菌种保藏中的细菌鉴定方法
菌种保藏中的细菌鉴定方法
作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差.
细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种:
1、传统方法
常规宏观菌落形态学观察,主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况:细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致,菌落个体表面及边缘的生长状况;在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况;半固体上穿刺接种后,观察细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致.在鉴别培养基上培养,观察结果是否跟预期结果相同.
细菌的个体形态学观察,即通过显微镜观察.观察前细菌需要着色,要根据预先确定的观
察项目选择与之相对应的染色方法,目前常用的染色方法包括革兰氏染色法、美蓝染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆萨染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.尽量挑选对数生长期的细菌进行染色观察,此时的细菌生长处于幼期,利于观察,因为一些陈旧细菌的染色结果会有变化,如本为革兰氏阳性菌经过长期搁置后染色结果可能为革兰氏阴性.同时细菌培养时要注意培养基的挑选,一些细菌的特殊结构如荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表达是需要在特定的培养基上才能正常发育,有的细菌如炭疽在一般的培养基上不形成荚膜,只在动物体内形成明显的荚膜,所以需先接种实验动物后用病料进行涂片镜检.在镜检时观察细菌基本形态结构和大小及其排列状态、菌端形状、有无两极染色、有无形成芽胞和荚胞等.
形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义,生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异,表现出不同的生长特性.通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否,从而能够得到细菌的鉴定结果.如糖(醇)类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验等.
血清型鉴定是根据细菌具有相对特异性的抗原结构这个特点进行微生物鉴定的特异方法.抗原的特异性程度又存在于属间细菌所共有的共同抗原,这种抗原的存在,能表明其属性.另一类特异性抗原只存在于特定的种、型,是确定细菌种、型的重要依据.通过专门的分型血清即可对这些细菌的血清型进行鉴定.
细菌毒力的测定,病原菌侵入机体能否引起疾病与其本身的毒力、侵入机体的数量和侵入部位有关.不同的病原菌或同种细菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定时间内,能使一定条件的某种动物半数死亡或感染需要的最小细菌数或毒素量.毒力测定在菌种鉴定过程中可用于鉴别一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式进行计算.
2、仪器自动化鉴定
随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用,微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观
察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段.近20年来,一系列商品化自动鉴定系统相继推出,并在应用中取得理想效果,如VITEK系统、MIDl系统、BIOLOG系统、 SENSITl．TRE系统、AUTOSCEPTOR系统以及MICROSCAN系统等.下面以BIOLOG 微生物鉴定系统为例,简述微生物自动鉴定系统的工作原理:BIOLOG微生物自动分析系统是美国Biolog公司从1989年开始推出的一套微生物鉴定系统,该系统主要根据细菌对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行鉴定.细菌利用碳源进行呼吸时,会将四哇类氧化还原染色剂(TV)从无色还原成紫色,从而在鉴定微平板(96孔板)上形成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”,通过纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化(分为“自动”和“人工”两种读取方式),由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹图谱”与数据库相比较,可以在瞬间得到鉴定结果,确定所分析的菌株的属名或种名.以BIOLOG系统6．01版数据库为例,包含了革兰氏阴性好氧菌524种、革兰氏阳性好气菌341种、厌氧菌361种、酵母菌267种、丝状真菌(含部分酵母菌)619种以及几种特殊的致病菌,目前这个数据库已进行更新.利用微生物快速系统进行细菌鉴定,能节省时间,但由于其在数据比对过程中记入一些非特异性的阳性反应孔,会造成偶然误差,从而引起个别鉴定结果不稳定,另外此类仪器本身及其耗材价格均较高.
3、分子生物学鉴定
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核酸检测技术,包括基因测序、指纹图谱技术、基因探针技术、聚合酶链反应(PCR)、GC含量测定等.PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成比较经典的核酸检测技术,目前这两者已经得到了较大范围的推广和应用.
下面将简单介绍几种核酸检测技术的原理:
DNA的G+C含量测定法
此法是根据细菌的DNA中G+C含量的特异性来进行细菌鉴定,通过熔解温度(Tm)法或浮力密度法测定细菌DNA中G+C的含量,通过对比来鉴定细菌.
