酶偶联显色比色法测定胰脂肪酶
临床生物化学检验-第7章 临床酶学检验技术
酶活性的国际单位定义； 酶活性测定的连续监测法的概念、计算和分 类；酶活性测定的影响因素及最适条件的确定原则。
血清酶变化的病理机制；酶动力学参数的含义；电泳法和免疫抑制法 测定同工酶的原理。
酶蛋白质量测定的优点；定时法测定临床常用诊断酶的原理和评价； 同工酶的其他检测方法。
2
第一阶段（1908 ~ 1950） ：利用化学和有机化学的反应原理测定酶促反应生成量或底物消耗量定 时法测定AMY (1908年， Wohlgemuth)、 LPS、ALP、ACP等几种酶。
2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号： 数字前冠以EC ，数字之间用黑点 隔开。第一个数字表示酶的类别 ，第二个表示亚类 ，第三个表示亚-亚类 ，第四个表示 酶的编号序数：如EC1.1.1.27 LD (乳酸脱氢酶)。
3. 同工酶：催化相同化学反应， 但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的
心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤 心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤 肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤
红细胞、前列腺、溶酶体 γ-GT1、 γ-GT2、 γ-GT3、γ-GT4
前列腺癌、血液病、骨肿瘤 肝癌、梗阻性黄疸
P-AMY(P1、P2、P3)、S-AMY(S1、 S2、 S3、S4) ALT、 mALT AST、 mAST
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连续监测法（continuous monitoring assay）： 在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量 ，选取线性期的速率来
计算酶活性 ，又称速率法。将酶与底物在特定条件 (缓冲液、温度等) 下孵育 ，每隔一定时间 (2s∼60s) 连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信 号的变化 ，从而计算出每分钟的信号变化速率 ，求 出酶活性浓度。 尤其适合在自动化分析仪上使用
体液总脂肪酶(lipase)活性比色法定量检测试剂盒产品说明
体液总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途体液总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物三丁酸二巯基丙醇受到脂肪酶水解，释放出巯基基团，使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心改良、成功实验证明的。
其适用于各种动物和人体各种体液包括尿液、脑脊液、唾液、精液等样品脂肪酶的总活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂质分子的酯键（ester bond）的水解。
在人体中，其来源于胰腺产生。
在消化系统中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），产生1个分子甘油（glycerol）和3个分子游离脂肪酸分子（fatty acid）。
脂肪酶异常增高与胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、肾病、唾液腺炎症、肠道阻塞等相关；异常降低则与胰腺中脂肪酶产生细胞的永久性损伤有关。
脂肪酶的活性检测是临床诊断的指标之一。
基于脂肪酶在水分子的参与下，催化三丁酸二巯基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，产生二巯基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并释放出巯基基团（－SH），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析脂肪酶的活性。
脂肪酶反应系统为：产品内容缓冲液（Reagent A）毫升反应液（Reagent B）毫升底色液（Reagent C）微升补充液（Reagent D）微升产品说明书1份保存方式保存反应液（Reagent B）和底色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent C）避免光照，有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品操作的容器微型台式离心机：用于样品制备恒温水槽：用于孵育反应比色皿或96孔板：用于反应和比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品准备1．准备好1.5毫升离心管2．移取1毫升液体（尿液/脑脊液/唾液/精液等）到离心管3．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）4．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管5．即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存6．（选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）二、测定准备1．准备好待测样品，置于冰槽里2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔10分钟，读数4次（共30分钟），并置零3．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度三、背景对照测定1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿2．加入xx微升底色液（Reagent C）3．