引物发卡结构测序
样品类型 测序情况 可能造成的原因 建议解决的方案 测序情 …
可能测序情况有异常
建议分析试做结果，并留言告是否需要 继续实验。
实验进行中。
实验目前未完成
可以留言咨询客服实验具体情况。
实验进行中，试做结果已上 订单样品数量较多，试做结果不理想，需 建议您分析试做结果，并留言告是否需
传，待客户确认。
要您的确认才能进行下一步测序。
要将剩余样品测完。
实验进行中，摇菌不成功，目 前正在进行划平板活化并重新 您提供的菌液活性较低。 挑单克隆。
样品用完
建议客户重新提供测序样品。
菌液、质粒 实验进行中，第一次摇菌不成 1.菌的活性较低或者质粒拷贝数较低等样 公司安排第二次摇菌或者单管摇菌；您
、PCR已纯化 功，目前正在进行第二次摇菌 品的问题；2.也有可能摇菌过程中条件不 可以根据实验情况，决定是否重新提供
、PCR未纯化 。
够理想导致。
样品继续实验。
号。
达不到测序要求
我们分析具体原因；3.或者重新提供验
证好的样品及引物重新测序。
实验停止，PCR产物测序无信 号，建议您TA克隆后送测。
1.可能引物与模板没有结合位点；2.或者 模板有发卡等特殊结构，造成引物与模板 建议您将PCR产物TA克隆后送测。 无法结合；3.或者引物不适合测序。
实验停止，测序无信号/结果 差。建议单向测通。
PCR产物（2ul上样量）要求条带单一。
实验取消，客户样品经鉴定， 样品不纯，不满足测序的要求 样品检测条带异常或者条带大小不符 。
建议重新提供符合测序要求而且片段大 小正确的样品测序。质粒 （>100ng/ul；20ul）；PCR产物 （50ng/ul;20ul），PCR产物要求条带 单一明亮。
实验取消，客户样品/引物异 常，无法实验。
oligo7评价引物标准
oligo7评价引物标准
Oligo 7是一款引物设计软件，可以对引物进行评价。
以下是Oligo 7评价引物的标准：
1. 引物的特异性：评价引物与非特异性序列的结合能力，以及在基因组中的潜在结合位点。
2. 引物的长度：引物的长度会影响其特异性，太长或太短的引物可能导致不准确的PCR产物。
3. 引物的GC含量：GC含量过高或过低可能导致PCR过程中退火温度的选择和产物稳定性出现问题。
4. 引物二聚体和发卡结构：这些结构可能导致引物自身结合，影响PCR扩增效率。
5. 引物间的互补性：评价引物之间是否存在互补区域，这可能导致引物二聚体的形成。
6. 引物与模板的互补性：评价引物与模板DNA的结合能力，以确保PCR 产物的一致性。
7. 引物的突变和多态性：评价引物对基因突变和多态性的敏感性，以确保引物适用于不同基因型。
8. 引物的热稳定性：评价引物的解离温度（Tm），以确保PCR过程中选择合适的退火温度。
9. 引物的安全性：评价引物是否可能产生任何安全性问题，如对实验者的毒性或对环境的污染。
这些标准可以帮助您评估Oligo 7设计的引物质量，以确保PCR实验的成功和准确性。
[说明]primer5中文使用说明
![[说明]primer5中文使用说明](https://img.taocdn.com/s3/m/38c58e396f1aff00bfd51ebc.png)
[说明]primer5中文使用说明Primer Premier 4.10Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。
其主要界面同样也是分为序列编辑窗口(Genetank)，引物设计窗口(Primer Design)，酶切分析窗口(Restriction Sites)和纹基分析窗口(Motif)。
这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。
打开程序首先进入的是序列编辑参看，与Plasmid Premier相比，其多了一个语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快速。
点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。
