大肠杆菌的鉴定方法
利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物(大肠杆菌)实验设计
利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物(大肠杆菌)实验设计实验目的：利用分子生物学方法鉴定食品中的致病微生物（大肠杆菌）。
实验材料和仪器：1.食品样品（可能受到大肠杆菌污染的食品样品）2.大肠杆菌纯培养物3.DNA提取试剂盒4.PCR试剂盒5.扩增仪6.DNA凝胶电泳仪7.DNA标记物8.电泳凝胶9.UV透射仪实验步骤：1.向含有大肠杆菌的培养物中添加适量的无菌水，制备测定标准曲线用工作溶液。
通过适量稀释，确保能获得包含一定数量大肠杆菌的工作溶液。
2.称取加热灭活的食品样品，如肉类或蔬菜，使用细菌培养基作为负对照。
3.提取食品样品中的细菌DNA。
使用DNA提取试剂盒，按照生产商的说明书操作，从食品样品中提取总DNA。
4. 设计适用于大肠杆菌的引物。
从GenBank数据库中检索适合大肠杆菌的引物序列并合成引物。
5.进行PCR扩增反应。
在PCR反应管中加入模板DNA，引物和PCR试剂盒提供的反应液，将其放入扩增仪中进行PCR扩增。
6.准备凝胶和电泳条件。
在适当的浓度下制备琼脂糖凝胶，并根据引物大小和预期DNA片段大小调整电泳条件。
7.进行PCR产物的电泳检测。
取PCR反应混合液5μL，以及DNA标记物，放入琼脂糖凝胶槽中进行电泳。
8.照相检测结果。
使用UV透射仪照射电泳凝胶，检查PCR产物的大小和带。
如果有大小适合的带出现，则该食品样品中存在大肠杆菌。
9.分析结果。
根据电泳凝胶的结果，判断食品样品中大肠杆菌的存在与否。
实验注意事项：1.实验过程中保持操作环境的高度无菌。
2.准备PCR反应混合液时，避免污染和交叉污染。
3.扩增后的产物严禁回收，以避免引入假阳性结果。
4.进行凝胶电泳时，注意电泳条件的调整，确保PCR产物可以清晰可见。
总结：该实验利用分子生物学方法对食品中的致病微生物（大肠杆菌）进行鉴定。
通过提取食品样品中的细菌DNA，并使用PCR扩增大肠杆菌特异序列，通过电泳检测分析PCR产物的大小和带，判断食品样品中是否存在大肠杆菌。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案实验原理：1、大肠杆菌的性质：大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：沙门氏杆菌是G-直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：（1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
（2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
（3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：（1）取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。
（2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：（1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理：1、大肠杆菌的性质:大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S,不能利用xx酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：-沙门氏杆菌是G直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：(1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
(2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
