核蛋白。

3. 整个实验过程只需要45分钟左右。

4. 在提取的过程中，最大限度的减少了膜和胞质蛋白对核蛋白的污染。

5.
不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。

运输和保存条件
常温下运输，在收到后，将磷酸酶抑制剂，PMSF 和DTT 在-20℃的环境中保存，其余2-8℃保存，保质期一年。

产品组成 成分 C500009 Lysis Buffer 10 mL Hypotonic Buffer 50 mL 磷酸酶抑制剂 300 μL PMSF 600 μL DTT
60 μL
操作步骤
A 实体组织蛋白的提取 1. 在每1mL 冷Hypotonic Buffer 加入5 μL 磷酸酶抑制剂，10 μL PMSF 和1 μL DTT 混匀。

冰上保存数分钟待用。

2.
将100-200mg 固体组织置于培养皿中，手术剪将小块充分剪碎，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用PBS 洗涤两次，离心，取沉淀后加入0.6 mL 冷Hypotonic Buffer 混匀， 4℃下玻璃匀浆器上下手动匀浆30-50 次。

或超声破碎细胞，每次30 sec ，3～4 次，每次间隔1 min ，置于冰上冷却。

均质匀浆或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％，同时没有明显的组织小块。

3. 转移到1.5 mL 预冷的离心管，手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10 min ，震荡10 秒钟，混匀。

4.
在4℃，800g (3000 rpm)离心5 min ，立即弃上清，再加0.4 mL 冷Hypotonic Buffer 震荡洗涤沉淀 30sec ，再 4℃，2500 g (5000 rpm) 离心5 min ，弃掉上清。

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ü 在做实验步骤A2-4的过程中，要保持动作的连续性，以免对细胞核的完整性产生影响。

5.
再沉淀中加0.2 mL Lysis Buffer (每1 mL Lysis Buffer 冷加入5 μL 磷酸酶抑制剂, 10 μL PMSF 和1 μL DTT ）震荡将沉淀悬起，冰浴 20 分钟,再4℃15000 rpm (20000g) 离心10分钟，弃沉淀。

上清为核提取物，分装后-70℃保存。

ü 尽量不要吸取到沉淀，以免影响下游的某些实验。

B 培养细胞蛋白提取 1. 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10 mL/150 mm 培养板的冷PBS 洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液。

2. 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中，4℃，800 g (3000 rpm) 离心10 min ，再用10 mL/150 mm 培养板的冷PBS ，800 g (3000 rpm) 离心5 min 洗两次。

3. 在每1 mL 冷Hypotonic Buffer 加入5 μL 磷酸酶抑制剂和10 μL PMSF 和1 μL DTT ，混匀。

冰上保存数分钟待用。

4.
在上述培养板或离心管的细胞中，加入上述配制好的冷Hypotonic Buffer ，加入量如下表所示：
细胞数量 培养瓶或培养板的规格 Hypotonic Buffer 加入量 5×106
个 60 mm 培养板或75 cm 2
培养瓶 0.30 mL ～0.45 mL 1×107个 100 mm 培养板或150cm 2培养瓶
0.60 mL ～0.90 mL
5. 冷室或冰上操作，贴壁细胞用细胞刮子刮下，连Hypotonic Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中。

悬浮培养或裂解前刮下的贴壁细胞连Hypotonic Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中。

6. 手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10min ，震荡10sec ，混匀。

7.
以下步骤同实体组织蛋白的提取中的A4-5 步骤。

注意事项 1. 所有接触样品的用具及试剂均需预冷。

以免蛋白质的降解与失活。

2. 因为不同蛋白质和不同的实验，所需要的缓冲体系不同，提取后的蛋白质样品，如有必要，可透析除去其它一些盐份。

3. 可以使用（C500090）Sephadex 重力型脱盐柱脱盐或将缓冲液替换为实验所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。

4. 本试剂盒只提供磷酸酶抑制剂和PMSF 蛋白酶抑制试剂，可以根据实验的需要在Lysis Buffer 和Hypotonic Buffer 中加入一定浓度的其它蛋白酶抑制试剂，例如我公司生产的C600386，C600387或C510009。

5. 对于提取的蛋白质可以采用我公司生产的改良型BCA 蛋白质浓度定量试剂盒（C503051）或非干扰型蛋白质浓度定量试剂盒（C503071）或改良型Lowry 法蛋白质浓度定量试剂盒（C504041）对提取样品中的蛋白质进行定量。

6.
如果用于蛋白质质谱研究，请用请用我公司生产的铜染（C510017）或锌染（C510019）或质谱用快速银染试剂盒(C500021)对胶上的蛋白质进行染色，这些染色方法对蛋白质没有修饰作用，所以对质谱图没有影响。

对于一般的染色，可以采用无毒型考马氏亮蓝染色液（C503011）或高灵敏考马氏亮蓝染色液（C510041）来染色。

7. 使用后，请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气的物质发生化学反应。

8.
本试剂盒只能用于体外实验，不能用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果，概不承担责任。

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