上下倾倒数次，混匀4．在37℃温度下孵育3分钟5．加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（30分钟读数－0分钟读数）四、样品测定1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿2．加入xx微升反应液（Reagent B）3．加入xx微升底色液（Reagent C）4．上下倾倒数次，混匀5．在37℃温度下孵育3分钟6．加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）五、计算样品活性[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 1（体系容量；毫升）]÷[0.05（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔DMPTB/分钟六、酶标仪测定1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到所有孔里3．加入xx微升反应液（Reagent B）到样品孔里4．加入xx微升阴性液（Reagent D）到背景对照孔里5．分别加入xx微升底色液（Reagent C）到所有孔里6．轻轻摇动96孔板7．在37℃温度下孵育3分钟8．分别加入10微升待测样品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈，且pH为7.2）9．轻轻摇动96孔板10．即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟初始读数和30分钟读数）11．活性计算注意事项1．本产品为20次（96孔板，包括20次样品和20次背景对照）和5次（比色皿，包括5次样品和5次背景对照）操作2．本产品检测范围是40至1600毫单位/毫升3．建议样品采集后3小时内制备完成4．操作时，须戴手套5．每次样品测定，需要背景测定一次6．样品须澄清，至关重要7．样品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巯基乙醇、DTT等，否则干扰检测8．孵育反应完成后即刻进行比色测定9．比色测定后，比色皿须清洗彻底10．建议待测样本的蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒HL30030.1）11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度12．酶活性单位浓度定义：在37℃下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔三丁酸二巯基丙醇13．本公司提供系列医学生化检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。
幽门螺杆菌感染与血糖、血脂及谷丙转氨酶的相关性分析
甘肃医药2020年39卷第12期Gansu Medical Journal ，2020，Vol.39，No.12幽门螺杆菌（Hp ）寄居于人的胃部，是引起胃部疾病的重要致病因子，国内研究证实，Hp 感染与慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴样组织（MALT ）淋巴瘤及胃癌的发生发展密切相关［1］。
近年来，Hp 感染在消化道外的作用备受关注，有研究表明，Hp 感染与冠心病、脑梗死及糖尿病等的发生发展存在相关性［2-3］。
本研究在健康体检人群中展开调查，了解Hp 感染状况，探讨Hp 感染与血糖、血脂及谷丙转氨酶的关系。
1资料与方法1.1一般资料2018年1月至2019年12月在甘肃省疾病预防控制中心体检中心参加健康体检的2755人，既往检查未发现Hp 感染；本次检查前未确诊糖尿病、糖代谢受损或胰岛素抵抗，未曾使用过口服降糖药及胰岛素；无糖尿病家族史；无心肝肾功能不全；无恶性肿瘤，特别是消化道恶性肿瘤病史。
其中男性1679人，占60.94%；女性1076人，占39.06%。
年龄20~69岁，平均（42.36±11.23）岁。
1.2仪器与试剂仪器为日立7020型全自动生化分析仪，所有生化试剂、标准品均为原装配套，采用浙江东欧诊断产品有限公司的产品，质量控制品由英国朗道公司生产；幽门螺旋杆菌IgG 抗体检测试剂盒由爱博生物医药公司提供。
1.3方法1.3.1标本采集。
所有体检者均空腹8~12h ，于次日清晨抽取静脉血5mL 置于真空生化类试管中，及时分离血清，2~3h 内由全自动生化仪进行检测项目的测定。
1.3.2检测指标。
总胆固醇（TC ）、甘油三酯（TG ）采用酶偶联比色法检测、空腹血糖（FPG ）采用氧化酶法检测、谷丙转氨酶（ALT ）采用速率法检测、幽门螺杆菌IgG 抗体采用乳胶法检测。
1.3.3诊断标准。
根据2007年中国成人血脂异常防治指南［4］，TG ≥2.26mmol/L 为增高，TC ≥6.22mmol/L 为增高；根据2003年美国糖尿病协会（ADA ）标准［5］，FPG ≥6.9mmol/L 为增高；ALT>40μL/L 为增高。
脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。
其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。
近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。
脂肪酶在微生物中有广泛的分布。
脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。
脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。
1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂）1.1 脂肪酶活力定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
1.2 测定原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。