该界面共分为四层，最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑;右边是观察两个引物在模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择;第二层是显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示;第三层是显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC,消光系数、简并性;最后一层是给出的有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测，左边是显示是否存在以上各种对PCR扩增有影响的结构，右边显示的是这些结构的位置，结构细节和稳定能，利用这些参数可以对引物作出可靠的评价。
下面是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链;另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。
并通过来点击按钮来设置一些搜寻参数:这些参数包括引物的Tm值，GC比，有简并性碱基，3’端稳定性，引物的稳定性，重复序列，二聚体/发卡结构和与模板及可能的杂质DNA(需要从另外的序列文件中读入)之间的错配情况，这些参数的设定可以根据要求变化，程序本身根据一定的标准分成从极高严谨性到极低严谨性5个档次。
测序常见问题分析与解答
测序常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“DNA测序样品准备及注意事项”部分的说明。
3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1。
5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
4、与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
DNA测序结果中常见的几个问题
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
基因测序无信号的原因
基因测序无信号的原因基因测序无信号的原因分为外部原因和内部原因。
1,外部原因包括：（1）实验员的操作原因样品污染、样品用错、引物加错、BDT漏加、试剂的使用量错误、回收错误等操作过程的错误（2）仪器的原因（3）实验条件的原因实验过程中的温度和湿度，退火温度的不合适2,内部原因包括：（1）菌液和质粒原因：测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。
分析：菌液浓度太低甚至失活，或者载体为低拷贝，造成提取的质粒浓度低，测序无法产生足够信号；载体的信息错误，或者载体经过改造，测序引物与模板无法有效结合，造成测序无信号；客户提供的质粒浓度太低，质量太低造成测序无信号；引物发生降解导致测序无信号；引物定量不准造成测序无信号（引物与模板比例差异较大）；无插入片段。
（2）PCR切胶和已纯化原因：测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。
分析：测序引物与模板没有结合位点；测序引物或者模板，已经发生降解；样品浓度太低，造成纯化之后的模板浓度太低，测序无法产生足够信号;PCR产物送样量太少，造成DNA总量太少，纯化之后无法产生足够模板，测序信号弱，甚至无信号；PCR片段大于2000bp时，纯化效率显著降低，造成模板浓度不足，测序信号偏弱（作出这个判定时要根据已经回收后的产物电泳亮度才行）（3）引物：自备引物太长造成自连或walking引物有较重的引物二聚体、错配(错配会导致多个结合位点，出现双峰，不是无信号)、发卡结构等造成测序无信号；引物浓度太低或者太高都可能造成测序无信号；引物发生降解或者被污染造成测序无信号；简并引物、引物过长、引物不纯等导致测序无信号。
（4）其他困难模板，样品在前端存在高级结构，引物结合上去之后无法继续测通；Buffer种类的不合适；PCR模板（PCR已纯化和质粒是客户自己提供的，如果模板溶于TE会导致信号衰竭，无信号，各种乱峰，是因为TE溶液里的EDTA导致，我们把模板重新洗脱即可重新测序）含有抑制物导致产量低导致无信号；PCR（引物退火，不是PCR）退火温度太高，延伸时间太短导致无扩增产物而导致测序无信号。
测序引物设计指南