扩增片段长度多态性(AFLP)分析
此法是一种测定基因组限制性片段的DNA指纹技术,通过PCR选择性地扩增整个基因组DNA的内切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝胶上电泳,产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图谱.与其他DNA指纹技术相比有其独特的优点:可用于各种大小不同的基因组的指纹分析,为研究细菌属乃至株间的亲缘关系提供一个有效手段;具有一定的灵活性,可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择,调整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目;由于适用了严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝胶电泳,因而重复性好,分辨率高;AFLP不仅仅是简单的指纹技术,而且可作为连接遗传图谱与物理图谱间的桥梁而用于基因组的研究. 限制性片段长度多态性(RFLP)分析
其原理是用限制性内切酶将细菌基因组DNA进行切割,之后在琼脂糖凝胶上电泳分离,以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性.RFLP产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定.
随机扩增DNA多态性(RAPD)分析,又称为随意引物PCR(AP—PCR)
它是一种DNA指纹多态性分析技术,其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同,因而用一组人为设计的核苷酸作为引物,通过PCR随机扩增可产生物种特异性的DNA带谱.
16S rRNA鉴定
细菌的核糖体RNA(rRNA)基因高度保守且进化速度缓慢,在漫长的进化过程中保留了rRNA基因结构和功能的同源性,在微生物染色体上可存在多个拷贝,以rRNA基因片段为探针可检出含有rRNA基因的DNA片段.分析杂交后得到的rRNA指纹图,为菌种定型和近缘菌株的鉴定提供了一种新技术.针对rRNA基因的核糖体分型可成功地区分多个菌种的相关菌株,因此该技术也被广泛称作核糖体分型技术.原核生物含有23S、16S和5S三种 rRNA,其大小分别约为3000、1500和120个碱基.其中作为小亚单位核糖体RNA的16S rRNA的大小最适合于核糖体分型.一般完成l6S rRNA序列测定后,在GenBank中与已知的序列进行BLAST分析,从而
得出鉴定结果.
4、小结
一般来说,对于微生物的检测或鉴定应当至少使用三种指标同时进行验证.传统的分类鉴定需要测定的项目众多,工作程序繁琐,耗时长.在某些时候可以配合分子生物学的方法进行鉴定,如在进行菌株的血清型鉴定时,对于某些国内资源稀缺的菌株定型血清,而进口定型血清价格昂贵,国内可以开发分子生物学分型方法完成菌株的血清分型工作.而在利用分子生物学方法鉴定菌株血清型时,经常会遇到有一些菌株的血清型种类繁多,目前还无法通过简单的核酸测定完成血清定型工作,如大肠杆菌,仅O抗原就有上百种血清型,对于这种情况在使用血清进行定型的同时,还需要继续深入研究其分型技术.目前市场上的微生物自动鉴定系统虽然基本上都通过了相关权威组织的认可,在细菌快速鉴定或初步鉴定中起到了一定的作用,但如前所述,其稳定性尚存在一定问题,同样需要配合其他方法来相互印证,从而完成细菌鉴定工作.
总而言之,更多地使用传统与现代相结合以及不断发掘新的鉴定方法才能更好地完善菌种保藏过程中的细菌鉴定工作.
