乳酸细菌分类鉴定及实验方法
产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定
取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。
纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。
用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。
１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。
１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。
以空白培养基为对照，扣除背景干扰。
’１．２。
６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。
１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。
乳酸菌抑菌鉴定研究
乳酸菌抑菌鉴定研究乳酸菌是一类在发酵食品中常见的细菌，它们以乳酸为代谢产物进行糖的发酵，具有很高的抑菌活性，能够抑制一些致病菌的生长。
乳酸菌的抑菌活性与其菌种的多样性、代谢产物的组成和浓度有关，而这些又受到发酵条件的影响。
因此，对乳酸菌抑菌鉴定进行研究，可以为乳酸菌应用于食品工业等领域提供科学依据。
1.乳酸菌菌种多样性的研究乳酸菌存在于不同的食品发酵过程中，通过对各种食品样品进行分离培养，可以得到不同的乳酸菌菌株。
首先，需要对这些乳酸菌菌株进行形态学、生理生化及基因序列等方面的鉴定和分类，并构建乳酸菌菌株的系统发育树。
2.乳酸菌抑菌活性的测定乳酸菌的抑菌活性是评价其抑菌能力的重要指标。
可以利用不同的方法来测定乳酸菌对不同的致病菌的抑菌效果，如纸片扩散法、孔隙扩散法等。
同时，也可以比较不同菌株之间的抑菌活性差异，并找出具有较强抑菌活性的优良乳酸菌菌株。
3.乳酸菌代谢产物的鉴定乳酸菌通过发酵作用产生一系列代谢产物，如乳酸、醋酸、乙酸、乙醇等。
这些代谢产物对于乳酸菌的抑菌能力起到重要作用。
可以通过色谱-质谱等技术手段，对乳酸菌代谢产物进行分离鉴定，并量化其浓度，以了解乳酸菌抑菌活性的机制。
4.发酵条件对乳酸菌抑菌活性的影响乳酸菌的生长发酵条件对其抑菌活性产生重要影响。
如生长温度、pH 值、发酵时间等。
可以通过调整这些条件，研究其对乳酸菌生长和抑菌活性的影响，找出最佳的发酵条件，以提高乳酸菌的抑菌活性。
通过以上的乳酸菌抑菌鉴定研究，可以得出在不同发酵条件下具有较强抑菌活性的乳酸菌菌株，并进一步深入了解其抑菌机制，为乳酸菌在食品工业等领域的应用提供科学依据。
在未来的研究中，还可以进一步探索乳酸菌菌株与致病菌之间的相互作用，以及开发新型乳酸菌发酵产品，提高其抑菌效果。
发酵白菜中乳酸菌的分离与鉴定
玻 片上 ， 挑菌于溶液中， 用 环 将 其 混 合搅 匀 ， 短 时 间 内
ＫＯ Ｈ试 验 阳性 菌 会 越搅 越 稠 ，抬起 接 种 环 会产 生 拉 丝
入 菌株 各 １ 环， ３ ７ ℃培养 ２ ｄ 。取 未加 碳 水化 合物 的Ｐ Ｙ培 养 基作 为 对 照 。 使 用Ｂ Ｔ Ｂ ． ＭＲ 试 剂 比较颜 色 的变化 ， 记
ｗｅ ｒ ｅ Ｌａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｂ ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ， ２ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ Ｌａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｍｉ ｎ ｏ ｒ ａ ｎ ｄ １ ｓ ｒａ ｔ ｉ ｎ ｗａ ｓ Ｌａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｆ ｅ ｍ ｅ ｒ ｎｔ ｉ ｕ ｍ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： ｆ ｅ ｍ ｅ ｒ ｎ ｔ ｅ ｄ Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｃ ａ ｂ ｂ ａ ｇ ｅ ； Ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ； ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ； ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｘ Ｉ ＡＯ Ｊ ｉ ｎ ｇ ， Ｓ Ｕ Ｎ Ｊ ｉ ａ ｎ — ｑ ｉ ｕ ， ＷＡ ＮＧ Ｘｉ ｕ ￣ ｉ ｎ ｇ ， Ｒ Ｅ Ｎ Ｊ ｉ ｎ ｇ — ｘ ｉ ｎ
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｎ ｎ ｇ ， Ｑ ｉ ｑ ｉ ｈ ａ ｒＵ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｑ ｉ ｑ ｉ ｈ ａ ｒ１ ６ １ ０ ０ ￣Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
２ ． １菌 落形 态和 细胞 形态检 测 结果 分离到的ｌ ３ 株菌 ， 菌 落 乳 白色 、 灰色或略显黄色 ；
乳酸菌检测方法_综述_
中图分类号 :R15 ; TS20116 文献标识码 : E 文章编号 :1004 - 8456 (2002) 01 - 0047 - 07
乳酸菌检测方法 (综述)
张一凡 冉 陆 罗雪云 (卫生部食品卫生监督检验所 北京 100021)
乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的 细菌总称 ,这个名称就细菌分类学而言是一非正式 、 非规范的名称 。目前在自然界已发现的这类菌在细 菌分类学上划分出至少 23 个属 ,涉及到的有关属则 更多 ,包括乳杆菌属 、双歧杆菌属 、链球菌属 、肠球菌 属等 。而相当多的乳酸菌对人 、畜的健康起着有益 的作用 。近年来 ,随着微生态学研究的不断发展 ,越 来越多的实验证明有益细菌对人体健康的重要作 用 ,微生态制剂也因此应运而生 。目前我国微生态 制剂利用的益生菌近 10 种 ,其中除了乳杆菌和乳酸 链球菌有国家的标准检验方法外 ,大部分菌种均无 统一的标准方法 ,难于对该类产品进行质量控制 ,保 证其安全性 。故急需建立规范的标准检验方法 ,以 便对微生态制剂进行监督管理 ,保障其功能 、安全性 及质量 ,以保护消费者的健康和利益 。本文即对目 前国内外用于乳酸菌检测的方法做一综述 。
离子色谱法和气相色谱法从分析厌氧菌的代谢 产物结果来看 ,在总体上无明显差异 ,但离子色谱法 具有以下优点 :[4]
微生物的常规检验技术--乳酸菌的检验
四、乳酸菌的检验
４ 检验程序
四、乳酸菌的检验
５ 操作步骤--样品制备 ➢ 样品制备无菌操作程序： ➢ 第一步：冷冻样品 可先使其在2~5℃条件下解冻，时间不超过18h,也可在温度不超 过45℃的条件下解冻，解冻时间不超过15min； ➢ 第二步：固体和半固体食品 以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的 无菌均质杯内，8000 ~ 10 000 r/min均质1 ~ 2min，制成1:10样品匀液； ➢ 第三步：液体样品 应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生 理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇,制成1:10的样 品匀液； ➢ 第四步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水 的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹 打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液； ➢ 第五步：另取1mL无菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次， 即换用1次1mL灭菌吸管。
➢ 双歧杆菌培养:根据待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度，每个稀
释度吸取0.1mL样品匀液于莫匹罗星锂盐改良 MRS琼脂平板，表面涂布，每稀释度做
两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h ±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释
到平板涂布要求在15min内完成；
➢ 嗜热链球菌培养:根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度,每
培养皿1 培养皿2 平均数
乳酸杆菌的分离、鉴定及体外拮抗试验
１ 材 料 与方 法 １１ 材料 ．
１ 实验仪器 培养皿 、 ～１ １ 移液管 、 牛津杯 、 微型 发酵 管（ 空管 ）针头 、 、 试管 、 蒸馏水 、 三角棒、 微量加样 枪枪 头、 注射器、 心管等器具 ， 已作高压湿热灭菌。 离 均
１１ 培养基 ．２ ． Ｌ Ｓ乳酸杆菌选择培养基 的制备 ： Ｂ 蛋
红、 美蓝混匀，２ 灭菌 １ ｍ ｎ １ １Ｃ ｏ ５ ｉ。
２１ 乳 酸杆 菌的分 离纯化结果 ．
在 Ｌ Ｓ划线培养的 Ｂ
菌株 中随机挑选 １ 菌株 ， 株 进行纯 化培养 ， 鸡粪菌株 代号为 Ｌ Ｊ Ｂ 、猪粪菌株代号 为 Ｌ Ｚ Ｂ 、牛粪菌株代号 为
Ｌ ＢＮ。
营养琼脂培养基 的制备 ： 牛肉膏 １ － 白胨 ２ 、 蛋 ｇ ｇ
前 为淡紫色 ， 阳性反应为黄色 ， 阴性反应为深红色。以
上微量 发酵 管除精氨酸外 ， 其余都为糖 、 醇发酵 ， 精氨
分别取猪粪 、牛粪、 鸡 酸发酵是为 了验证 有无氨气产生 ，接种前为绿色 ， 阳
１ ． 乳酸杆菌 的分离纯 化 ．１ ２
粪约 １ ， ９ ｍ 加 ９ Ｌ生理 盐水 ， ｇ 室温下 １０ ／ ｉ ５ ｒ ｎ摇床振 ｍ 摇 ｌ～ ０ ｉ。分别在 Ｌ Ｓ培养基上划线 ，将划线的 ５３ ｎ ｍ Ｂ
ｌ ｔ ａｉｕ ｙ ｓｓａｄ ｔｅＣＷ ｓｕ ｅ ｌ ｔ ａｉｕ ｒ ｈｃ ｓｈｄ ｎ ｉ ｏ ｃ ｔｇｎｓｃａｔｎ ｔ ａ ｏ ｃｌｓｘｌ ｕ ｎ ｈ Ｏ ｏｒ ａ ｏ ｃｌｓｔｃｏｔ ａ ｏｂｏ ｇ ａ ａ ａｏｉｉ ｃｏ ｏ ｃｂ ｌ ｏ ｃ ｃｂ ｌ ｉ ｅ ｌ ｌ ｎ ｉ ｔ ｉ
０ ｇ七水硫酸镁 ０ ４ 、 ．、 ４ ． ｇ 四水硫酸镁 ０ １ 、 ０ ． 琼脂粉 ０ｇ
乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究
乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究摘要:乳酸菌是一类具有多种生理功能的细菌，本文通过阐述乳酸菌不同来源的分离鉴定方式，探讨了乳酸菌的部分主要生理功能。
关键词:乳酸菌分离鉴定功能Abstract: Lactic acid bacteria are a kind of many physiological functions of bacteria, this paper explains the separated and identified from different sources of lactic acid bacteria, and probes into the way of its part main physiological function.Keywords: lactic acid bacteria separated and identified function乳酸菌是一类广泛分布于自然界、与人类生活密切相关、可发酵碳水化合物、产生乳酸的细菌，然而，乳酸菌的许多特性是由其基因编码决定的【1】，利用这一特性，人们可以用乳酸菌作为载体，在食品及医药领域中构建表达系统。
