20144科内讲课

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PCR产物检测
终点检测法（定性）
凝胶电泳分析法 点杂交法 微孔板夹心杂交法 PCR-ELISA
实时检测法（定量）
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PCR扩增产物的电泳分析
PCR电泳法是科研不可缺少的手段 琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳
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琼脂糖凝胶电泳
1. 凝胶与电泳缓冲液配制 2.核酸电泳的指示剂与染色剂
基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。
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荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号 作为荧光本底信号，荧光域值的缺 省设置是6-15个循环的荧光信号的 标准偏差的10倍，即：
threshold = 10 × SDcycle 6-15
基因扩增及其相关检测技术应用
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一、基因体外扩增
是指体外无细胞的分子克隆或酶促扩 增。 以 DNA 或RNA 分子为模板，在 引物诱导下，根据碱基配对原则， 利用反应体系中的 dNTPs 为原料，酶 促合成新的DNA序列，使基因拷贝数 得以增多的技术。
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基因体外扩增方法
Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜，Mg 2+对PCR扩增的 特异性和产量有显著的影响
Mg 2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少
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PCR反应条件的选择
缓冲液: pH 8.3～8.8 ，Tris-HCl缓冲液 10～50mMol/L
PCR反应温度与时间 循环次数
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温度与时间
三温度法：
90 ～ 95℃（94 ℃ 10S）变性 30s 40 ～ 60℃ （55℃ 30S）退火，30s~1min 70 ～ 75℃ （72 ℃ 40S ）延伸，1~2min
二温度点法
94℃变性（ 94 ℃ 5S ） 60℃左右退火与延伸（60℃ 40S）
聚合酶链式反应（PCR） 以PCR技术为基础的相关技术（逆转录
PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR、 原位PCR、单细胞PCR等……） 实时PCR PCR产物分析 ……
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（一）PCR技术
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PCR（polymerase chain reaction）
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TaqMan荧光探针
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循环次数：
循环次数决定PCR扩增量。在其他参数都优化的条 件下，最适循环次数取决于靶序列的初始浓度。初 始浓度较低时，要增加循环次数。酶的活性不好或 量不足时，也要增加循环次数，已达到有效扩增量。
一般的循环次数选在30～40次之间。 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR引物的要求： 片段特异、长度、 C＋G%、浓度等。
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酶及其浓度：
两种Taq DNA聚合酶（Thermus Aquaticus）
从栖热水生杆菌中提纯的天然酶
大肠菌合成的基因工程酶。
浓度：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低 则合成产物量减少
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dNTPs：(A、C、G、T)
dNTPs四种脱氧核苷三磷酸是DNA合成的基本原料 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。 在PCR反应中，dNTP应为50～200 mol/L，浓度过
低又会降低PCR产物的产量太少，出现假阴性。
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模板核酸：
模板核酸提取质量是PCR成败与否的关键 环节之一
提取效率 扩增效率
传统的DNA纯化方法：
热板：
RNA模板提取一般采用：
异硫氰酸胍-氯仿-酚抽提法 蛋白酶K法-氯仿-酚抽提法
要防止RNase降解RNA：
干烤或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理
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Mg2+浓度：
Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，其浓度高低直接 影响着酶的活性与忠实性
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Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重 要的概念 —— Ct值。
C代表Cycle，循环次数。t代表 threshold，阈或界限之意。
Ct值的含义是：每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的 循环数。
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Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷 贝数的对数存在线性关系，起始拷 贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作 出标准曲线，其中横坐标代表起始 拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
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因此，只要获得未知样品的Ct值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。
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聚合酶链式反应： 指利用模板 DNA、 RNA 为指导，在引物引导下， DNA 聚 合酶促化合成、扩增 DNA 序列的技术。 又称体外分子克隆。
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PCR反应体系的组成:
• 引物 •酶 • dNTP • 模板 • Mg2+
• 探针
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引物：
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物 的特异性取决引物与模板DNA互补的程度。
溴酚兰 溴化乙锭染色法 3. 电泳： 4. 结果观察：
紫外仪上观察电泳带及其位置，并与 核酸分子量标准比较被扩增产物的大小
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琼脂糖凝胶电泳条带
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶的制备 电泳：电压为1-8V/cm 观察：
浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中， 15～30min后取出水洗紫外仪下观察结 果
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PCR电泳法检测的局限性
产物非杂交检测，特异性差 开放操作，扩增产物（百万倍）气溶胶
的污染问题突出 非定量检测，无法观察疗效 肉眼判读，人为误差（扫描） 溴化乙锭的致癌作用
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（二）实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR技术: 在PCR反应体系中加入荧光探针