菌种鉴定手段
菌种鉴定手段 （1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 （3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。（4）API细菌数值鉴定系统
API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技
标准菌种管理规程
标准菌种管理规程 目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确 保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责： QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员 负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传 代、使用及销毁等。 内容： 1术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即 称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准： 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购 买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购
买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制 代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及 每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表 1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种 的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并 储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于 工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同， 细菌： 1 个月；酵母菌： 2 个月；霉菌及芽胞： 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面 的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到 预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度 20%），
16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避
分枝杆菌 微生物学检验
分枝杆菌 1. 分枝杆菌属(Mycobacterium)： （1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜； （2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌； （3）营养要求较高，常用罗琴培养基； （4）生长缓慢，2~8周后方可见菌落； （5）G+C mol%为62%~70%； （6）由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。 2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌 3. 分枝杆菌属分类 （1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌 （2）非典型分枝杆菌： （3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌 4. 结核分枝杆菌 （1）临床意义 A. 本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁殖导致结核发生； B. 引起结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所差异，全球约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称； C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。 D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引起相应的结核病 （2）致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质D：诱发IV型超敏反应；硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质； 致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引起Ⅳ型超敏反应。（3）结核结节的形成： A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反应，是细胞免疫和IV型变态反应平衡的结果； B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。3~6周后，细胞变形，IV型变态反应产生； C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死； （4）Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反应： 有毒结核分枝杆菌被初次接种豚鼠10－14天，局部产生小节，形成肿块→坏死溃疡侵入附近淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。说明初次感染，机体无免疫力和超敏反应。 在8~12周之前先动物接种减毒小量结核分枝杆菌，再次接种结核分枝杆菌后局部反应提早出现，2~3天内红肿硬结溃疡痊愈。说明再次感染，机体有免疫力和超敏反应。 （5）微生物学检验 标本采集: 根据病变部位不同而定(晨痰、支气管洗液、清晨的中后段尿) 运送: 消毒容器 直接检查: 萋-尼抗酸染色(热)、Kinyoum染色(冷)，金-胺O染色
菌种鉴定方法
1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色，说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚（靛基质）试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V－P试验 将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。 10.甲基红（M.R）试验 接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1－2天，每管中先加入甲试剂0.1ml，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气
菌株鉴定
菌株鉴定 姓名 摘要：pUC载体系列质粒较小，约为2.7 kb，是E.coli最常用的理想质粒克隆载体。当pUC19质粒载体导入到E.coli DH5α后，在IPTG存在下，在含有生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落。另外质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r），质粒pUC19进入E.coli DH5α后，通过α-互补作用，在MAC培养基平板上转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的中性红指示剂变红，转化子的菌落变成红色。不含pUC19质粒的E.coli DH5α利用培养基中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的MAC培养基上形成白色菌落。本实验就是利用这些实验原理进行相应的菌株鉴定实验，其目的是更好地掌握培养基菌落生长情况及菌落颜色的原理，熟悉菌株鉴定的实验步骤，同时学会观察培养基中菌落的颜色特征。通过此次实验，我们达到了预期目的，取得了很好的实验效果。 关键词：pUC19质粒、E.coli DH5α、氨苄青霉素抗性基因（Amp r）、LB培养基、MAC培养基 1.引言 质粒是染色体外的遗传因子，广泛存在于原核生物中，在部分真核生物中也存在。细胞内自然存在的质粒通常不能作为基因工程操作的载体，需要对其进行改造，如根据载体必备的条件插入结构元件和删除质粒上非功能的DNA片段。