乳酸菌具有控制肠道感染，改善乳糖代谢，增加某些食物的营养价值，诱导体内特异性及非特异性免疫等作用。
乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状，生殖方式为裂殖，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸分解蛋白质，但不产生腐败产物，不形成内生孢子，无运动性或极少运动，目前己发现的乳酸菌在细菌分类学上有18个属【2】。
通过对乳酸菌分离鉴定，可测定其生理功能。
一、乳酸菌的分离鉴定乳酸菌的来源广泛，腌菜、发酵肉制品、腐乳、酱醅、牛乳等食物中乳酸菌的含量极其丰富。
（一）腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌广泛存在于泡菜和腌菜等食品中，此类乳酸菌较耐盐，因此，以腌菜为样品，分离优良乳酸菌株，将其应用到含盐量较大的食品中，可以改善食品的风味，提高食品的质量。
酸菜中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究
表２结果表明，Ｌ７、Ｌ－８和Ｌ广６菌株的发酵液中均含有 乳酸，说明此３个菌株为产乳酸菌株。 ２．２．２形态学鉴定结果．
１，－７、Ｌ８和Ｌ广６菌株的形态学鉴定结果见表３。
表３ Ｌ－７、Ｌ＿．８和Ｌ＿６菌株的形态学特征鉴定结果 Ｔａｂｌｅ ３．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ Ｌ－－７．Ｌ＿名ａｎｄ Ｌ－６
材料：大白菜、食盐。 试剂：蛋白胨、酵母膏、吐温一８０，牛肉膏、琼脂、乳酸、
Ｋ２ＨＰ０４、柠檬酸三铵、乙酸钠、葡萄糖、ＭｇＳ０４·７Ｈ２０、 ＭｎＳＯ．Ｉ·４Ｈ２０、丁醇、甲酸等。
仪器：恒温培养箱，生化培养箱，奥林巴斯显微镜， ７３１分光光度计，超净工作台，电热手提式高压杀菌锅，酸 度计，电子天平。 １．１．１培养基
中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５４－５０７１（２００９）０２－００６２稍
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｐｉｃｋｌｅｄ ｃａｂｂａｇｅ
ＬＩＵＸｉａｏｈｕｉｌ，ＣＨＥＮＳｈｕｎｌ，ＧＡＯＸｉａｏｍｅｉｌ，ＺＨＡＮＧＹａｈｌ，ＣＡＩＹｕｅ２
Ａｂｌ血ａｃｔ：Ｔｂ僦ｈｉｇｈ—ａｃｉｄ－ｙｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｊｕｉｃｅ ｏｆｐｉｃｋｌｅｄ ｃａｂｂａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｎｄ ｗ啪ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖ趣Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｅｔａｒｉｕｍ ａｎｄ Ｌｃｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｃｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
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乳酸细菌分类鉴定及实验方法
乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。
分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。
1.传统分离鉴定
传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。
一般的步骤包括：
1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。
可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。
1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。
1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。
1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。
2.分子生物学方法
分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。
常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。
2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。
首先，从培养的细菌中提取DNA。
然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。
比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。
2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。
通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并
进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。
2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引
物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。
总结来说，乳酸细菌的分类鉴定方法主要包括传统分离鉴定和分子生
物学方法。
传统分离鉴定通过观察菌落形态、细胞形态和生理生化特性来
进行分类鉴定。
而分子生物学方法则利用PCR、16SrRNA测序和RAPD等技
术来分析细菌的DNA序列，从而进行分类鉴定。
这些实验方法可以相互配合，提高乳酸菌的鉴定准确性。