测序引物设计指南测序引物是用于DNA或RNA测序的关键组成部分，对于获得高质量的测序数据至关重要。
本文将为读者提供一些测序引物设计的指南，并探讨一些常见的设计策略和注意事项。
首先，测序引物设计的首要目标是确保引物与待测序列（目标序列）的亲和力和专一性。
引物应具有足够的亲和力以使其能够稳定结合到目标序列上，从而进行扩增或测序。
此外，引物的专一性是确保引物只与目标序列结合，而不与其他非目标序列结合的重要因素。
在设计测序引物时，以下几个因素应予以考虑：1.引物长度：引物的长度应在18到30碱基对之间。
较短的引物通常具有更好的亲和力，但随着引物长度的减少，引物的特异性也会下降。
因此，引物的长度应根据具体实验要求进行选择，以达到测序的需要。
2.引物的序列和碱基组成：引物的碱基组成应平衡，以避免引物自身或目标序列的二级结构形成。
此外，碱基组成中应尽量避免重复序列和富含GC或AT碱基的区域，因为这些区域可能会影响引物的特异性或二级结构的形成。
3.引物的亲和力：引物的亲和力可通过计算引物的熔解温度（Tm值）来估算。
常见的计算公式如下：-对于DNA引物，Tm=2(A+T)+4(G+C)-对于RNA引物，Tm=2(A+U)+4(G+C)引物的Tm值应在50到65°C之间，以确保引物在PCR或测序反应中具有良好的性能。
4.引物的特异性：引物的特异性是指引物与目标序列的亲和力远远大于与非目标序列的亲和力。
为了确保引物的特异性，可以使用生物信息学工具对引物进行BLAST分析，以验证引物是否只与目标序列匹配。
5.引物的位置：引物的位置应在目标序列的两端，以允许扩增或测序反应的进行。
同时，引物的位置应避免富含GC或AT碱基的区域，以减少引物结合的二级结构的可能性。
6.引物的富集：在设计引物时，可以考虑引入一些特定的序列标记或适配器序列，以便在后续的实验步骤中进行富集或连接。
总之，设计高质量的测序引物是确保测序数据准确性和可靠性的关键步骤。
引物二聚体和发夹结构
引物二聚体和发夹结构引物二聚体和发夹结构是分子生物学中常用的实验技术，用于DNA 或RNA的扩增和测序。
本文将分别介绍引物二聚体和发夹结构的原理、应用及优势。
引物二聚体是由两个互补的引物分子组成的，通过与目标DNA的两个相邻区域结合，实现DNA的扩增和测序。
引物二聚体的设计是基于目标DNA的序列，在实验室中通过人工合成。
引物二聚体的合成需要考虑引物的长度、碱基组成和目标DNA的启动子等因素，以确保扩增和测序的成功。
在引物二聚体的设计中，需要考虑到引物的特异性和特异性。
特异性是指引物与目标DNA的互补性，而特异性是指引物在扩增和测序过程中不与其他非特异性DNA结合。
为了确保特异性和特异性，引物二聚体的设计需要进行严格的序列分析和设计。
此外，引物二聚体的长度和碱基组成也会影响其特异性和特异性。
发夹结构是指引物二聚体与目标DNA结合后的形成的稳定结构。
发夹结构的形成有助于提高扩增和测序的特异性和特异性。
发夹结构的形成是通过引物与目标DNA的互补碱基配对，形成稳定的碱基对。
这种稳定的碱基对可以防止引物在扩增和测序过程中与其他非特异性DNA结合。
引物二聚体和发夹结构的应用广泛。
在DNA扩增中，引物二聚体可以通过PCR（聚合酶链式反应）技术实现DNA的扩增。
在PCR过程中，引物二聚体与目标DNA结合并提供DNA合成的起始位点，使得DNA可以通过酶的作用进行扩增。
同时，发夹结构的形成可以提高PCR的特异性，避免非特异性扩增产物的产生。
在DNA测序中，引物二聚体和发夹结构也起到重要的作用。
测序是指对DNA序列进行逐个碱基的测定。
引物二聚体可以作为测序的引物，与目标DNA结合并提供测序的起始位点。
发夹结构的形成可以提高测序的特异性和特异性，确保测序结果的准确性。
引物二聚体和发夹结构的优势在于其灵活性和可靠性。
引物二聚体的设计可以根据不同的目标DNA序列进行调整，以适应不同的实验需求。
同时，发夹结构的形成可以提高实验的特异性和特异性，减少非特异性扩增或测序产物的干扰。
d5s818基因座引物序列
d5s818基因座引物序列
一、引物序列
正向引物：5'-GAG CAA TCC ATC CAC AAG AT-3' 反向引物：5'-GTA CCA GCA GCC TCT TGA-3'
二、使用方法
1. 准备DNA样品：从待测个体中提取DNA样品，可以使用常规的DNA提取方法。