(3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：(1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。
(2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：(1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌的鉴定方法主要有以下几种：
1.形态学鉴定：通过显微镜观察大肠杆菌的形态、大小、颜色等，来确定其种属。
2. 生理生化鉴定：通过大肠杆菌的代谢特征，如糖代谢、氧化酶、蛋白质降解、生长要求等来进行鉴定，常见用于此类鉴定的试剂有
Triple Sugar Iron Agar（三糖铁素琼脂）、Lysine Iron Agar（赖氨酸铁素琼脂），并且在不同的温度下观察细菌的生长状况，进行鉴定。
3.分子生物学鉴定：通过基因测序、PCR等技术，将大肠杆菌的DNA 进行鉴定，如16SrRNA测序，单核苷酸多态性（SNP）分析等。
4.免疫学鉴定：通过免疫学反应进行鉴定，如ELISA、免疫电泳等。
大肠杆菌的检验方法
大肠杆菌的检验方法样品制备：以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
LST和EC初步筛选：对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。
将接种管置于36±1℃培养48±2h。
观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。
EMB平板：取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。
生化试验：将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
大肠杆菌核酸鉴定实验报告
大肠杆菌核酸鉴定实验报告大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，它在人和动物的肠道中起着重要的生理功能。
然而，某些菌株可能会引起食物中毒和感染等健康问题。
对大肠杆菌进行核酸鉴定是非常重要的。
本报告将详细介绍大肠杆菌核酸鉴定实验的过程、结果和分析。
一、实验目的本实验旨在通过核酸鉴定技术确认样品中是否存在大肠杆菌，并进一步了解其亚型和相关特性。
二、实验原理核酸鉴定是通过特定引物与目标DNA序列发生互补配对，借助聚合酶链反应（PCR）扩增目标序列，并通过凝胶电泳分析扩增产物。
在本实验中，我们将使用16S rRNA基因作为靶标序列进行核酸检测。
三、实验步骤1. 样品处理：将待检测样品（如食物、水或环境样品）进行预处理，包括培养基预处理、细胞破碎等步骤，以提取出目标DNA。
2. PCR扩增：设计合适的引物，将目标序列进行PCR扩增。
反应体系包括DNA模板、引物、聚合酶和缓冲液等。
3. 凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，通过电泳分离，根据迁移距离判断是否存在大肠杆菌。
4. 提取目标DNA：从凝胶上切下目标带，使用商业化的基因提取试剂盒进行目标DNA的提取。
5. DNA测序：将提取得到的目标DNA进行测序，并获取测序结果。
四、实验结果经过PCR扩增和凝胶电泳分析，我们观察到了预期大小的PCR产物带。
进一步通过基因提取和测序，我们成功获取了大肠杆菌16S rRNA 基因的序列。
五、实验分析1. 序列比对：将测得的16S rRNA基因序列与已知大肠杆菌参考序列进行比对，可以确定样品中存在的大肠杆菌亚型。
2. 亲缘关系分析：利用已知大肠杆菌亚型构建系统发生树，并将样品中的亚型与之进行比较，以了解它们之间的亲缘关系。
3. 特性分析：通过比对已知大肠杆菌的特性数据库，分析样品中的大肠杆菌可能具有的毒力因子、耐药性等特性。
六、实验结论通过核酸鉴定技术，我们确认了待测样品中存在大肠杆菌，并获取了其16S rRNA基因序列。
肠杆菌科生化鉴定实验
肠杆菌科生化鉴定实验
肠杆菌科是一类常见的革兰氏阴性细菌，可以通过一系列
生化鉴定实验来进行鉴定。
以下是一些常用的肠杆菌科生
化鉴定实验：
1. 硫代硫酸亚铁（TSI）琼脂糖培养基实验：在TSI琼脂