标记基因是载体所必需的结构元件，按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记基因用于鉴别目标载体的存在，用于挑选成功转化载体的宿主细胞。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，将具有特殊表型的重组质粒挑选出来。α-互补是E.coli最常用的筛选标记，其原理是：β-半乳糖苷酶基因（LacZ）N端多肽和C端多肽单独存在时都无β-半乳糖苷酶活性，当两者存在于同一个细胞即可进行互补而形成完整β-半乳糖苷酶活性。在pUC系列质粒载体上插入了β-半乳糖苷酶的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，并在这个编码区域中引人多克隆位点，但不破坏LacZ的阅读框架，即不影响其正常功能。而这类载体对应的宿主菌如E.coli DH5α的染色体上整合有β-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入到相应宿主菌后，载体上合成的β-半乳糖苷酶N端多肽可以与宿主细胞染色体编码的C 端多肽片段互补形成完整的蛋白质，即表现出β-半乳糖苷酶活性。在乳糖或其结构类似物IPTG存在下，可以诱导β-半乳糖苷酶的合成。在含有生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落。 pUC载体系列质粒较小，约为2.7kb，是E.coli最常用的理想质粒克隆载体。它们由以下结构元件构成：①来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起始点。在含有氯霉素的培养基中细胞生长停止后，该复制子仍能继续复制，由此可得到大量质粒DNA。②氨苄青霉素抗性基因(Amp r)。③E.coliβ-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶N端的DNA 序列。④多克隆位点（MCS）区段，包含十几个单一限制性内切酶识别位点，使目的DNA 片段可定向插入。 质粒载体pUC18和pUC19的结构基本相同，只是在LacZ基因的启动子后面多克隆位点的限制性核酸内切酶以互为相反方向排列。在载体pUC18中，EcoRⅠ位点紧接于启动子Plac 下游，而载体pUC19的Hin dⅢ位点紧接于Plac下游，它们共有13个单一限制性核酸内切酶位点。 质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r），没有导入质粒pUC19的受体细胞，在
标准菌种管理规程
标准菌种管理规程 目的：规药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。职责：QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。 容： 1 术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 2.标准： 2.1检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药
检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。 2.2检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。 2.3.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），
细菌鉴定方法
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
分枝杆菌菌种鉴定1
分枝杆菌菌种鉴定 1 检测范围 用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。可用于结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。 2 方法原理 基因芯片( genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。基因芯片对分枝杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应
被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类 采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。 3 检测样本 检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non- tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株。存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株样本在-70℃储存不超过5年。 用于培养的样本为取自患者的痰、脓液或分泌物、肺泡灌洗液、穿刺液（包括脑脊液、胸腹水、心包液、关节液、胆汁等）、尿液。 储存：待测分离株样本在2-8℃储存不超过2个月。 4 仪器设备 PCR扩增仪、普通台式离心机、LuxScan 10K-B微阵列芯片扫描仪、微阵列芯片杂交仪、芯片洗干仪、微型高速离心机、涡旋振荡器、水浴锅。 5试剂耗材 5.1 试剂 5.1.1芯片洗涤液：
细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的
菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。
细菌菌株的分子鉴定步骤
(1)小量提取细菌基因组总DNA a.挑LB平板上新鲜活化的单菌落于5mL LB培养基中，25℃震荡培养24 h； b.转移3mL菌液于5mL离心管中，4℃，12000r/min，离心5min，弃掉上清； c.将细菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，尽量空干上清液； d.将沉淀重悬于1mL 50mmol/L Tris (pH 8.0)缓冲液中，然后加入0.2mL新鲜配置的溶菌酶溶液(10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0)和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混匀后于37℃处理1 h，再加入200μL 10%SDS溶液，混匀后放置于55℃处理5min； e.加入等体积的酚-氯仿(1:1)，盖好上下颠倒混匀3min，12000r/min，离心10min； f.转移上相至新的离心管中，重复上个步骤直到无白色变性蛋白层出现； g.取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1h； h.重复步骤e； i.在上相中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30min；. j.4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗两次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存备用。 (2) PCR扩增16S rDNA序列 a. 以上述细菌基因组总DNA为模板，.扩增所用引物为， 上游引物：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；（27F） 下游引物：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’。（1492R） b. PCR反应体系参见PCR扩增试剂盒说明书 c. PCR反应条件也主要参考说明书 94℃预变性5min，94℃ 45s，56.2℃ 45s，72℃ 90s，30个循环； 72℃ 10min，4℃保温。 d. PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 e. PCR产物测序。 (3)构建进化树 将菌株16S rRNA的序列与GenBank数据库中序列比对，构建系统发育树。
细菌鉴定和耐药性检测方法的发展