2. 配置PCR缓冲液：按照PCR缓冲液配方，加入双蒸水并调整浓度。
3. 合成热稳定启动子：根据所需反应体积，合成适量的热稳定启动子。
4. 混合所有试剂：将引物、DNA
样品、PCR缓冲液和热稳定启动子混合均匀。
5. 进行PCR反应：
设置PCR反应条件，进行扩增。
6. 产物分析：通过凝胶电泳或基因测序分析扩增产物。
三、注意事项
1. 请确保引物设计合理，避免引物相互间形成发卡结构。
2. 在进行PCR反应前，应确认所有试剂的准确性和有效期。
3. 操作过程中需保持无污染环境，以免影响实验结果。
请务必按照说明书中的步骤进行操作，若有疑问，可咨询实验室技术员或查阅相关文献资料。
引物发夹结构
引物发夹结构引物发夹结构是一种常见的生物学实验技术，用于在PCR反应中选择性地扩增目标DNA序列。
该技术的原理是利用引物与目标DNA序列的互补性，使引物与目标DNA序列结合并稳定，然后通过PCR反应扩增目标序列。
引物发夹结构是保证PCR反应成功的关键之一，也是PCR反应优化的重要内容之一。
引物是PCR反应中的重要组成部分，是用于扩增目标DNA序列的短链DNA分子。
引物的设计需要考虑多个因素，包括引物长度、引物的GC含量、引物的熔点等。
引物发夹结构是引物设计中的一个重要方面，它指的是引物两端具有互补性序列，从而在PCR反应中形成一个稳定的结构，有利于引物与目标DNA序列的结合和扩增。
引物发夹结构的设计需要考虑多个因素。
首先是引物长度，引物长度一般在18-24个碱基对之间，过短的引物容易出现非特异性扩增，过长的引物则容易出现低扩增效率和引物间的竞争。
其次是引物的GC含量，引物的GC含量应该在40-60%之间，过高或过低的GC含量都会影响引物的结合和扩增效率。
最后是引物的熔点，引物的熔点应该在55-65℃之间，熔点过低会导致引物的结合不稳定，熔点过高则会影响引物的扩增效率。
在设计引物发夹结构时，需要选择合适的引物序列并确定引物的长度和GC含量。
然后，在引物两端加入互补性序列，使引物形成一个稳定的结构。
这个结构可以是一个简单的双链结构，也可以是一个带有环状结构的引物。
在PCR反应中，这个结构可以帮助引物与目标DNA序列的结合，提高PCR反应的特异性和效率。
引物发夹结构的优点是可以提高PCR反应的特异性和效率，减少非特异性扩增和引物间的竞争。
此外，引物发夹结构还可以减少PCR 反应中的假阳性结果，提高PCR反应的准确性和可靠性。
因此，在PCR反应中，引物发夹结构是一个非常重要的因素，需要认真考虑和优化。
总之，引物发夹结构是PCR反应中的一个重要组成部分，可以提高PCR反应的特异性和效率，减少非特异性扩增和引物间的竞争。
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引物发卡结构测序
引物发卡结构测序是一种基因组学的技术，用于测定细胞中DNA分子的结构和序列。
它
是一种在科学研究中以不断遍历DNA分子长度增加的方式来发现和跟踪DNA分子结构与DNA序列之间关联性，以及它们与表观遗传学等领域的基因组学有关的研究领域中的应用。
引物发卡结构测序的基本原理是：首先使用适当的酶切引物反应，将DNA分子切断
成碎片，然后用凸起引物将碎片与测序载体(当前被称为“测序拉卡”）结合，最后用引物发卡结构测序仪将拉卡与回放仪中的回放碱基（A，C，G和T）结合，以构建DNA分子。
该技术的优势在于它比传统的基因组学技术（如突变测定）拥有更高的精度，更短的分析时间和更低的成本。
在科学研究中，引物发卡结构测序可用于测定基因的结构和序列，可在肿瘤、细菌抗性和疾病研究等研究中发挥重要作用。
此外，它还可用于药物开发、DNA 编辑和新基因的发现等领域。
引物发卡结构测序的发展将继续促进基因组学技术的创新，并在许多领域（如疾病治疗和
健康服务）发挥重要作用。
各个分支机构（包括政府、企业和研究机构）继续投入大量资源，以支持此技术的发展。
结果，引物发卡结构测序可以成为解决严重健康危机（如癌症、精神疾病和其他类型的遗传病）的重要技术。
总之，引物发卡结构测序是一种功能强大的基因组学技术，可以提供更高的精度、更短的分析时间和更低的成本。
它是发现基因序列与结构之间关系的重要依赖技术，可在多个领
域产生重要影响，从而帮助解决许多重要健康威胁，尤其是某些遗传性疾病。