糖培养基上培养菌株，观察菌落的颜色和气体产生情况。
肠杆菌科细菌在该培养基上产生酸和气体，导致培养基中
的pH下降，产生黄色酸性反应。
2. 尿素水解试验：将菌株接种到尿素水解培养基上，观察
培养基的颜色变化。
肠杆菌科细菌中的一些种类能够产生
尿素酶，将尿素水解为氨和二氧化碳，导致培养基变为粉
红色。
3. 大肠杆菌甲醛试验：将菌株接种到含有甲醛的培养基上，观察培养基的颜色变化。
肠杆菌科细菌中的大肠杆菌能够
利用甲醛作为唯一的碳源，产生酸和气体，导致培养基变
为黄色。
4. 气体产生试验：将菌株接种到气体产生管中，观察管内
气体的产生情况。
肠杆菌科细菌中的一些种类能够产生气体，如氢气和二氧化碳。
5. 青霉素酶试验：将菌株接种到含有青霉素的培养基上，
观察菌落的形成情况。
肠杆菌科细菌中的一些种类能够产
生青霉素酶，使得培养基中的青霉素失活，导致菌落形成。
需要注意的是，肠杆菌科细菌的鉴定通常需要结合多个实验结果进行综合判断，单一实验结果可能不足以确定菌株的分类。
此外，不同的肠杆菌科细菌种类可能在生化反应上有差异，因此具体的实验步骤和判断标准可能会有所不同。
大肠杆菌的分离鉴定PPT课件
• 结果：培养液不变色----无变化（—）
培养液变为黄色----产 酸（+） 培养液变黄并有气泡----产酸产气（+）
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9
2 硫化氢试验
• 原理：某些细菌能分离蛋白质中的含硫氨基酸， 生成硫化氢，遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑 色的沉淀物。
• 方法：将需要鉴别的细菌纯培养物，分别接种在 硫化氢培养基中，370C温箱内培养24h
• 结果：培养基变黑为阳性，不产生黑色为阴性。 大肠杆菌为阴性，沙门氏菌为阳性
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3 硝酸盐还原实验
• 原理：有些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚 硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐与对位氨基苯 磺酸起作用后，在与α-萘胺反应，生成红色偶氮 化合物。
大肠杆菌的分离鉴定、药敏实 验及生化实验
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1
目的要求
• 熟悉鉴别培养基的原理 • 了解大肠杆菌的主要生理生化特性
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2
一、鉴别培养
菌种 培养基类别
麦康凯培养基
大肠杆菌
红色菌落
沙门氏杆菌
无色或浅黄色菌落
SS琼脂培养基
红色菌落
浅黄色菌落
伊红美兰琼脂培养基
三塘铁培养基
紫红色或紫黑色并带有金 粉红色菌落 属光泽菌落
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术式
两试管斜面移植时，左手斜持菌种管 和被接种管，管口相齐，管底放在拇指和食 指间，松动两管棉塞，将管口进行火焰灭菌， 使其靠近火焰，将接种环深入管内，先在无 菌生长的培养基上接触使之冷却，再挑取少 量的细菌后，拉出接种环，立即伸入另一管 斜面培养基上，勿碰到斜面和管壁，直达斜 面底部，从底部开始划曲线，向上到斜面顶 端，管口火焰灭菌，塞好棉塞，接种完毕。 接种环火焰灭菌后，放下接种棒最后在斜面 管壁上注明日期、接种者。置370C，温箱培 养精选PPT课件 Nhomakorabea5
简述大肠杆菌的鉴定流程
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在进行大肠杆菌鉴定之前，需要做好充分的准备。
大肠杆菌标准
大肠杆菌标准大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰氏阴性杆菌，是人和动物肠道内的正常菌群之一。
它在自然界中广泛分布，同时也是一种重要的微生物资源。
大肠杆菌在食品安全和环境卫生中起着重要作用，因此对其进行标准化管理至关重要。