细菌鉴定和耐药性检测对于指导临床精确用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测仍以表型检测方法为主，主要包括：传统手工鉴定与药敏实验方法、自动化药敏鉴定系统。传统方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定和（或）耐药检测技术，例如基于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果。 １传统方法在细菌鉴定和耐药性检测中的应用临床手工细菌鉴定和细菌药敏实验，是临床上尤其在中小医院应用最广泛的方法。细菌鉴定主要是根据细菌对生化物质的代谢特点进行，药敏方法包括纸片扩散法（常规实验室使用较普遍）和抗生素稀释法（ＭＩＣ法）等。这些方法的特点是方便、易操作，成本低，而且灵活性强，测定的细菌和药物可灵活选择。其缺点是操作烦琐、经验依赖性强、报告结果慢，不能完全适应临床治疗的需要。 使用自动化药敏和鉴定系统，是临床微生物学实验包括体外药物敏感实验的发展方向。最有代表性的是ＶＩＴＥＫ－ＡＭＳ微生物自动分析系统，可同时完成细菌鉴定和药敏实验。该套系统的检测卡片分为１４种，每一种鉴定卡片含有２５种以上的生化反应指标，基本与常规检测鉴定相同。此方法的优点是简便、快速、鉴定范围广，受人为的影响小，可靠性高。但它仍需要细菌培养的步骤，准确性也受到一定限制，同时其耗材价格较为昂贵。使用这类仪器的主要是三级甲等以上的大型医院。在细菌快速鉴定方面最有代表性的是ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，其原理是应用细菌的特异性抗体对细菌进行鉴定，以荧光为标记，进行自动化检测。其最大优点是速度快，可以在４０ｍｉｎ内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。但检测指标过少，主要限于这几种菌，而且也不能进行药敏实验。 目前，微生物鉴定技术中除了少数医院使用半自动、全自动的细菌鉴定仪外，大多数医院主要还是使用常规鉴定技术进行细菌菌种的鉴定。 ２分子生物学技术在细菌种属鉴定中的应用采用与系统发育学相关的基因实现对细菌血清型的分型，越来越成为一种趋势。目前，利用基因检测方法对细菌进行种属鉴定所涉及的基因包括细菌１６ｓｒＲＮＡ基因或５ＳｒＲＮＡ序列、ＨＳＰ基因家族、ｇｙｒＢ基因以及细菌特异基因等。 ２．１利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类依据的原因利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列对细菌进行菌种鉴定在目前应用较多，也越来越被临床所接受。在细菌分类学著作中，如《伯杰氏系统细菌学手册》，越来越倾向于选择１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类的依据。主要原因有下面几点： ２．１．１ｒＲＮＡ存在于所有生物中，在生物进化过程中其功能保持不变。１６ＳｒＲＮＡ基因普遍存在于原核生物中，在真核生物中其同源分子是１８ＳｒＲＮＡ。２．１．２１６ＳｒＲＮＡ最能反映细菌间的亲缘关系。在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列，又含 细菌鉴定和耐药性检测方法的发展文章编号：１６７２－３３８４（２００６）－０４－００３９－０６ 【作者】杨华为蒋迪王璨赵传赞高华方 生物芯片北京国家工程研究中心（北京１０２２０６） 【中图分类号】Ｒ９１５【文献标识码】Ｂ
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一．原理 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二．技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三．方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
菌种鉴定常见问题解答
菌种鉴定常见问题解答 1.菌种鉴定的方法和步骤是什么？ 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。 -----消息来源：百度问答 . 2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？ 如果你的菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。 -----消息来源：百度问答 3．为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大？ 答：我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法，即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增，中间不经过传代培养，因此不会引入新的污染，如果出现结果不一致的情况，一般有以下原因导致： 1、您提供的样品未经过三次分离纯化，含有其他杂菌； 2、您提供样品的真实情况确认如此。 建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。 4．为什么有时会出现PCR扩增不出的现象； 答：扩增不出的原因主要有以下几种： 1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌，或者是信息有误； 2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁； 3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。 对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。 5．PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象； 答：1、测序结果个别碱基出现N，是由细菌rDNA多态性造成，对菌种鉴定没有无影响； 2、所有测序反应均出现大面积套峰，是由于您提供的样品模版不纯造成的。这种情况需要重新纯化菌种。 6．PCR产物克隆测序为什么会出现结果分离的现象？ 答：我们以菌种为模版直接进行PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆测序，如果出现2种或以上的测序结果，说明您提供的模版不单一，即菌种不纯，含有其他杂菌，这种情况建议您将菌种重新进行三次以上纯化。 7．菌种鉴定可以鉴定到种吗？ 答：利用rRNA的保守区域进行鉴定只是菌种鉴定的一个分子生物学指标，通过鉴定结果可以了解未知菌株和NCBI公布序列的哪个种属比较接近。
菌种鉴定
?（1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 ?（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 ?（3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、 BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 ?（4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 ?（5）功能性分析及功能基因
ITS菌种鉴定方-法
利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔区（In ternally Tran scribed Spacer）的英文缩写,位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。其优点有：具有高拷贝数,整个序列的长度在600?800 bp,利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列，能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因（rDNA）在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个，这使得保守区域能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA小亚基单元（SSU）, 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元（LSU）组成，已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析，结合传统鉴定方法，对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定，并对鉴定结果和方法进行了比较分析。种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区I和U （分别为ITS I和ITS H）的片段大小上。ITS 区在核糖DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。其中ITS U区在种间变异性较高（22%），种内变异性较低（V 3%）。选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITS I区、5.8SrDNA 和ITS U 区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITS H区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。 ns r nsn