反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。
1.3 仪器设备恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器1.4 试剂溶液95％酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。
橄榄油(分析纯)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
酶标法实验报告(3篇)
第1篇一、实验名称酶标法检测实验二、实验目的1. 掌握酶标法的基本原理和操作步骤。
2. 了解酶标法在生物化学和免疫学中的应用。
3. 通过实验验证酶标法检测的准确性。
三、实验原理酶标法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原-抗体反应原理的免疫检测技术。
其基本原理是利用酶催化底物反应的特性，将抗原或抗体标记上酶，形成酶标抗原或酶标抗体。
当酶标抗原与相应抗体结合时，通过酶催化底物反应产生颜色变化，从而实现对抗原或抗体的定量或定性检测。
四、实验材料1. 试剂：酶标抗体、抗原、底物、洗涤剂、缓冲液等。
2. 仪器：酶标仪、移液器、离心机、冰箱等。
五、实验步骤1. 样本处理：将待测样本进行适当的处理，如离心、稀释等。
2. 包被：将抗原或抗体包被在96孔板中，室温下孵育过夜。
3. 洗涤：用洗涤剂将未结合的抗原或抗体洗去。
4. 加酶标抗体：将酶标抗体加入96孔板中，室温下孵育1小时。
5. 洗涤：用洗涤剂将未结合的酶标抗体洗去。
6. 加底物：将底物加入96孔板中，室温下孵育15分钟。
7. 显色：用显色剂显色，观察颜色变化。
8. 测定吸光度：用酶标仪测定各孔的吸光度值。
六、实验结果与分析1. 结果记录：将各孔的吸光度值记录在实验记录表上。
2. 数据处理：将实验数据输入计算机，进行统计分析。
3. 结果分析：- 比较各孔的吸光度值，判断抗原或抗体的存在。
- 计算标准曲线，根据吸光度值确定抗原或抗体的浓度。
七、讨论与结论1. 讨论：- 分析实验结果，讨论酶标法的优缺点。
- 讨论实验中可能出现的误差及原因。
- 探讨酶标法在生物化学和免疫学中的应用前景。
2. 结论：- 酶标法是一种灵敏、特异、简便的免疫检测技术。
- 通过本实验，掌握了酶标法的基本原理和操作步骤。
- 酶标法在生物化学和免疫学中具有广泛的应用前景。
八、注意事项1. 实验操作要规范，避免交叉污染。
2. 试剂要新鲜，避免使用过期试剂。
生化基础物质检测—酶活性检测
反应进程曲线（速率
时间（s）
法） 317 334 351 368 385 402
吸光度（A） 1.253 1.204 1.178 1.146 1.126 1.097
据此计算此酶的∆A/min
419 1.048
1.450
1.400
1.350
延滞期
1.300
预孵育期
终点法
1.250 1.200
速率法
线性期
指示酶
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P
待测物质 中间产物
终产物
酶偶联反应的原理：
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定
常用指示酶及其指示反应
1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
反应如下：
色原物质
Trinder反应：
POD
2H2O2 + 4-AAP + 酚
醌亚胺（红色） + 2H2O
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）
等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通 过Trinder反应加以测定
酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
吸光度(A）
氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下 列反应：
P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定
2.过氧化物酶（POD）
参考文献
三甲医院考察资料近期，我科去市里各三甲医院考察，看了各医院的项目、布局，现根据我院实际情况现总结如下：项目方面：（一）生化组：（1）检查急腹症、胰腺炎：可以将血、尿淀粉酶、血清脂肪酶联查。
（收费46元）优点：脂肪酶在胰腺炎的诊断上更具有特异性和更灵敏，是其特异性指标。
两种酶进行联查可以区分是急性胰腺炎还是其它急腹症。
解释：在胰腺炎时，血清脂肪酶比淀粉酶升高更早，下降更晚，且升高幅度大，因此比淀粉酶对急性胰腺炎的诊断敏感而且更具有特异性。
腮腺炎和巨淀粉酶血症、除急性胰腺炎外的其它急腹症时淀粉酶升高、血清脂肪酶不升高。
测定方法：血清酶偶联显色比色法试剂盒；试剂包装要小包装。
（2）本院做免疫五项项目解释：统计3个月的外检项目：1月份免疫五项18人次；2月份9人次（春节）；3月上半个月18人份。
应临床需求量的增大，可以进行开展。
（3）糖尿病患者进行两项组合检查（血糖、糖化血红蛋白）。
（4）心肌酶项目AST、LDH、HBDH、CK、CK-MB、Mb项目中AST去掉，建议更换为IMA(缺血修饰白蛋白)。
解释：AST与肝功项目重复，且特异性较差；而IMA(缺血修饰白蛋白)是诊断早期心肌（二）免疫组（1）女性肿瘤五项中可以把β2微球蛋白去掉，改为Ca153，筛查女性乳腺肿瘤。
（2）内一科和妇科建议：对于糖尿病人和孕妇可以实施TSH单查。
解释：有利于甲状腺七项的开展带动作用。
（3）INS+TSH联查用于孕妇和不孕人员检查。
（4）可以针对人群建议开展肿瘤全项，包括：男性（13项，收费：982 ）：AFP、CEA、CA199 、PSA 、FPSA 、NSE、角蛋白抗原211、铁蛋白、CA724、CA242、降钙素（CT）、鳞癌细胞抗原、β2微球蛋白。
女性（14项，收费：1078 ）：AFP、CEA、CA199 、CA125 、CA153、NSE、角蛋白抗原211、铁蛋白、CA724、CA242、降钙素（CT）、鳞癌细胞抗原、β2微球蛋白、人附睾蛋白HE4。