首先，大肠杆菌的检测标准是食品安全的重要环节。
食品中的大肠杆菌检测是保障食品安全的重要手段之一。
根据相关标准，食品中大肠杆菌的检测方法主要包括培养法和分子生物学方法。
培养法是将食品样品在特定的培养基上进行培养，然后根据形态、生理特性进行鉴定。
而分子生物学方法则是通过PCR、实时荧光定量PCR等技术进行检测，具有快速、准确的特点。
食品中大肠杆菌的检测标准对于保障食品安全、预防食源性疾病具有重要意义。
其次，大肠杆菌在环境卫生中的标准管理也是至关重要的。
大肠杆菌是一种常见的致病菌，其在环境中的存在往往意味着污染和卫生问题。
因此，对于水质、土壤、空气等环境中大肠杆菌的监测和管理至关重要。
相关的环境标准和监测方法能够有效地评估环境卫生状况，预防疾病的传播和环境污染的发生。
此外，大肠杆菌在医药领域中的标准化管理也是非常重要的。
大肠杆菌在医药领域中既是一种重要的微生物资源，又是一种常见的致病菌。
因此，对于医药原料、药品、医疗器械等的生产过程中，对大肠杆菌的监测和管理是必不可少的。
相关的标准和管理措施能够有效地保障医药产品的质量和安全，防止交叉感染和医院感染的发生。
综上所述，大肠杆菌的标准管理涉及食品安全、环境卫生、医药领域等多个方面，对于保障公众健康和社会稳定具有重要意义。
相关的标准和管理措施能够有效地预防疾病的传播、保障食品安全、维护环境卫生，是现代社会发展的重要保障之一。
因此，各个领域的相关部门和机构应加强对大肠杆菌的标准化管理，不断完善相关标准和监测方法，提高对大肠杆菌的检测和管理水平，为公众健康和社会稳定作出更大的贡献。
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大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌是常见的肠道细菌，广泛存在于自然环境中，包括土壤、水
体和动植物体内。
它是引起人类肠道感染和食源性疾病的重要致病菌之一、准确鉴定大肠杆菌的方法对于食品安全和公共卫生至关重要。
下面将介绍
常见的大肠杆菌鉴定方法。
1.外观和生理鉴定
大肠杆菌形态特征为革兰阴性，为短杆状细菌，常产生单一或双子。
在艾柯培养基上，大肠杆菌形成典型的金黄色、大且圆形的菌落，使用其
可以初步鉴定大肠杆菌。
大肠杆菌是革兰阴性细菌，可以通过革兰氏染色进行鉴定。
大肠杆菌
的细胞壁含有脂多糖，染色后呈现红色。
2.纯培养和典型菌落的选择
将样品接种于含有葡萄糖和肉汤的液体营养培养基中，经过16-24小
时的培养后，利用墨汁培养基将菌液分带于增菌板表面，进行分离纯化。
然后选择培养在巴斯德固体琼脂培养基上呈金黄色，并有金属光泽的典型
菌落。
3.酶活性测试
大肠杆菌具有多种酶活性，常用的酶活性测试有氧化/发酵测试、甲
基红松解试验和呈色反应等。
（1）氧化/发酵测试：大肠杆菌通常以无氧产酸为代谢途径进行葡萄
糖发酵。
将菌液接种于以葡萄糖为唯一碳源的气泡管中，通过产酸后的颜
色变化来鉴定大肠杆菌。
气泡管中产生黄色的酸性底部，说明转化为酸性，即为大肠杆菌。
（2）甲基红松解试验：大肠杆菌代谢糖酸，产生酸性代谢产物，导
致菌落周围的甲基红转为黄色。
通过添加甲基红指示剂，观察溶解指示剂
颜色的变化，由红色转为黄色可以初步鉴定大肠杆菌。
（3）呈色反应：大肠杆菌产生酶活性，能够将一些酶底物转化为有
颜色的产物。
例如，大肠杆菌在聚糖中生成酶胆红素琼脂糖，呈现金黄色。
这种特征可以用于大肠杆菌的鉴定。
4.生化和生理特性鉴定
（1）靛酚蓝糖蛋白胱氨酸琼脂糖（Ipv）试验：肠道杆菌能产生硫化氢，将外源底物半胱氨酸转化为硫化氢，使琼脂糖中的靛酚蓝变为铁蓝色，可以通过这个试验鉴定大肠杆菌。
（2）铁蛋白试验：大肠杆菌可以利用铁蛋白作为唯一的铁源进行生长，将铁蛋白分解为铁和胆红素，使培养基呈现深绿色，可通过这个试验
鉴定大肠杆菌。
（3）羧甲基红松解试验：羧甲基红和酱油酸钠与菌液混合反应后，
在酸性条件下，产生红色，可通过检测产物的颜色来鉴定大肠杆菌。
上述的鉴定方法是大肠杆菌的常见方法之一，但仍需要结合其他鉴定
手段进行综合判断，以确保准确鉴定。
例如，分子生物学方法如PCR和测
序可以用于检测大肠杆菌的DNA序列，并与已知的大肠杆菌序列进行比对。
这些方法对于大肠杆菌的准确鉴定至关重要，尤其是在食品安全和公共卫
生领域。